Forskoline-geïnduceerde zwelling in Intestinal Organoids: An

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R., Beekman, J. M., Clevers, H. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CF wordt veroorzaakt door mutaties in het cystische fibrose transmembraan conductantie regulator (CFTR) gen dat een epitheliale anion kanaal codeert. CF treft ongeveer 85.000 mensen wereldwijd 1. Meer dan 2.000 CFTR mutaties geïdentificeerd ( www.genet.sickkids.on.ca ). Deze verscheidenheid verklaart deels een breed spectrum van de ziekte waargenomen fenotypes ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Zes klassen van CFTR mutaties worden gedefinieerd op basis van hun effect op CFTR proteïne expressie en functie: (I) geen synthese, (II) verminderde handel, (III) defect kanaal gating, (IV) veranderde geleidbaarheid, (V) verlaagde gewoonlijk functionerend CFTR en (VI) verminderde celoppervlak stabiliteit 4. Hoewel het gemeenschappelijk CFTR mutaties goed bestudeerd, CFTR-functie en de relatie met de klinische status blijven poorly onderzocht op het niveau van het individu, met name voor de grote groep van zeldzame "orphan" mutaties ( www.CFTR2.org ) 1, 3.

Recent zijn medicijnen ontwikkeld die het CFTR-eiwit een mutatie-specifieke wijze te richten. Twee klassen van CFTR-eiwit gericht geneesmiddelen zijn klinisch gebruikt en hebben verschillende werkingsmechanismen. Potentiatoren, zoals VX-770, verbetering van de open waarschijnlijkheid van apicaal-gelokaliseerde mutant CFTR en direct werken op hun toevoeging aan cellen 5. Correctors, zoals VX-809, het herstel van de handel in endoplasmatisch reticulum-gelokaliseerde misfolded CFTR en vereisen pre-incubatie met cellen voor de effecten worden waargenomen 6. Het CFTR potentiator, VX-770, is geregistreerd bij patiënten met de G551D mutatie 7, 8, en acht andereCFTR gating mutaties, waaronder S1251N 9; samen worden deze mutaties gedragen door 5% van alle CF patiënten. Andere klinische studies hebben aangetoond dat VX-770, in combinatie met de corrector VX-809, nog aanzienlijk beperkte longfunctie en veroorzaakt een verlaging van exacerbaties bij personen die homozygoot zijn voor de mutatie F508del met 45-50% van de patiënten 10 uitgevoerd, 11.

Conventioneel klinisch onderzoek naar geneesmiddelen reagerende patiënten binnen de resterende 50% van CF-patiënten te identificeren zijn kostbaar en tijdrovend en niet haalbaar voor individuen met zeer zeldzame CFTR genotypen. Novel, kosteneffectieve, gepersonaliseerde methoden zijn van cruciaal belang voor het toenemende aantal CFTR modulators om individuen die elk type CFTR mutatie passen. Tot nu toe heeft het proces opnemen van patiëntengroepen dragen specifieke CFTR mutaties leiden door studies met behulp van mutante CFTR-gen transfectie in heterologous celsystemen, gevolgd door elektrofysiologische studies in Ussing kamers 5, 6, 12. Vanwege een gebrek aan adequate CF diermodellen geneesmiddelefficiëntie studies lucht-vloeistof-interface gedifferentieerde bronchiale epitheelcellen afkomstig van CF long explantaat materialen gebruikt voor de ontwikkeling van geneesmiddelen 13, 14, 15. Echter, de beperkte beschikbaarheid van long- explantaat weefsels en de invasieve procedures om bronchiale cellen van patiënten zonder end-stadium van de ziekte te verkrijgen belemmeren de analyse van de minder voorkomende CFTR mutaties en het voorkomen van drugstests op een persoonlijke manier. Om deze beperkingen, "easy access" weefsels, zoals colorectale organoids, nasale luchtwegen cellen en luchtwegen cellen afkomstig van geïnduceerde pluripotente stamcellen te overwinnen, worden momenteel onderzocht voor gepersonaliseerde behandelingen met geneesmiddelen.

