Forskolin प्रेरित आंतों में सूजन Organoids: एक
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Published 2/11/2017
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Medicine

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Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

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Abstract

Introduction

सीएफ सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) जीन है कि एक उपकला आयनों चैनल को कूटबद्ध में परिवर्तन के कारण होता है। सीएफ दुनिया भर में 1 लगभग 85,000 लोगों को प्रभावित करता है। 2,000 से अधिक CFTR म्यूटेशन पहचान की गई है ( www.genet.sickkids.on.ca )। यह विविधता आंशिक रूप से मनाया रोग phenotypes (की एक व्यापक स्पेक्ट्रम बताते www.CFTR2.org ) 2, 3। CFTR परिवर्तन के छह वर्गों CFTR प्रोटीन अभिव्यक्ति और समारोह पर उनके प्रभाव के आधार पर परिभाषित कर रहे हैं: (मैं) कोई संश्लेषण, (द्वितीय) बिगड़ा तस्करी, (तृतीय) दोषपूर्ण चैनल gating, (iv) बदल चालकता, (वि) कम सामान्य रूप से का स्तर CFTR कामकाज, और (vi) बिगड़ा कोशिका की सतह स्थिरता 4। हालांकि आम CFTR म्यूटेशन अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं, CFTR समारोह और नैदानिक ​​स्थिति के साथ संबंध poorl रहनेवाई, व्यक्ति के स्तर पर समझ में आ विशेष रूप से दुर्लभ "अनाथ" म्यूटेशन (के बड़े समूह के लिए www.CFTR2.org ) 1, 3।

हाल ही में, दवाओं विकसित किया गया है कि एक उत्परिवर्तन विशेष फैशन में CFTR प्रोटीन लक्ष्य। CFTR प्रोटीन को निशाना दवाओं के दो वर्गों नैदानिक ​​प्रयोग में है और कार्रवाई की अलग मोड है। ऐसे VX-770 के रूप में Potentiators, ऊर्ध्वस्थ होते हुए स्थानीय उत्परिवर्ती CFTR की खुली संभावना को बढ़ाने और कोशिकाओं 5 करने के लिए उनके अलावा पर सीधे काम करते हैं। ऐसे VX-809 के रूप में correctors, जालिका-स्थानीय misfolded CFTR की तस्करी को बहाल करने और प्रभाव पहले कोशिकाओं 6 मनाया जाता है के साथ पूर्व ऊष्मायन की आवश्यकता होती है। CFTR potentiator, वीएक्स-770, साथ ही आठ अन्य के लिए के रूप में G551D उत्परिवर्तन 7, 8 के साथ विषयों के लिए पंजीकृत किया गया है,CFTR म्यूटेशन gating, S1251N 9 सहित; साथ में, इन सभी म्यूटेशन सीएफ विषयों के 5% से किया जाता है। अन्य नैदानिक परीक्षण, संकेत दिया है कि VX-770, पढ़नेवाला VX-809 के साथ संयुक्त, फेफड़ों पर अभी तक महत्वपूर्ण प्रभाव सीमित है और विषयों में गहरा दरों में कमी के रोगियों के 10 में से 45-50% द्वारा किए F508del उत्परिवर्तन के लिए homozygous का कारण बनता है 11।

सीएफ रोगियों के शेष 50% के भीतर दवा संवेदनशील विषयों की पहचान करने के लिए परम्परागत क्लिनिकल परीक्षण महंगा है और समय लेने वाली हैं और अत्यंत दुर्लभ CFTR जीनोटाइप के साथ व्यक्तियों के लिए संभव नहीं है। उपन्यास, लागत प्रभावी, व्यक्तिगत तरीकों CFTR उत्परिवर्तन के किसी भी प्रकार को ले जाने के व्यक्तियों के लिए CFTR modulators की बढ़ती संख्या के मैच के लिए महत्वपूर्ण हैं। अब तक, विशिष्ट CFTR म्यूटेशन ले जाने के रोगी समूहों का परीक्षण शामिल किए जाने के ज में उत्परिवर्ती जीन CFTR अभिकर्मक का उपयोग अध्ययन द्वारा निर्देशित किया गया हैeterologous सेल प्रणाली, कक्षों 5, 6, 12 ussing में electrophysiological अध्ययन के द्वारा पीछा किया। पर्याप्त सीएफ पशु मॉडल, हवा तरल इंटरफेस-भेदभाव ब्रोन्कियल उपकला सीएफ फेफड़ों explant सामग्री से ली गई कोशिकाओं में दवा प्रभावकारिता अध्ययन की कमी के कारण दवा के विकास 13, 14, 15 के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, फेफड़ों explant ऊतकों और आक्रामक प्रक्रियाओं की सीमित उपलब्धता अंत मंच रोग के बिना विषयों से ब्रोन्कियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कम आम CFTR म्यूटेशन के विश्लेषण में बाधा और एक व्यक्तिगत फैशन में दवा परीक्षण को रोकने के। इन सीमाओं, ऐसे कोलोरेक्टल organoids, नाक airway कोशिकाओं, और airway कोशिकाओं प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न के रूप में "आसान पहुँच" ऊतकों, पर काबू पाने के लिए, वर्तमान में व्यक्तिगत दवा उपचार के लिए पता लगाया जा रहा है।

16, 17 के रूप में स्थापित किया। मानव पेट के / मलाशय के लिए, संस्कृति की स्थिति में परिभाषित शामिल वृद्धि कारक (उपकला ग्रोथ फैक्टर (EGF), Gastrin, wnt -3 ए, आर spondin 3 (Rspo3), और नोगिन) छोटे अणुओं (Nicotinamide, A83-01 के साथ संयुक्त, और SB202190) एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में। इन शर्तों के तहत, एकल स्टेम कोशिकाओं या छोटे ऊतक टुकड़े बंद कर दिया, पित्ताशय, 3 डी अपने बेसल बाहर की ओर उन्मुख ओर से अत्यधिक ध्रुवीकृत उपकला द्वारा गठित संरचनाओं में बाहर हो जाना। सभी प्रकार की कोशिकाओं को आम तौर पर अपने सामान्य अनुपात और स्थितियों में दिखाई देते हैं। Organoids साप्ताहिक यांत्रिक व्यवधान और फिर से चढ़ाना द्वारा लंबे समय अवधि में विस्तार किया जा सकता है। वे आनुवंशिक रूप से और phenotypically स्थिर रहे हैं और, संग्रहित किया जा सकता लंबी अवधि के विस्तार और जैव-बैंकिंग 17 इजाजत दी। वे करने के लिए उत्तरदायी हैंसभी मानक सेल जैविक / आनुवंशिक जोड़तोड़ और विश्लेषणात्मक तकनीकों 2 डी सेल लाइनों 18 के लिए विकसित की है।

हमने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि CFTR समारोह आसानी से एक forskolin प्रेरित सूजन (वित्तीय संस्थाओं) परख 19, 20 में कोलोरेक्टल organoids में मापा जा सकता है। जब forskolin (FSK) या, वैकल्पिक रूप से, हैजा विष को उजागर करने के लिए, organoids तेजी से, उनके चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) के स्तर में वृद्धि जो CFTR चैनल 19 के उद्घाटन में बारी परिणामों में। Organoids स्वस्थ व्यक्तियों से, या CFTR अवशिष्ट समारोह के साथ जुड़े म्यूटेशन, साथ विषयों से बाद में organoid लुमेन, स्रावी दस्त की इन विट्रो बराबर करने के लिए आयन और जल परिवहन का एक परिणाम के रूप में प्रफुल्लित होगा। कोलोरेक्टल organoids की वित्तीय संस्थाओं की प्रतिक्रिया के रूप में पहले से CFTR अशक्त व्यक्तियों से प्राप्त होता organoids ने संकेत दिया है, पूरी तरह CFTR निर्भर होना दिखाया गया था एकविशिष्ट औषधीय CFTR अवरोधकों 19 के उपयोग से एन डी। बड़े विषय विशेष डेटा सेट एक बायोप्सी लेने के बाद कई हफ्तों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है।