16, 17. Voor het colon / rectum, omvatten de kweekomstandigheden gedefinieerde groeifactoren (Epithelial Growth Factor (EGF), gastrine, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) en Noggin) in combinatie met kleine moleculen (nicotinamide, A83-01, en SB202190) in een basaal membraan matrix. Onder deze omstandigheden enkele stamcellen of kleine weefselfragmenten uitgroeien tot gesloten, blaas, 3D structuren gevormd door hoog-gepolariseerde epitheel met basale zijde naar buiten gericht. Alle celtypen verschijnen meestal in hun normale verhoudingen en posities. Organoids kan worden uitgebreid over lange periodes door middel van wekelijkse mechanische ontwrichting en re-plating. Zij genetisch en fenotypisch stabiel en kunnen worden opgeslagen, zodat langdurige expansie en biobanking 17. Ze zijn vatbaar vooralle standaard celbiologische / genetische manipulaties en analytische technieken ontwikkeld voor 2D-cellijnen 18.

We hebben onlangs aangetoond dat CFTR-functie gemakkelijk kan worden gemeten colorectale organoids in een forskoline-geïnduceerde zwelling (FIS) assay 19, 20. Bij blootstelling aan forskoline (FSK) of, subsidiair, choleratoxine, organoids snel toenemen hun cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) niveaus, wat weer resulteert in de opening van het CFTR kanaal 19. Organoids van gezonde individuen of van patiënten met CFTR mutaties geassocieerd met restfunctie, zullen vervolgens opzwellen als gevolg van ionen en water transport naar de organoïde lumen, de in vitro equivalent van secretorische diarree. FIS reactie van colorectale organoids bleek eerder CFTR volledig afhankelijk te zijn, zoals aangegeven door organoids afgeleid van CFTR-null individuen eennd door het gebruik van specifieke farmacologische remmers CFTR 19. Grote vakspecifieke datasets kunnen worden afgeleid binnen enkele weken na het nemen van een biopsie.

Voor de FIS-test hier in detail beschreven, organoids gekweekt uit rectale biopsies die kan worden verkregen op elke leeftijd en met slechts beperkte hinder 21. Organoids worden gepasseerd wekelijks door mechanische verbreking in enkele crypten die gemakkelijk opnieuw te verzegelen en vormen nieuwe organoids. Voor het uitvoeren van de assay FIS, ~ 30-80 van deze verstoorde kleine organoids uitgeplaat in elk putje van een 96-wells plaat 19. Op de dag van de assay worden de organoids gekleurd met calceïne groene, een fluorescerende cel-permeabel kleurstof die wordt vastgehouden binnen levende cellen, vergemakkelijkt levende imaging. Vervolgens, FSK, die intracellulaire cAMP verhoogt en daardoor activeert CFTR, wordt toegevoegd om organoïde zwelling stimuleren. Versterkers die inwerken op apicale CFTR gelijktijdig toegevoegd wet de forskoline, terwijl correctoren dat CFTR mensenhandel te herstellen worden toegevoegd 24 uur vóór de toevoeging van FSK. De organoïde zwelling wordt gekwantificeerd door een geautomatiseerde beeldanalyse dat de relatieve toename van het totale oppervlak van alle fluorescerende objecten voor elk tijdstip na forskoline toevoeging berekent.

3D organoïde zwelling biedt voor- en nadelen ten opzichte van bestaande elektrofysiologische CFTR uitlezingen in 2D cellen gekweekt luchtwegen in Ussing kamers. Een belangrijk voordeel is de doorvoer van de zwelling assay. Cellen worden gekweekt en onderzocht met behulp van een enkel type kweekmedium, en een ervaren technicus kan cultuur tot 25 organoïde monsters op een wekelijkse basis met de kwantificering ongeveer 1200 datapunten per week in 12 patiëntenmonsters. We conventioneel typt u een enkele experimentele conditie door twee- of drievoud metingen per plaat en herhaal dergelijke metingen bij drie onafhankelijke incubatietijd punten. In totaal zijn ongeveer 300-500 single organoïde structuren worden dan gemeten per experimentele conditie, waardoor zeer precieze metingen van CFTR-functie met beperkte technische variabiliteit. Dit precisie laat ons toe om duidelijke verschillen in de resterende functie en de reactie op CFTR modulators definiëren en stelt ons in staat om gemakkelijk te halen genetische achtergrond-effecten tussen patiënten dragen identieke CFTR mutaties 19, 22, 23, 24, 25. kwaliteit gegevens kunnen eenvoudig worden beoordeeld vanuit microscoop beelden. Terwijl FIS volledig CFTR-afhankelijke, is een indirecte maat resultaat voor CFTR functie, zijn uitgelezen door de koppeling van ionentransport om vloeistoftransport. Dit in tegenstelling tot directe CFTR-functie metingen in Ussing kabinet, transepitheliaal ion stromingen 26 te meten. Ussing Chambers kan de select stimulatie van apicale of basolaterale compartments (die de organoïde assay niet mogelijk); door permeabilisatie basolaterale membranen, kan de apicale CFTR-afhankelijke anion secretie selectief worden gemeten 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten waarbij menselijke weefsels hierin beschreven werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). Informed consent voor tissue verzameling, productie, opslag en het gebruik van de organoids werd verkregen van de patiënten in Wilhelmina Kinderziekenhuis (WKZ) -UMCU.

uitrusting verbruiksartikelen Gereedschap
Laminaire stroming kap 15 en 50 ml conische buizen Zeiss LSM 800 - Zen 2 (Blauwe editie) software voor het meten van beelden
CO 2 incubator microfugebuisjes Microsoft Excel-programma
Celcultuur Microscope (licht / optische microscoop) 0,22 urn filters
centrifuge serologische pipetten
Rolling Shaker Micropipet filtertips
4 ° C kamer of 4 ° C koelkast voor incubator cryovials
CoolCell Cell Invriezen Container
serologische Pipettor
Micropippette (1000, 200 en 20 ui)
Viaflo herhalen pipet
(Live cel) confocale microscoop
Computer
Vloeibare stikstof tank
Multichannel (200 pl)