विस्तार में यहाँ वर्णित वित्तीय संस्थाओं परख के लिए, organoids गुदा बायोप्सी है कि किसी भी उम्र में और केवल सीमित असुविधा 21 के साथ प्राप्त किया जा सकता से सुसंस्कृत हैं। Organoids एकल तहखाने है कि आसानी से reseal और नए organoids फार्म में यांत्रिक व्यवधान द्वारा साप्ताहिक passaged हैं। वित्तीय संस्थाओं परख चलाने के लिए, ~ इन बाधित थोड़ा organoids के 30-80 एक 96 अच्छी तरह से थाली 19 के प्रत्येक कुएं में चढ़ाया जाता है। परख के दिन में organoids calcein हरे, एक फ्लोरोसेंट सेल पारगम्य डाई कि यह जीवित कोशिकाओं के भीतर बनाए रखा है, लाइव इमेजिंग की सुविधा के साथ दाग रहे हैं। फिर, FSK, जो intracellular शिविर उठाती है और इस तरह CFTR को सक्रिय करता है, आदेश organoid सूजन को प्रोत्साहित करने में जोड़ा जाता है। Potentiators कि शिखर CFTR पर कार्य एक साथ डब्ल्यू जुड़ जाते हैंforskolin ith, correctors कि CFTR की तस्करी बहाल जबकि FSK के अलावा पहले 24 घंटा जोड़ रहे हैं। organoid सूजन एक स्वचालित छवि विश्लेषण कि forskolin अलावा पर हर समय बिंदु के लिए सभी फ्लोरोसेंट वस्तुओं के कुल क्षेत्रफल में रिश्तेदार वृद्धि की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित है।

3 डी organoid सूजन कक्षों ussing में 2 डी सुसंस्कृत एयरवे कोशिकाओं में मौजूदा electrophysiological CFTR readouts से अधिक लाभ और नुकसान है। एक प्रमुख लाभ सूजन परख के throughput है। कोशिकाओं सुसंस्कृत और संस्कृति के माध्यम से एक ही प्रकार का उपयोग कर यत्न कर रहे हैं, और एक अनुभवी तकनीशियन एक साप्ताहिक आधार पर 25 organoid नमूनों को संस्कृति, जबकि 12 मरीज के नमूनों में प्रति सप्ताह लगभग 1,200 डेटा बिंदुओं बढ़ाता कर सकते हैं। हम पारंपरिक प्रति प्लेट डुप्लिकेट या तीन प्रतियों माप द्वारा एक एकल प्रायोगिक हालत टाइप करें और तीन स्वतंत्र ऊष्मायन समय बिंदुओं पर इस तरह के मापन दोहराएँ। कुल में, लगभग 300-500 रोंचिमनी organoid संरचनाओं तो प्रयोगात्मक हालत है, जो सीमित तकनीकी परिवर्तनशीलता के साथ CFTR समारोह की बहुत सटीक मापन करने के लिए सुराग के अनुसार मापा जाता है। इस सटीक हमें स्पष्ट रूप से CFTR modulators को अवशिष्ट समारोह और जवाब में मतभेद को परिभाषित करने की अनुमति देता है और हमें की अनुमति देता है आसानी से समान CFTR म्यूटेशन 19, 22, 23, 24, 25 को ले जाने के मरीजों के बीच आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रभाव लेने के लिए। डेटा की गुणवत्ता आसानी से माइक्रोस्कोप छवियों से मूल्यांकन किया जा सकता है। जबकि वित्तीय संस्थाओं को पूरी तरह से CFTR पर निर्भर है, यह CFTR समारोह के लिए एक अप्रत्यक्ष परिणाम उपाय है, तरल पदार्थ परिवहन के लिए आयन परिवहन के युग्मन की वजह से इसकी पढ़ने के लिए बाहर। इस ussing कक्षों में प्रत्यक्ष CFTR समारोह माप, जो transepithelial आयन धाराओं 26 को मापने के साथ विरोधाभासों। Ussing कक्षों शिखर या basolateral सी का चयन करें उत्तेजना की अनुमति देते हैंompartments (जो organoid परख की अनुमति नहीं है); basolateral झिल्ली permeabilizing द्वारा, शिखर CFTR निर्भर आयनों स्राव चुनिंदा 27 मापा जा सकता है।

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Protocol

यहाँ बताया मानव ऊतकों का उपयोग करते हुए सभी प्रयोगों यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर एम्सटर्डम में नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (UMCU; TcBio # 14-008)। ऊतक संग्रह, उत्पादन, भंडारण, और organoids के उपयोग के लिए सूचित सहमति Wilhelmina बच्चों के अस्पताल (WKZ) -UMCU में रोगियों से प्राप्त हुई थी।

उपकरण उपभोज्य उपकरण
पर्णदलीय प्रवाह शिरोवेष्टन 15 और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों जीस एल एस एम 800 - ज़ेन 2 (ब्लू संस्करण) छवियों को मापने के लिए सॉफ्टवेयर
सीओ 2 इनक्यूबेटर microfuge ट्यूबों माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल कार्यक्रम
सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप (प्रकाश / ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप) 0.22 माइक्रोन फिल्टर
अपकेंद्रित्र सीरम वैज्ञानिक pipettes
रोलिंग शेखर Micropipette फिल्टर सुझावों
4 डिग्री सेल्सियस कमरे या इनक्यूबेटर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज cryovials
CoolCell सेल कंटेनर बर्फ़ीली
सीरम वैज्ञानिक pipettor
Micropippette (1000, 200 और 20 μl)
Viaflo दोहराएँ पिपेट
(लाइव सेल) confocal खुर्दबीन
कंप्यूटर
तरल नाइट्रोजन टैंक
मल्टीचैनल (200 μl)