1. Voorbereiding reagentia voor Cultuur

  1. Basale Medium Voorbereiding
    OPMERKING: Basal medium (BM) verwijst naar geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle Medium met Ham's Nutrient Mixture F-12 (Ad-DF) aangevuld met 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), glutamine en penicilline / streptomycine (Pen / Strep).
    1. In een 500 ml Ad-DF medium fles, voeg 5 ml 200 mM glutamine, 5 ml 1 M HEPES en 5 ml pen / strep oplossingen (10.000 U / ml, 10000 ug / ml).
    2. WINKEL BM in de koelkast bij 4 ° C gedurende ten minste 4 weken.
  2. -Wnt-3A geconditioneerd medium Bereiding
    LET OP: Wnt-3A-geconditioneerd medium is gemaakt in-house using de cellijn L-Wnt-3A volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Voor het oogsten van de Wnt-3A geconditioneerd medium, verzamelen het medium blootgesteld aan de cellen gedurende één week en spin deze gedurende 5 minuten bij 450 x g om drijvende cellen te verwijderen.
    2. Filter de Wnt-3A geconditioneerd medium door een 0,22 urn filter en verdeel het in 40 ml porties in 50 ml conische buizen. Bewaar ze bij 4 ° C gedurende ten minste 4 maanden zonder verlies van activiteit.
    3. Test de activiteit van de Wnt-3A geconditioneerd medium in een TOP / FOP assay met menselijke embryonale nier (HEK) cellen die met -293 TOP- en FOP-luciferase en TK Renilla en gemeten met een Renilla -luciferase testkit volgens instructies van de fabrikant.
      LET OP: TOP-luciferase is een reporter plasmide die wild-type TCF bindende regio's bevat. Als de Wnt-3A-geconditioneerd medium actief is, wordt de Wnt-signalering geactiveerd. Beta-catenine transloceert in de kern namelijk associërenh TCF / LEF transcriptiefactoren en activeert transcriptie van het luciferase reporter induceren van een verhoging van de relatieve luciferaseactiviteit wanneer het substraat wordt toegevoegd. De FOP-luciferase wordt gebruikt als negatieve controle omdat het TCF bindende gebieden stroomopwaarts van het luciferasegen worden gemuteerd.
  3. Colon Medium Voorbereiding
    OPMERKING: Bereid en verdun alle groeifactoren en reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik klein formaat porties een vermijden vries-dooi cycli. Functionele groeifactoren zijn essentieel voor de resultaten.
    1. Bereid colon medium (CM) van BM vullen met 1x B27, 1,25 mM N-acetylcysteïne, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastrine, 10 mM nicotinamide, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 uM A83-01 , 10 uM SB202190 en 100 ug / ml van een antimicrobieel voor primaire cellen.
    2. Verdeel de CM in aliquots en bevriezen bij -20 ° C gedurende maximaal 4 maanden. Ontdooi de fracties om volledige dikke darm voor te bereidenmedium (FCM) door toevoeging van 50% Wnt-3A-conditoned medium aan de CM. WINKEL FCM tot 7 dagen bij 4 ° C zonder verlies van activiteit.
    3. Voor de oprichting van een organoïde cultuur van rectale biopsies, vullen FCM met 50 ug / ml vancomycine, 50 ug / ml gentamycine en 10 uM-Rho geassocieerd opgerolde-coil-vormende eiwit serine / threonine kinase inhibitor (RhoKi). Met dit medium, genaamd isolatiemedium (IM), alleen voor de eerste 2-3 dagen in kweek.
  4. EDTA Stock Solution Voorbereiding
    1. Bereid 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), pH 8, in ultrapuur H 2 O, gesteriliseerd met een 0,22 urn filter.
  5. Manipulatie van de Basement Membrane Matrix
    1. Bereid de basaalmembraan matrix (BMM) volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Dooi BMM 's nachts op het ijs.
    3. Bij het overbrengen van de BMM de fles naar een 15 ml conische buis, gebruikeen 5 ml pipet en een 15 ml conische buis voorgekoeld bij -20 ° C.
    4. Ontdooide Bewaar de BMM in een koelkast bij 4 ° C en incubeer op ijs gedurende ten minste 30-60 minuten voor gebruik.
      LET OP: Om de beste resultaten te verkrijgen, moet de BMM koud en behoorlijk gemengd voordat het inbedden crypten of organoids zijn.

2. Vaststelling van Colon Organoids van een CF patiënt Biopsie

OPMERKING: Na weefselverzameltoestel, is het belangrijk om het monster op ijs in zoutoplossing handhaven, Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (DPBS) of BM. Snelle verwerking van de biopten wordt aanbevolen, maar het is mogelijk gebleken om organoïde culturen vaststellen van biopsies op ijs bewaard gedurende maximaal 7 dagen.

  1. Laat de biopten bezinken op de bodem van een 15 ml conische buis en de bovenstaande vloeistof.
  2. Voeg 10 ml van DPBS de biopsieën en pipet op en neer 10-20 keer met een 10 ml pipet.
    OPMERKING: De pipet moet vooraf worden bevochtigd met BM voordat pipetteren de biopsie.
  3. Laat de biopten vestigen op de bodem en de bovenstaande vloeistof.
  4. Herhaal stap 2.2 en 2.3 4-5 keer totdat het supernatans helder is.
  5. Voeg 10 ml DBPs en 200 ul EDTA (0,5 M) aan de biopten en plaats de buis op een wiebelbalk platform 60-120 min bij 4 ° C.
    LET OP: incubatie tijd kan verschillen per patiënt. Als crypten worden vrijgegeven, DPBS troebel. EDTA incubatie kan worden afgerond wanneer crypten onder een microscoop worden waargenomen.
  6. Laat de crypten om zich te vestigen. Verwijder het supernatant.
  7. Neem 2 ml van BM en voeg deze toe aan een nieuwe 15 ml conische buis. Schud dit nieuwe buis handmatig zodanig dat de binnenzijde is bedekt met BM.
  8. Pipetteer vooraf bevochtigd met BM, voeg 2 ml DPBS om de buis met het biopsieën en pipet op en neer 10-20 keer.
  9. Laat de biopten om zich te vestigen en de overdracht van de DPBS met de crypten van de nieuwebuis met het 2 ml BM die bereid is in stap 2,7.
  10. Herhaal stap 2.8 en 2.9 totdat er geen crypten meer worden vrijgegeven.
  11. Spin de crypten neer op 130 xg gedurende 5 minuten bij 8 ° C.
  12. Ondertussen overdracht IM de veiligheidskast bij kamertemperatuur (RT).
  13. Verwijder het supernatant en voeg 10 ml van BM naar de crypte pellet en herhaal stap 2.11.
  14. Resuspendeer de pellet in 1 ml BM. Neem 5-10 ul en tel het aantal crypten met het blote oog onder een microscoop.
  15. Spin de crypten neer op 130 xg gedurende 5 minuten bij 8 ° C.
  16. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 55% BMM (v BMM naar v IM).
    OPMERKING: De crypten worden opnieuw gesuspendeerd in het overeenkomstige volume van 55% BMM 1 crypt per pl. Als er niet genoeg crypten, het minimale volume van de BMM is 40 pl.
  17. Voor het zaaien Pipetteer 35 ul per putje (in een 24-wells plaat). Verdeel de 35 ul van BMM in 3-5 druppels afzonderlijk Teneinde de verspreiding van gro verbeterenwth factoren in de BMM. Niet bellen creëren.
  18. Plaats en laat de plaat ondersteboven in de incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 20 min de BMM stollen.
  19. Voeg 500 pl IM per putje en houdt deze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  20. Vernieuw de medium om de 2-3 dagen. Verwijder de oude medium door pipetteren met een pipet P1000, het verlaten van de BMM daalt intact. voeg FCM zorgvuldig pipetteren het aan de zijde van de put, niet direct op het BMM daalt.
    LET OP: Als er geen crypten worden uitgebracht in de isolatie-protocol, centrifugeren de bovenstaande vloeistof, was de pellet 2-3 keer met BM, en resuspendeer in BMM. Neem de overgebleven weefsel en snijd deze in kleine stukjes met een scheermes. Innen deze in een 15 ml conische buis, centrifuge hen en resuspendeer ze in dezelfde BMM. Indien epitheliale stamcellen aanwezig zijn, zullen deze ook organoids genereren.

3. Passage van Colon Organoids voor Maintenance, bevriezen, en voorskolin-geïnduceerde zwelling Assay (FIS)

OPMERKING: Elke organoïde cultuur heeft zijn eigen verdubbeling tijd. Normaal gesproken kan colorectale CF organoids worden uitgebreid 1: 3-1: 5 keer per 7-10 dagen. Het is een goed teken als ontluikende structuren worden waargenomen. Colorectale CF organoids minder cystic (Figuur 2A - 2C) dan colorectale normale organoids (figuur 2D). Voor opzetten en onderhouden, organoids gekweekt in 24-putjesplaten; te vriezen, in 6-well platen; en de FIS assay in 96-well pasteien.