1. संस्कृति के लिए तैयारी अभिकर्मकों

  1. बेसल मध्यम तैयारी
    नोट: बेसल मध्यम (बीएम) हाम पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (विज्ञापन डीएफ) 4- (2-hydroxyethil) के साथ पूरक -1piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), glutamine, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उन्नत Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम करने के लिए संदर्भित (पेन / Strep)।
    1. एक 500 मिलीलीटर विज्ञापन-DF मध्यम बोतल में 200 मिमी glutamine के 5 मिलीलीटर, 1 एम HEPES के 5 मिलीलीटर, और कलम / स्ट्रेप समाधान के 5 मिलीलीटर (10,000 यू / एमएल, 10000 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें।
    2. कम से कम 4 हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में स्टोर बी.एम.।
  2. Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम तैयारी
    नोट: Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम बना है घर में usinजी सेल लाइन निर्माता के निर्देशों के अनुसार एल Wnt -3 ए।
    1. Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम कटाई के लिए, मध्यम एक सप्ताह के लिए कोशिकाओं के संपर्क में इकट्ठा करने और 450 XG पर 5 मिनट के लिए इसे नीचे स्पिन अस्थायी कोशिकाओं को हटाने के लिए।
    2. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम फिल्टर और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 40 मिलीलीटर aliquots में विभाजित। गतिविधि में एक बिना किसी नुकसान के कम से कम 4 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।
    3. एक टॉप / बांका परख में Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम की गतिविधि का परीक्षण मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) का उपयोग -293 कोशिकाओं टॉप- और बांका-luciferase और TK- Renilla साथ ट्रांसफ़ेक्ट और एक Renilla के साथ मापा के अनुसार परख किट -luciferase निर्माता के निर्देशों।
      नोट: टॉप-luciferase एक संवाददाता प्लाज्मिड कि जंगली प्रकार खरब घन फुट बाध्यकारी क्षेत्रों में शामिल है। अगर Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम से सक्रिय है, विहित WNT सिगनल सक्रिय है। बीटा-catenin नाभिक बुद्धि संबद्ध करने में translocatesज खरब घन फुट / LEF प्रतिलेखन कारक और luciferase संवाददाता के प्रतिलेखन को सक्रिय करता है, रिश्तेदार luciferase गतिविधि में वृद्धि उत्प्रेरण जब सब्सट्रेट जोड़ा जाता है। बांका-luciferase क्योंकि खरब घन फुट luciferase जीन के अपस्ट्रीम बाध्यकारी क्षेत्रों उत्परिवर्तित कर रहे हैं एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  3. पेट के माध्यम तैयारी
    ध्यान दें: तैयार है और सभी विकास कारकों और अभिकर्मकों निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार पतला। छोटे आकार aliquots एक से बचने के फ्रीज पिघलना चक्र का प्रयोग करें। कार्यात्मक वृद्धि कारकों के परिणामों के लिए आवश्यक हैं।
    1. 1x B27, 1.25 मिमी एन एसिटाइलसिस्टीन, 50 एनजी / एमएल hEGF, 5 एनएम गैस्ट्रिन, 10 मिमी निकोटिनामाइड, 300 एनजी / एमएल hRspo3, 100 एनजी / एमएल hNoggin, 500 माइक्रोन A83-01 साथ बी.एम. सप्लीमेंट से पेट के मध्यम (मुख्यमंत्री) तैयार 10 माइक्रोन के SB202190, और 100 माइक्रोग्राम / प्राथमिक कोशिकाओं के लिए एक रोगाणुरोधी की मिलीलीटर।
    2. aliquots में मुख्यमंत्री फूट डालो और अप करने के लिए 4 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रोक। aliquots गला लें पूर्ण पेट के तैयार करने के लिएमध्यम (FCM) 50% जोड़कर मुख्यमंत्री के Wnt -3 ए-conditoned माध्यम। 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए स्टोर FCM गतिविधियों में बिना किसी नुकसान के।
    3. गुदा बायोप्सी से एक organoid संस्कृति की स्थापना के लिए, 50 माइक्रोग्राम / एमएल vancomycin, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin साथ FCM के पूरक है, और 10 माइक्रोन के रो-जुड़े कुंडलित-कुंडल के गठन प्रोटीन सेरीन / threonine kinase अवरोध (RhoKi)। केवल संस्कृति में पहले दो से तीन दिनों के लिए इस माध्यम का, अलगाव मध्यम (आईएम) कहा जाता है का उपयोग करें।
  4. EDTA स्टॉक समाधान तैयारी
    1. Ultrapure एच 2 हे, एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ निष्फल में, 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 8 पीएच तैयार करें।
  5. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का हेरफेर
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (BMM) निर्माता की सिफारिश के अनुसार तैयार करें।
    2. रात भर बर्फ पर पिघलना BMM।
    3. जब एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, उपयोग करने के लिए बोतल से BMM स्थानांतरितएक 5 मिलीलीटर पिपेट और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा।
    4. एक बार thawed, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में BMM की दुकान है और उपयोग करने से पहले कम से कम 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
      नोट: क्रम में सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, BMM ठंड और ठीक से तहखाने या organoids embedding से पहले मिलाया जाना चाहिए।

2. एक CF रोगी बायोप्सी से आंतों Organoids की स्थापना

नोट: ऊतक संग्रह के बाद, यह खारा में बर्फ पर नमूना बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, सीए 2 और 2 मिलीग्राम + (DPBS), या बी.एम. बिना Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा। बायोप्सी के तेजी से प्रसंस्करण की सिफारिश की है, लेकिन यह अप करने के लिए 7 दिनों के लिए बर्फ पर संग्रहीत बायोप्सी से organoid संस्कृतियों की स्थापना के लिए संभव साबित कर दी है।

  1. बायोप्सी एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे बसा है और सतह पर तैरनेवाला दूर करते हैं।
  2. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग बायोप्सी और पिपेट ऊपर और नीचे करने के लिए DPBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें 10-20 बार।
    नोट: पिपेट बायोप्सी pipetting से पहले बी.एम. के साथ पहले से गीला करने की जरूरत है।
  3. बायोप्सी तल पर बसा है और सतह पर तैरनेवाला दूर करते हैं।
  4. दोहराएँ 2.2 और 2.3 4-5 बार दोहराएँ जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है।
  5. DBPS के 10 मिलीग्राम और 200 μl EDTA (0.5 एम) बायोप्सी में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60-120 मिनट के लिए एक कमाल की ट्यूब मंच पर ट्यूब जगह।
    नोट: ऊष्मायन समय रोगी के प्रति भिन्न हो सकती है। तहखाने जारी कर रहे हैं, तो DPBS बादल बन जाता है। जब तहखाने एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है EDTA ऊष्मायन को अंतिम रूप दिया जा सकता है।
  6. तहखाने व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. अप बी.एम. के 2 मिलीलीटर ले लो और एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। इस तरह है कि अंदर बी.एम. के साथ कवर किया जाता है में स्वयं इस नई ट्यूब हिला।
  8. एक विंदुक का प्रयोग बी.एम. के साथ पहले से गीला, 10-20 बार बायोप्सी और पिपेट युक्त ऊपर और नीचे ट्यूब के लिए DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. बायोप्सी बसा है और नया करने के लिए तहखाने के साथ DPBS हस्तांतरण करने की अनुमति देंट्यूब बी.एम. के 2 मिलीलीटर उस कदम 2.7 में तैयार किया गया था युक्त।
  10. दोहराएँ 2.8 और 2.9 कदम जब तक कोई और तहखाने जारी कर रहे हैं।
  11. तहखाने 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 130 XG पर स्पिन।
  12. इस बीच में, कमरे के तापमान पर सुरक्षा कैबिनेट (आरटी) को आईएम हस्तांतरण।
  13. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तहखाना गोली और दोहराने कदम 2.11 को बी.एम. के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  14. बी.एम. के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend। 5-10 μl ले लो और एक खुर्दबीन के नीचे आंखों से तहखाने की संख्या गिनती।
  15. तहखाने 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 130 XG पर स्पिन।
  16. तैरनेवाला निकालें और 55% BMM (v आईएम वी BMM) में गोली resuspend।
    नोट: तहखाने μl प्रति 1 तहखाना में 55% BMM की समान मात्रा में resuspended हैं। यदि वहाँ पर्याप्त तहखाने नहीं कर रहे हैं, BMM की न्यूनतम मात्रा 40 μl है।
  17. बोने के लिए, पिपेट अच्छी तरह से प्रति 35 μl (24 अच्छी तरह से थाली में)। 3-5 में BMM के 35 μl फूट डालो Gro के प्रसार में सुधार के लिए अलग से बूँदेंBMM में कारकों wth। बुलबुले नहीं बना है।
  18. जगह और BMM जमना के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा इनक्यूबेटर में नीचे की थाली छोड़ दें।
  19. अच्छी तरह से प्रति आईएम के 500 μl जोड़ें और इनक्यूबेटर में यह 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए और 5% सीओ 2।
  20. मध्यम रिफ्रेश करें हर 2-3 दिनों के लिए। एक P1000 विंदुक के साथ बाहर pipetting छोड़ने BMM बरकरार बूंदों से पुराने मध्यम निकालें। ध्यान से अच्छी तरह के पक्ष में यह pipetting, नहीं सीधे पर BMM बूंदों से FCM जोड़ें।
    नोट: कोई तहखाने अलगाव प्रोटोकॉल में जारी कर रहे हैं, तो तैरनेवाला अपकेंद्रित्र गोली बी.एम. के साथ 2-3 बार धोने, और BMM में यह resuspend। बचे हुए ऊतक ले लो और यह एक रेजर के साथ छोटे टुकड़ों में काट लें। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इन लीजिए, उन्हें अपकेंद्रित्र, और उन्हें एक ही BMM में resuspend। किसी भी उपकला स्टेम सेल मौजूद हैं, तो ये भी organoids उत्पन्न होगा।

3. रखरखाव, ठंड, और पेट के लिए Organoids की Passagingskolin प्रेरित सूजन परख (वित्तीय संस्थाओं)

नोट: हर organoid संस्कृति अपनी दोहरीकरण का समय दिया है। आम तौर पर, कोलोरेक्टल सीएफ organoids 1 का विस्तार किया जा सकता है: 3-1: 5 बार हर 7-10 दिनों के लिए। नवोदित संरचनाओं मनाया जाता है, तो यह एक अच्छा संकेत है। कोलोरेक्टल सामान्य organoids (चित्रा 2 डी) से - कोलोरेक्टल सीएफ organoids कम पित्ताशय (-2 2A चित्रा) कर रहे हैं। स्थापना और रखरखाव के लिए, organoids 24 अच्छी तरह प्लेटें में संवर्धित कर रहे हैं; ठंड के लिए, 6 अच्छी तरह प्लेटों में; और वित्तीय संस्थाओं परख 96 अच्छी तरह से pates में, के लिए।

  1. Organoids की Passaging
    1. यह प्रयोग करने से पहले कम से कम 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर BMM रखें।
    2. यह प्रयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर FCM रखें।
    3. नमूना नाम और रूप में एक और ट्यूब के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लेबल "धोया।"
    4. ध्यान से परेशान BMM बूँदें बिना एक P1000 पिपेट का उपयोग कुओं से मध्यम aspirate।
    5. 1 में अच्छी तरह से और बी बी एम के 1 मिलीलीटर जोड़ेंअप reak BMM एक P1000 पिपेट का उपयोग करके चला जाता है। नमूना नाम के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में यह 1 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    6. बी.एम. की एक और 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो लें और एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
    7. दोहराएँ 3.1.5 और 3.1.6 कदम 5 और अधिक कुओं (24 अच्छी तरह से थाली के 6 कुओं एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में धोया जाएगा करने के लिए) के साथ।
    8. बी.एम. के साथ 12 मिलीलीटर ट्यूब भरें। पिपेट और एक पूर्व गीला 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर नीचे।
    9. 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 85 XG पर स्पिन।
    10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली बी.एम. के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक ही P1000 विंदुक टिप के साथ, एक फिल्टर के बिना एक P10 टिप ले, और नीचे में 20 बार विंदुक ऊपर और। दोनों P1000 और P10 सुझाव दिए त्यागें।
    11. एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ बी.एम. के 4 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब एक तरफ खड़ी से लगभग 70 डिग्री पर झुका हुआ पकड़ो। एक नए P1000 टिप पूर्व गीला और P1000 (1 मिलीलीटर मात्रा) के साथ सख्ती 2-3 बार मिश्रण।
    12. 10 से गिनती झुका स्थिति में जबकि शेष, w ध्यान ऊपरवाला परत लीजिएP1000 पिपेट, और ट्यूब के रूप में चिह्नित में हस्तांतरण 4 एक्स 1 मिलीलीटर ith "धोया।"
    13. organoids झुका ट्यूब में नीचे करने के लिए बसने का निरीक्षण करें; undisrupted organoids और बड़ा हिस्सा नीचे डूब जाएगी। अपकेंद्रित्र 15 मिलीलीटर 85 XG और 8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूब "" धोया।
    14. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 55% BMM के अंतिम एकाग्रता के लिए organoid गोली मध्यम और BMM के लिए आवश्यक राशि जोड़ें। बुलबुले (चित्रा 3 बी) बनाने के बिना ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
      नोट: एक अच्छा घनत्व BMM के 10 μl में 25-30 organoids बोने से हासिल की है।
    15. का पालन 2.17-2.19 कदम।
  2. ठंड के लिए passaging
    1. उपयोग करने से पहले कम से कम 30-60 मिनट के लिए बर्फ में बी.एम. रखें। उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर FCM रखें।
    2. RhoKi (चरण 1.3.3) के साथ पूरक FCM तैयार करें।
    3. रेफ्रिजरेटर से trypsin ले लो और उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
    4. चरणों का पालन करें 3.1.5-3.1.10।
    5. जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला निकालें, 30 सेकंड के लिए trypsin के 4 मिलीलीटर, और भंवर जोड़ें।
    6. ट्यूब एक गर्म पानी से स्नान में 30 सेकंड के लिए सख्ती 1 मिनट और भंवर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखो।
    7. ट्यूब में समाधान का निरीक्षण किया। बरकरार organoids खुर्दबीन के नीचे अभी भी दिखाई दे रहे हैं, तो कदम 3.2.7 दोहराएँ।
    8. जब organoids बाधित कर रहे हैं, trypsin और पिपेट 10 बार बेअसर करने के लिए बी.एम. के 8 मिलीलीटर जोड़ें।
    9. 8 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG पर 3 मिनट के लिए स्पिन।
    10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और organoids के लिए मध्यम और BMM के लिए आवश्यक राशि को जोड़ने के लिए एक 55% BMM समाधान तक पहुँचने के लिए। बुलबुले बनाने के बिना और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
      नोट: trypsinization के बाद: 1 के अनुपात ठंड के लिए, organoids एक 1 में वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए।
    11. बीज एक पूर्व गर्म 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की एक भी कुएं में 250 μl, ~ 10 μl के छोटे, अलग बूंदों का निर्माण किया। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट की जगह उल्टा और छोड़BMM 20-30 मिनट के लिए जमना।
    12. अच्छी तरह से प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली में ताजा FCM + RhoKi के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें और इनक्यूबेटर (चित्रा 3 सी) के लिए थाली हस्तांतरण।
  3. वित्तीय संस्थाओं परख के लिए Organoids passaging
    नोट: नंबर और organoids के आकार, 24 अच्छी तरह से थाली की 4 और 6 कुओं के बीच के आधार पर एक 96 अच्छी तरह से थाली के 27 कुओं बोने के लिए पर्याप्त हैं।
    1. कदम 3.1-3.1.13 से वर्णित के रूप में organoids प्रक्रिया।
    2. 50% BMM के 120 μl में गोली Resuspend।
    3. खुर्दबीन के नीचे एक 3 μl BMM बूंद में organoids की संख्या (30-50) की पुष्टि करें।
    4. प्लेट एक 96 अच्छी तरह से खोपड़ी के प्रत्येक कुएं के बीच में रखा 3 μl की एक बूंद का उपयोग कर organoids।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली BMM जमना के लिए 15 मिनट के लिए रखें; आगे कदम कदम 6.1.1 में वर्णित हैं।

4. बर्फ़ीली आंतों सीएफ Organoids

नोट: अंगOIDs 1-2 दिनों trypsinization और संवर्धन के बाद नीचे जमे हुए किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं, इसलिए organoids अभी भी छोटी सी है, जो विगलन के बाद जीवित रहने की क्षमता बढ़ जाती होगी।

  1. बी.एम. के 1 मिलीलीटर जोड़ें और BMM एक P1000 पिपेट का उपयोग बूँदें टूट गया। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण।
  2. वही 15 मिलीलीटर ट्यूब बी.एम. और हस्तांतरण के एक और 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो लें।
  3. दोहराएँ 4.1 और 4.2 सभी कुओं के साथ कदम।
    नोट: अतिरिक्त BMM बचने के लिए, 6 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जमा कर रहे हैं।
  4. अप और एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ नीचे पिपेट ठंड बी.एम. के 12 मिलीग्राम और साथ organoids युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब भरें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें।
  5. 450 XG पर 3 मिनट और 8 डिग्री सेल्सियस के लिए स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. ठंड मध्यम और पिपेट ऊपर और नीचे ठीक से organoids resuspend के साथ organoids की गोली भंग।
    नोट: ठंड माध्यम के 500 μl BMM में से प्रत्येक के 100 μl के लिए प्रयोग किया जाता है।
  7. एक 5 मिलीलीटर pipet का प्रयोग, हस्तांतरण के 0.5 मिलीलीटरठंड मध्यम में resuspended organoids क्रायोजेनिक शीशियों बाँझ।
  8. एक सेल ठंड कंटेनर को शीशियों स्थानांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर डाल दिया।
  9. 24 घंटे के बाद, तरल नाइट्रोजन में भंडारण के लिए शीशियों हस्तांतरण।