  1. Passage van Organoids
    1. Houd de BMM op ijs gedurende ten minste 30-60 min alvorens het te gebruiken.
    2. Houd de FCM bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
    3. Label een 15 ml conische buis met de naam monster en een andere buis als "gewassen."
    4. Zorgvuldig aspireren het medium uit de putjes met een P1000 pipet zonder de BMM daalt.
    5. Voeg 1 ml BM tot 1 goed en break de BMM daalt met behulp van een P1000 pipet. Breng deze 1 ml in de 15 ml conische buis met de naam monster.
    6. Was de put met een andere 1 ml BM en overbrengen naar dezelfde 15 ml buis.
    7. Herhaal stap 3.1.5 en 3.1.6 met 5 meer putjes (maximaal 6 putjes van een 24-wells plaat wordt over een 15 ml conische buis wordt gewassen).
    8. De buis wordt tot 12 ml met BM. Pipet op en neer met een vooraf bevochtigde 5 ml pipet.
    9. Spin bij 85 xg gedurende 5 minuten bij 8 ° C.
    10. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml van BM aan de pellet. Met dezelfde P1000 pipet tip, neem een ​​P10 tip zonder filter, en pipet op en neer 20 keer. Gooi zowel de P1000 en P10 tips.
    11. Voeg 4 ml van BM met een 5 ml pipet en houd de buis gekanteld op ongeveer 70 ° van de verticale naar één kant. Pre-nat een nieuwe P1000 tip en meng krachtig 2-3 keer met de P1000 (1 ml volume).
    12. Tel tot 10, terwijl die nog in de gekantelde positie, het verzamelen van de bovenste laag voorzichtig wet de P1000 pipet en overdracht 4 x 1 ml in de buis aangeduid als "gewassen."
    13. Let op de organoids afwikkeling van de bodem in de gekantelde buis; ongestoorde organoids en grotere brokken zal zinken naar de bodem. Centrifugeer de 15 ml "gewassen" buis gedurende 5 minuten bij 85 xg en 8 ° C.
    14. Verwijder het supernatant en voeg de vereiste hoeveelheid medium en BMM de organoïde pellet tot een uiteindelijke concentratie van 55% BMM. Meng door op en neer pipetteren zonder dat bellen (figuur 3B).
      OPMERKING: Een goede dichtheid wordt bereikt door zaaien 25-30 organoids in 10 pl BMM.
    15. Volg stap 2,17-2,19.
  2. Passage voor het invriezen
    1. Houd de BM in ijs gedurende ten minste 30-60 minuten voor gebruik. Houd de FCM bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
    2. Bereid FCM aangevuld met RhoKi (stap 1.3.3).
    3. Neem trypsine uit de koelkast en laat het op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik.
    4. Volg de stappen 3.1.5-3.1.10.
    5. Verwijder zoveel mogelijk supernatant, voeg 4 ml trypsine, en vortex gedurende 30 seconden.
    6. Plaats de buis in een warmwaterbad bij 37 ° C gedurende 1 min en vortex krachtig gedurende 30 seconden.
    7. Inspecteer de oplossing in de buis. Als intact organoids zijn nog steeds zichtbaar onder de microscoop, herhaalt u stap 3.2.7.
    8. Wanneer de organoids verstoord, voeg 8 ml BM de trypsine en pipetteer 10 maal neutraliseren.
    9. Spin gedurende 3 min bij 450 xg bij 8 ° C.
    10. Verwijder het supernatant en voeg de vereiste hoeveelheid medium en BMM de organoids een 55% BMM oplossing. Meng door en neer te pipetteren zonder dat er bubbels.
      LET OP: Voor het vriespunt, moet organoids worden gezaaid in een verhouding 1: 1 na behandeling met trypsine.
    11. Zaad 250 pl in een enkel putje van een voorverwarmde 6-well weefselkweekplaat, produceren kleine, gescheiden druppeltjes ~ 10 pi. Plaats de plaat ondersteboven in de incubator bij 37 ° C en laat deBMM stollen gedurende 20-30 min.
    12. Voeg 2,5 ml vers FCM + RhoKi iedere 6-well plaat goed en breng de plaat naar de incubator (figuur 3C).
  3. Passage Organoids voor de FIS Assay
    Opmerking: Afhankelijk van het aantal en de grootte van de organoids, tussen 4 en 6 putjes van een 24-wells plaat voldoende zaaien 27 putjes van een 96-wells plaat.
    1. Verwerk de organoids zoals beschreven van stap 3.1-3.1.13.
    2. Resuspendeer de pellet in 120 ui 50% BMM.
    3. Bevestig het aantal organoids (30-50) in een 3 ui BMM daling onder de microscoop.
    4. De plaat organoids met een druppel van 3 ul in het midden van elk putje van een 96 putjes paté.
    5. Plaats de plaat in de 37 ° C incubator gedurende 15 min voor het BMM stollen; verdere stappen worden beschreven in stap 6.1.1.

4. Invriezen Colon CF Organoids

LET OP: OrganOID's zijn klaar om te worden ingevroren 1-2 dagen na de behandeling met trypsine en het kweken, zodat organoids zullen nog klein, die na ontdooien van de efficiëntie van de overleving vergroot zijn.