5. जमे हुए Organoids से संस्कृतियों की स्थापना

नोट: बर्फ पर BMM गला लें और बर्फ पर रहते हैं। बी.एम. तक पहुंचने आरटी, और विगलन एक cryovial की प्रक्रिया शुरू करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 10 मिलीलीटर विभाज्य गर्म करते हैं।

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में आंदोलन द्वारा तेजी से शीशी पिघलना वहाँ अभी भी एक छोटे से जमे हुए सामग्री है जब तक।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार एक P1000 पिपेट का उपयोग ट्यूब के लिए thawed organoids स्थानांतरण।
  3. इसके तत्काल बाद, जबकि ट्यूब के नीचे मिलाते ड्रॉप द्वारा गर्म बी.एम. बूंद के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक बार के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ा जाता है, एक बार कुछ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान से मिश्रण ठंड मध्यम कमजोर करने के लिए।
  4. धीरे धीरे (ड्रॉप द्वारा ड्रॉप) शंक्वाकार ट्यूब conta करने के लिए गर्म बी.एम. के 9 मिलीलीटर जोड़नेorganoids ining। एक बार कुछ पलटना।
  5. 85 XG और 8 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन स्पिन।
  6. गोली परेशान बिना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। FCM के 90 μl RhoKi (कदम 1.3.3) के साथ पूरक में organoid Resuspend। फिर, BMM के 110 μl जोड़ें।
  7. एक पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 35 μl जोड़ें, छोटे, अलग बूंदों कर रही है।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर थाली हस्तांतरण, थाली उल्टा 20-30 मिनट के लिए नीचे जा रही है।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से RhoKi साथ FCM के 500 μl जोड़ें और प्लेट वापस इनक्यूबेटर (चित्रा -4 ए - 4C) के लिए स्थानांतरण।
  10. एक बार जब organoids विगलन से ठीक से बरामद किया है, और अधिक BMM में पतला इसलिए BMM में से प्रत्येक के 10 μl 25-30 organoids में शामिल है। यह प्रक्रिया 2-3 दिनों विगलन (चित्रा 4D - 4 जी) के बाद किया जा सकता है और organoid के समुचित विकास सुनिश्चित करता है।

6. Forskolin प्रेरित सूजन के रूप मेंकहना (वित्तीय संस्थाओं)

नोट: FSK अनुमापन CFTR अवशिष्ट समारोह की माप के लिए अनुमति देता है। CFTR मॉडुलन के लिए, organoids एक दिया पढ़नेवाला (जैसे, vx-809) और / या potentiator को उजागर कर रहे हैं (जैसे, vx-770), जीनोटाइप के आधार पर। आमतौर पर, vx-809, माप से पहले 18-24 घंटे के लिए जोड़ा गया है, जबकि VX-770 और FSK सही माप शुरू करने से पहले जोड़ रहे हैं। ध्यान रखें कि कुछ modulators (correctors / potentiators) परख थाली के प्लास्टिक सतह के लिए बाध्य कर सकते हो।

  1. परख के लिए चढ़ाना
    नोट: VX-809 शेयरों में 20 मिमी पर aliquoted और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। जब विगलन, आरटी पर छोड़ दो और प्रकाश से बचाने के।
    1. धारा 3.3 में वर्णित के रूप में organoids प्रक्रिया।
    2. 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, और 30 माइक्रोन के: VX-809 पढ़नेवाला का परीक्षण करते हैं, तो निम्न सांद्रता के साथ triplicates में एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र तैयार करते हैं। FCM में dilutions तैयार करें।
    3. 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए, या तो 100 μ जोड़ने; FCM के संबंधित VX-809 एकाग्रता या 100 μl के साथ FCM के एल केवल और प्लेट सेते हैं।
  2. मापने परख
    नोट: VX-770 शेयरों में 20 मिमी पर aliquoted रहे हैं, जबकि FSK 10 मिमी में है; दोनों -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। जब विगलन, कमरे के तापमान पर छोड़ दें और प्रकाश से बचाने के लिए।
    1. calcein और DMSO की एक शीशी ले लो और 15 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
    2. शीशी जहां calcein यदि बंद, एक पाउडर के रूप में प्रदान की जाती है के लिए DMSO के 5.1 μl जोड़ें। अन्यथा, एक पहले से ही resuspended calcein calcein के 2.5 μl युक्त शीशी का उपयोग करें।
    3. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में बीएम के 580 μl को calcein के 2.5 μl जोड़ें और यह लेबल।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से एक दोहराने पिपेट का उपयोग करने के लिए इस डाई समाधान (बी एम + calcein) के 10 μl जोड़ें।
    5. यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाई अच्छी तरह मिलाया जाता है एक मल्टीचैनल के साथ एक बार Resuspend।
    6. 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
    7. calcein ऊष्मायन के दौरान, FSK की तैयारी शुरूऔर वीएक्स-770 समाधान, अगर जरूरत।
    8. 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, और 30 माइक्रोन के: एक VX-770 potentiator का उपयोग करते हुए, तो निम्न सांद्रता के साथ तीन प्रतियों में एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र तैयार करते हैं। एक FSK अनुमापन के मामले में, सांद्रता हैं: 0, 0.008, 0.02, 0.05, 0.12, 0.32, 0.8, 2.0, और 5.0 माइक्रोन। बी.एम. में dilutions तैयार करें।
      नोट: FSK, वीएक्स-770, या किसी अन्य दवा दूसरे दिन जोड़ा के लिए, dilutions 2x अंतिम एकाग्रता में, तैयार रहना चाहिए / दवा अनुमापन समाधान अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ दिया जाएगा FSK के 100 μl है, जो पहले से ही 100 μl शामिल के बाद से FCM की।
    9. माइक्रोस्कोप के कमरे में FSK और वीएक्स-770 समाधान, एक P200 पिपेट, और सुझावों के स्थानांतरण।
    10. इमेजिंग वित्तीय संस्थाओं परख के लिए, एक जीवित कोशिका इमेजिंग confocal एक स्वचालित मंच, एक गर्म चैम्बर, और सीओ 2 के प्रवाह के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: निम्न चरणों का एक विशिष्ट माइक्रोस्कोप को देखें। अलग setups निम्न अन्य सूक्ष्मदर्शी करने के लिए आवेदन करना चाहिए निर्मातानिर्देश।
    11. प्लेट धारक में 96 अच्छी तरह से थाली रखो।
    12. इमेजिंग के लिए confocal सेटिंग्स दर्ज करें।
      1. 37 डिग्री सेल्सियस तक रहते इमेजिंग उपकरण पूर्व निर्धारित और 5% सीओ 2 और माप से पहले 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए चैम्बर पूर्व सेते करते हैं।
      2. एलेक्सा स्त्राव-488 ट्रैक का चयन करने के लिए "स्मार्ट सेटअप" विकल्प का उपयोग करें।
      3. बाहर ज़ूम और पूरे अच्छी तरह से कब्जा करने के लिए 0.6X को 5X लेंस और स्कैन क्षेत्र सेट करें।
      4. पृष्ठभूमि पर calcein-हरी लेबल organoids का इष्टतम का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए लेजर शक्ति और डिटेक्टर संवेदनशीलता को अपनाना। पिनहोल 130 माइक्रोन तक बढ़ाया जा सकता है और छवि औसतन 2 पर सेट किया जा सकता है।
      5. 8 बिट गहराई और 512 x 512 फ्रेम का आकार निर्धारित करें।
      6. माप समय, आवृत्ति, और अंतराल सेट करने के लिए समय की श्रृंखला विकल्प का उपयोग करें।
        नोट: नियमित माप के लिए सुझाव: के साथ 10 मिनट के अंतराल 1 घंटा: चक्र = 7 (साइकिल 1 = 0 टी) है। कम सूजन, संगठनों की माप के लिएnoids 3 घंटा तक के लिए imaged किया जा सकता है।
      7. टाइल विकल्प का उपयोग करें मैन्युअल रूप से अलग-अलग पदों पर अच्छी तरह से निर्धारित करने के लिए।
    13. माप के रूप में एक ही आदेश के बाद इसी कुओं को FSK और / या VX-770 के समाधान के 100 μl जोड़ें। अच्छी तरह से imaged पहली में समाधान जोड़ने शुरू और इमेजिंग के आदेश के साथ जारी है।
    14. माप की शुरुआत करें।
    15. बाद प्रयोग समाप्त हो गया है, फ़ाइल सहेजें।
  3. वित्तीय संस्थाओं परख डेटा का विश्लेषण
    1. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि सभी संरचनाओं एलेक्सा-488 ट्रैक के माध्यम से imaged पहचानता है और पहचान संरचनाओं भरता पर कुल organoid क्षेत्र की वृद्धि की गणना करने के लिए विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर वित्तीय संस्थाओं परख के डेटा विश्लेषण के लिए एक "organoid विश्लेषण" मैक्रो बनाएं अलग अलग समय बिंदुओं।
    2. छवि विश्लेषण कार्यक्रम में अधिग्रहण कर लिया छवियों के साथ डेटा फ़ाइल खोलें।
    3. organoid विश्लेषण के लिए मैक्रो का चयन करें।
    4. <li> अच्छी तरह से समय बिंदु 1 में से एक में संकेत करने वाली शोर अनुपात को संतुलित और सुनिश्चित करें कि सभी organoid संरचनाओं मान्यता प्राप्त है और भर रहे हैं करने के लिए सीमा निर्धारित करें।
      1. 4-6 कुओं में जाँच करें अगर सभी संरचनाओं भी समय बिंदु 7. पर पहचाने जाते हैं थोड़ा सुनिश्चित करने के लिए कि समय बिंदु 7 बजे पृष्ठभूमि संकेतों संरचनाओं के रूप में मान्यता प्राप्त नहीं हैं (विशिष्ट सीमा प्रयोगों के बीच कुछ हद तक बदल सकते हैं) सीमा को संशोधित देखने के लिए।
    5. 1,000 माइक्रोन से 2 मान्यता प्राप्त वस्तुओं के न्यूनतम क्षेत्र आकार के मापदंड निर्धारित करें।
    6. प्रेस शुरू करने के लिए "विश्लेषण"। विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर निर्भर करता है, लगभग 3 मिनट लगते हैं।
    7. अच्छी तरह से संख्या (तालिका इस क्रम में वृद्धि करनी चाहिए), समय अंक, और कुल क्षेत्रफल के प्रति अच्छी तरह से: जब सॉफ्टवेयर समाप्त हो गया है, "तालिका बनाने के लिए" और निम्न डेटा का चयन करने के लिए जाना।
    8. एक .xlm रूप में फ़ाइल सहेजें एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम को निर्यात करने के लिए।
    9. इस कार्यक्रम में, wel के प्रति क्षेत्र में रिश्तेदार वृद्धि की गणना100% पर समय बिंदु 1 के क्षेत्र की स्थापना द्वारा एल। वक्र (नीलामी) समय अंक 1-7 हालत प्रति तहत क्षेत्र की गणना; क्षेत्र (वाई-मूल्य) की निचली सीमा 100% पर सेट किया जाता है। FSK या दवा अनुमापन (एक्स अक्ष) नीलामी (शाफ़्ट) के खिलाफ साजिश रची है।

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Representative Results

चित्रा 1 ए BMM पर एम्बेडेड तहखाने के एक प्रतिनिधि ताजा अलगाव से पता चलता है। तहखाने एक CF विषय का एक कोलोरेक्टल बायोप्सी से हैं। आमतौर पर, एक organoid प्रत्येक तहखाना (- सी चित्रा 1 ए) से उत्पन्न होता है। CFTR की शिथिलता के कारण, पेट के सीएफ organoids के सबसे सिस्टिक नहीं हैं, बल्कि कॉम्पैक्ट और अनुमानों और buddings (2A चित्रा - 2 बी) के साथ कर रहे हैं। हालांकि, कुछ सीएफ संस्कृतियों organoid, विशेष रूप से उच्च अवशिष्ट समारोह के साथ, एक पित्ताशय आकार (चित्रा -2), जंगली प्रकार organoid संस्कृतियों की तरह (चित्रा 2 डी) के साथ कुछ organoids है।

संस्कृति के विस्तार या एक वित्तीय संस्थाओं परख बोने के लिए organoids passaging से पहले, कि organoids, कई buddings के साथ एक बड़े आकार के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया महत्वपूर्ण है। organoids छोटे और एन के बिना कर रहे हैंumerous buddings जब passaging के लिए कार्रवाई, organoid संस्कृति नकारात्मक रूप से प्रभावित कर रहा है। गुणवत्ता और EGF, wnt -3 ए, और Rspo3 की तरह आवश्यक वृद्धि कारकों की गतिविधि पर निर्भर करता है, organoids 7 और 12 दिन (चित्रा 3) के बीच वांछित आकार तक पहुँचने। यांत्रिक विघटन के बाद, buddings बाधित और पारित होने के बाद (चित्रा 3 बी) में नए organoids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। ठंड के लिए organoids प्रसंस्करण हैं, तो यह महत्वपूर्ण है कि वे, चित्रा -3 सी में प्रतिनिधित्व के रूप में एक छोटे आकार के trypsinized रहे हैं। trypsinization के बाद, organoids के क्रम में उन्हें हेरफेर के तनाव से उबरने में जाने के लिए 1 या 2 दिन के लिए चढ़ाया जाता है। यह कदम एक साथ organoids के छोटे आकार के साथ, विगलन (चित्रा -4 ए) के बाद एक 98% सेल वसूली सुनिश्चित करता है।

जब organoids thawed रहे हैं, यह उन्हें उच्च घनत्व में करने के लिए महत्वपूर्ण है, तो आम तौर पर, वे एक में thawed हैंछोटी मात्रा (Figure4A)। , Organoids BMM के 10 μl प्रति 20-30 organoids के अनुपात में पतला कर रहे हैं, सही घनत्व प्रदान - संस्कृति में एक या दो दिनों के बाद, और कहा कि organoids आकार (4C चित्रा 4 बी के साथ चित्रा -4 ए की तुलना) में वृद्धि के बाद एक बड़े आकार के रूप में विकसित करने के लिए। organoids भी पतला कर रहे हैं, वे विकास धीमा कर सकते हैं और यहां तक ​​कि अलग और मर सकते हैं। organoids बहुत भीड़ कर रहे हैं, जगह की कमी या वृद्धि कारकों की कमी भी organoids के विकास को धीमा कर देती है और buddings की संख्या कम कर देता है।

सीमित सेलुलर मलबे के साथ व्यवहार्य संस्कृतियों से organoids के चढ़ाना प्रदान की स्थितियों में organoids की> 95% FSK उत्तेजना पर फूल, में परिणाम चाहिए पर्याप्त CFTR समारोह में मौजूद है कि (चित्रा 5 ए - 5 ब)। एक genotype- और नशीली दवाओं पर निर्भर फैशन में प्रफुल्लित Organoids, के रूप मेंदो F508del alleles (चित्रा 5 ए) और organoids यौगिक-विषमयुग्मजी F508del और S1251N (चित्रा 5 ब) के लिए, एक CFTR gating कुछ अवशिष्ट समारोह के साथ जुड़े उत्परिवर्तन के साथ organoids की छवियों प्रतिनिधि से यह साफ।

सूजन quantitate करने के लिए, कुल calcein-हरे रंग की सतह क्षेत्रों हर समय बिंदु के लिए चुने गए हैं और टी = 0 के प्रतिशत के रूप में व्यक्त (100% पर सेट, चित्रा 6A)। मलबे और छोटे, गैर सूजन संरचनाओं आमतौर पर नीचे कुल सतह क्षेत्र के 5% कर रहे हैं। रिश्तेदार क्षेत्र को बढ़ाने के प्रति 10 मिनट के समय के अंतराल में व्यक्त किया है, और नीलामी (मनमाना इकाइयों) माप हर हालत (टी = 0 से 60 मिनट, आधारभूत सीमा 100% पर सेट, चित्रा 6B) के लिए उत्पन्न कर रहे हैं। हमने पाया था नीलामी, सबसे मजबूत होना करने के लिए के रूप में यह सूजन की दीक्षा में कुछ बदलाव के साथ-साथ उच्च CFTR समारोह स्तरों पर FSK के 30-40 मिनट से परे एक वक्रीय रिश्ते को शामिल किया गया।

चित्रा 6C)। CFTR अवशिष्ट समारोह के साथ जुड़े Organoids CFTR modulators (पूर्व FSK की स्थिति के 200-220% सतह क्षेत्र) के अभाव में 5 सुक्ष्ममापी FSK उत्तेजना के 60 मिनट के बाद 4,500 नीलामी यूनिट तक पहुँच सकते हैं। Organoid सूजन ~ 4,500 नीलामी इकाइयों, शायद organoid संरचनाओं, basolateral आयन परिवहन की दर सीमित प्रभाव की भौतिक सीमाओं के कारण पर एक छत, और तहत "बढ़ाकर" की स्थिति ion- और तरल पदार्थ परिवहन homeostasis की स्थापना के लिए पहुंचता है। FSK आगे इन उच्च CFTR अवशिष्ट समारोह स्तरों पर परख के गतिशील रेंज का विस्तार करने के लिए बेहतर अवशिष्ट समारोह या अत्यधिक प्रभावी quantitate को titrated किया जा सकता यौगिक उपचार (जैसे, के रूप में कम FSK सांद्रता के साथ उत्तेजना पर S1251N organoids की सूजन पर VX770 के उच्च गतिविधि से संकेत दिया, चित्रा 6D)।

आकृति 1
चित्रा 1: बायोप्सी से सीएफ कोलोरेक्टल organoids की स्थापना। (ए) अलगाव दिन (बीतने के 0, 0 दिन) पर BMM में एम्बेडेड किए जाने के बाद एक गुदा बायोप्सी से अलग सामग्री के प्रतिनिधि छवियाँ। संकेत तहखाना का इज़ाफ़ा निचले सही पैनल पर दिखाया गया है। (बी) के एक ही तहखाने संस्कृति में 7 दिन (बीतने के 0, दिन 7) के बाद पीछा किया गया था। पैनल में प्रस्तुत एक ही तहखाना का इज़ाफ़ा दिखाया गया है। (सी) एक ही organoid संस्कृति के प्रतिनिधि छवि 11 दिनों विभाजन के बाद किया जा रहा है (1 बीतने, 11 दिन)। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन।
159fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: CF कोलोरेक्टल अलग CFTR म्यूटेशन के साथ विषयों से निकाली गई organoids की छवियों प्रतिनिधि। F508del / F508del (ए), F508del / R117H-7T (बी), और F508del / S1251N (सी) म्यूटेशन के साथ विषयों से सीएफ कोलोरेक्टल organoids की छवियों प्रतिनिधि। (डी) एक wildtype CFTR विषय से एक कोलोरेक्टल organoid संस्कृति के प्रतिनिधि छवि। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। इन छवियों को कोई FSK उत्तेजना के साथ प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3: रखरखाव और परख के लिए या ठंड के लिए प्रसंस्करण सीएफ पेट के organoids। (ए) एक CF पेट के organoid संस्कृति की छवियों प्रतिनिधि या तो passaging (बी) या (सी) ठंड के लिए कार्रवाई की जा करने के लिए तैयार है। (बी) उनके यांत्रिक विघटन के बाद, छोटे टुकड़े का गठन कर रहे हैं, जो अगले पारित होने में नया organoids उत्पन्न होगा। (सी) trypsinization के बाद, बहुत छोटे, गोल organoids उत्पन्न कर रहे हैं, जमने की प्रक्रिया के दौरान उनकी व्यवहार्यता की सुविधा। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: जमे हुए organoids से एक CF कोलोरेक्टल organoid संस्कृति की स्थापना। (<strong> एक - सी) के एक CF कोलोरेक्टल organoid संस्कृति का प्रतिनिधि छवियाँ दिन 0 (ए पर thawed)। एक ही अच्छी तरह से छवियाँ एक (बी) और दो (सी) के दिनों के बाद ले जाया गया। (डी - जी) की धारा 5.9 में वर्णित कमजोर पड़ने कदम की छवियों प्रतिनिधि। एक बार जब organoids विगलन (विगलन के बाद 3 दिन) से ठीक से बरामद किया है, वे पतला कर रहे हैं ताकि वे (डी) विकसित करने के लिए जगह है। एक ही अच्छी तरह से छवियाँ ले जाया गया छह (ई), दस (एफ), और पंद्रह (सी) विगलन के बाद दिन। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: CF के Forskolin प्रेरित सूजनorganoids। (ए और बी) F508del / F508del (ए) या F508del / S1251N (बी) के पहले या-770 वीएक्स अभाव या की उपस्थिति में FSK (5 माइक्रोन) के साथ उत्तेजना के 60 मिनट के बाद कोलोरेक्टल organoids की छवियों प्रतिनिधि (3 माइक्रोन]) या VX-770 VX-809 (3 माइक्रोन) के साथ संयोजन में। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: बढ़ाता Forskolin प्रेरित सूजन। (ए) F508del / S1251N की एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा organoids से पहले (0 मिनट) और FSK (5 माइक्रोन) के और VX770 (3 माइक्रोन) के साथ उत्तेजना के 60 मिनट के बाद organoid क्षेत्र चयन के प्रतिनिधि छवियाँ। स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन। (बी) represFSK (5 माइक्रोन) अभाव या उपस्थिति VX770 (3 माइक्रोन) और / या VX809 (3 माइक्रोन) में उत्तेजना के 60 मिनट के दौरान F508del / F508del या F508del / S1251N organoids के रिश्तेदार क्षेत्र में वृद्धि की entative छवियों। (सी) (बी) (टी = 60 मिनट, आधारभूत सीमा = 100%) में संकेत की स्थिति की वक्र माप के तहत क्षेत्र। (डी) FSK के विभिन्न सांद्रता में F508del / F508del या F508del / S1251N organoids की वक्र माप के तहत क्षेत्र। डेटा ± भी प्रतिनिधि प्रयोगों से एसडी का औसत प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ, हम पीढ़ी, विस्तार, ठंड, और मानव कोलोरेक्टल organoids का विगलन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम मानव organoid संस्कृतियों कुछ समय पहले 17 की स्थापना की है, वहीं यह कभी कभी हाथों पर प्रशिक्षण के बिना अन्य प्रयोगशालाओं में प्रौद्योगिकी की स्थापना के लिए मुश्किल साबित हो गया। हम आशा करते हैं कि इन प्रोटोकॉल इस तरह के प्रशिक्षण की जगह लेगा।

Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम आदेश की स्थापना और एक लंबी अवधि organoid संस्कृति को बनाए रखने में सफल होने के लिए सबसे महत्वपूर्ण अभिकर्मकों में से एक है। दरअसल, organoid संस्कृतियों जब कम गतिविधि के साथ Wnt -3 ए-conditoned मध्यम से अवगत कराया "दुर्घटना" हो सकता है। चूंकि Wnt -3 ए-वातानुकूलित मध्यम घर में किया जाता है, वहाँ कई पहलुओं जब एक सक्रिय मध्यम पैदा करने कि ध्यान में रखा जाना चाहिए रहे हैं। सक्रिय Wnt -3 ए केवल उच्च गुणवत्ता वाले भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एल कोशिकाओं और हाइड्रोफोबिक के स्थिरीकरण के लिए समुचित विकास का संकेत है कि प्रदान करता है के साथ मध्यम में उत्पादन किया जा सकता हैWnt -3 ए अणुओं। जब Wnt -3 ए गतिविधि कम है (यानी, कम टॉप / बांका अनुपात, देखें नीचे) है, यह आमतौर पर FBS कि समस्या पैदा कर रहा है।

वाणिज्यिक पुनः संयोजक Wnt खराब काम करता है, तो हम इसे टॉप / बांका Wnt संवाददाता परख के लिए के रूप में सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर सिफारिश नहीं है। टॉप / Renilla और बांका / Renilla के बीच का अनुपात वातानुकूलित माध्यम से Wnt गतिविधि का एक संकेत है, तो Wnt -3 ए-वातानुकूलित माध्यम का एक अच्छा बैच है एक शीर्ष / बांका अनुपात 25 से अधिक देता है, से टॉप / बांका मूल्य की तुलना नकारात्मक नियंत्रण: मध्यम Wnt -3 ए-उत्पादक कोशिकाओं के संपर्क में नहीं। संयोजक नोगिन और आर-spondin नोगिन द्वारा बदला जा सकता है और आर-spondin वातानुकूलित मध्यम 28, 29।

मौजूदा प्रोटोकॉल भी CFTR-वित्तीय संस्थाओं परख के लिए एक कार्यात्मक परीक्षण का वर्णन है। हमने हाल ही में CFTR जीनोटाइप और वित्तीय संस्थाओं और कैसे यह दर्शाता प्रकाशित CFTR genoty के बीच संबंध का प्रदर्शन किया हैपे-फेनोटाइप रिश्तों नैदानिक रजिस्ट्रियों (www.CFTR2.org) 25 से प्राप्त की। इस परख का उपयोग करना, अत्यंत दुर्लभ CFTR परिवर्तन के साथ दो व्यक्तियों की पहचान की गई जिसका organoids (VX-770) 25 ivacaftor के लिए उत्तरदायी थे। इस दवा के बाद पर्चे स्पष्ट नैदानिक ​​प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप, चिकित्सीय परीक्षण डेटा के अभाव में दुर्लभ परिवर्तन के साथ मरीजों के साथ विशिष्ट दवाओं मैच के लिए वित्तीय संस्थाओं परख के मूल्य पर प्रकाश डाला। वित्तीय संस्थाओं की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक इष्टतम विकास और परख की स्थिति, गैर सूजन organoids की एक सीमित अंश (आमतौर पर नीचे 5%) द्वारा ही संकेत हैं। सूजन के मूल्यवान समझना के लिए मलबे नेतृत्व के उच्च स्तर, के रूप में अलाभकारी, गैर सूजन संरचनाओं का एक बड़ा अनुपात छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त हैं।

इन विट्रो वित्तीय संस्थाओं की प्रतिक्रियाएं और पहले से स्थापित CFTR निर्भर बायोमार्कर (पसीना क्लोराइड एकाग्रता और intest के बीच सहसंबंधव्यक्तिगत स्तर पर inal वर्तमान माप) हमारे पिछले अध्ययनों 19, 25 में आसानी से प्रत्यक्ष कर रहे थे। यह धारणा है कि अवशिष्ट समारोह माप सीएफ के साथ विषयों पर वित्तीय संस्थाओं का उपयोग कर एक व्यक्तिगत फैशन में एक नैदानिक ​​या शकुन मार्कर के रूप में वर्तमान दृष्टिकोण के पूरक हो सकते हैं समर्थन किया। ऐसे विवो में पसीने क्लोराइड एकाग्रता माप और पूर्व vivo गुदा बायोप्सी में आंतों वर्तमान माप के रूप में CFTR समारोह के अन्य बायोमार्कर की तुलना में वित्तीय संस्थाओं परख के throughput, तकनीकी परिवर्तनशीलता के बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। यह भी एक पूरी तरह से CFTR निर्भर readout और FSK की एक अनुमापन है कि सही प्रकार के अवशिष्ट CFTR समारोह का उपयोग करके एक बड़ी गतिशील रेंज प्रदान करता है।

हालांकि, वित्तीय संस्थाओं परख, केवल दवा प्रभावकारिता की परिवर्तनशीलता पर अलग-अलग जीनोटाइप के प्रभाव को दर्शाता है, जबकि सीएफ रोग के मॉडुलन केवल CFTR समारोह की तुलना में अधिक से प्रभावित है। DRU के लिएजी प्रतिक्रिया, परख एक संभावित ऊतक प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित करता है। हालांकि CFTR माप में बहुत ही सटीक, फार्माकोकाइनेटिक्स में मानव बदलाव शामिल नहीं किया जाता है, के रूप में विवो 7, 8 या प्रत्यक्ष पूर्व vivo CFTR माप 32 में अन्य करने का विरोध किया। जैसा कि पहले चर्चा की, गैर सीएफ संशोधक (दोनों आनुवांशिक और पर्यावरणीय) भी फेनोटाइप प्रभावित कर रहे हैं, इन विट्रो टिप्पणियों या CFTR बायोमार्कर और नैदानिक phenotype 2 के बीच काट के कारण। इसके अलावा, सेल लाइनों का उपयोग कर 33 संभावित उत्तरदायी म्यूटेशन की पहचान के रोगियों को जो organoids की स्थापना के लिए एक गुदा बायोप्सी प्राप्त करने की आवश्यकता पर कम प्रभाव के साथ जुड़ा हुआ है।

एकाधिक CFTR को लक्षित दवाओं के विकास 1 में वर्तमान में कर रहे हैं। यह अनुमान है कि क्लिनिकल परीक्षण नैदानिक ​​प्रभावकारिता बी के एक सही भविष्यवाणी की अनुमति नहीं देंगेअकेले CFTR mutational स्थिति पर ased। वित्तीय संस्थाओं परख कार्यात्मक CFTR समारोह और दवा प्रतिक्रिया के उपाय के रूप में, यह निर्धारित करने के लिए जो दवा है जो मरीज के लिए सबसे अच्छा काम करता पसंद की विधि बन सकता है। वित्तीय संस्थाओं परख भी उपयोगी के लिए रोगी समूहों की पहचान के पंजीकरण के परीक्षणों में और उपन्यास दवा के तौर तरीकों के विकास के लिए शामिल होने के लिए हो सकता है। पहले और उपचार के दौरान प्लाज्मा के साथ कोलोरेक्टल organoids की उत्तेजना आगे रक्त में CFTR modulators घूम, संभावित व्यक्तिगत खुराक और क्लिनिकल परीक्षण 30 में दवा dosages का चयन 31 को सुविधाजनक बनाने के कार्यात्मक मात्रा quantitate करने में मदद कर सकता है। अंत में, वित्तीय संस्थाओं CFTR समारोह और उसके समारोह के अन्य, ताकि तक बड़े पैमाने पर unknown- आनुवंशिक संशोधक के साथ अपनी बातचीत का एक बेहतर बुनियादी समझ के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Acknowledgements

इस काम डच सीएफ फाउंडेशन (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina बच्चों के अस्पताल रिसर्च फंड और जेड, और Zilverenkruis / Achmea की हिट-CF कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया। हम शुक्रिया अदा करने के एस Heida मिशेल, एम Geerdink, के.एम. डी सर्दी-de Groot, और जी Berkers (बाल चिकित्सा Pulmonology, Wilhelmina बच्चों के अस्पताल, यूएमसी एम्सटर्डम विभाग), और RHJ Houwen (बाल चिकित्सा गैस्ट्रोएंटरोलॉजी, Wilhelmina विभाग चाहते हैं बच्चों के अस्पताल, यूएमसी यूट्रेक्ट) रोगियों आ रहा है और एक CF Biobank की पीढ़ी के लिए बायोप्सी प्राप्त करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

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References

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