  1. Voeg 1 ml BM en breken de BMM druppels met een P1000 pipet. Over te dragen aan een 15 ml conische buis.
  2. Was de put met een andere 1 ml BM en transfer naar dezelfde 15 ml buis.
  3. Herhaal de stappen 4,1 en 4,2 met alle putjes.
    OPMERKING: Om overtollige BMM voorkomen, 3 putjes van een 6-wells plaat worden samengevoegd in een 15 ml buis.
  4. Vul de 15 ml buis met het organoids met 12 ml koud BM en de pipet op en neer met een 5 ml pipet. Laat de buis op ijs gedurende 5 minuten.
  5. Spin gedurende 3 min bij 450 xg en 8 ° C en de bovenstaande vloeistof.
  6. Los de pellet van organoids met het bevriezen van middelgrote en pipet op en neer om de organoids goed te mengen.
    OPMERKING: 500 pl ijskoud medium wordt gebruikt per 100 ui BMM.
  7. Met een 5 ml pipet, breng 0,5 mlorganoids gesuspendeerd in de vrieskou medium tot cryogene flacons steriel.
  8. Breng de flesjes een cel bevriezing en plaats het op -80 ° C.
  9. Na 24 uur en spoel de flesjes voor opslag in vloeibare stikstof.

5. Vaststelling van Culturen van Frozen Organoids

LET OP: Ontdooi de BMM op ijs en houd het op ijs. Laat de BM bereiken RT, en warm een ​​10 ml aliquot tot 37 ° C alvorens de procedure van ontdooien een cryovial.

  1. Ontdooi de ampul snel door beweging in een 37 ° C waterbad totdat er nog iets bevroren materiaal.
  2. Breng de ontdooide organoids een 15 ml conische buis met een P1000 pipet.
  3. Direct daarna voeg 1 ml warm BM druppelsgewijs onder schudden de bodem van de buis. Zodra de 1 ml medium wordt toegevoegd, meng goed door en neer te pipetteren een paar keer om de bevriezing medium te verdunnen.
  4. Langzaam (druppelsgewijs) toe te voegen 9 ml warm BM aan de conische buis Containing de organoids. Omkeren een paar keer.
  5. Draai de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 85 xg en 8 ° C.
  6. Verwijder het supernatant voorzichtig, zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de organoïde in 90 pi aangevuld met FCM RhoKi (stap 1.3.3). Voeg vervolgens 110 ul van BMM.
  7. Voeg 35 ul aan elk putje van een voorverwarmde 24-well plaat, waardoor kleine, gescheiden druppeltjes.
  8. Breng de plaat om de 37 ° C incubator, waardoor de plaat op zijn kop naar beneden voor 20-30 min.
  9. Voeg 500 ul van FCM met RhoKi aan elk putje en de plaat te dragen naar de incubator (Figuur 4A - 4C).
  10. Zodra organoids naar behoren uit ontdooien hersteld, verdunnen in meer BMM zodat elk 10 ul van BMM bevat 25-30 organoids. Deze procedure kan worden uitgevoerd 2-3 dagen na ontdooiing (Figuur 4D - 4G) en zorgt voor de goede groei van de organoïde.

6. Forskolin-geïnduceerde zwellingzeggen (FIS)

OPMERKING: FSK titratie maakt de meting van CFTR restfunctie. Voor CFTR modulatie worden organoids blootgesteld aan een bepaalde corrector (bijvoorbeeld, VX-809) en / of versterkingsmiddel (bijvoorbeeld VX-770), afhankelijk van het genotype. Gewoonlijk, VX-809 toegevoegd wordt 18-24 uur voor de meting, terwijl VX-770 en FSK toegevoegd net voordat de metingen. Wees ervan bewust dat sommige modulators (correctoren / versterkers) kan binden aan het plastic oppervlak van de testplaat.

  1. Plating voor Assay
    OPMERKING: VX-809 voorraden worden in porties verdeeld in 20 mM en bij -80 ° C. Bij het ontdooien, laten bij kamertemperatuur en bescherming tegen licht.
    1. Verwerk de organoids zoals beschreven in paragraaf 3.3.
    2. Wanneer het testen van de VX-809 corrector, stelt een dosis-response curve in triplo met de volgende concentraties: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 en 30 uM. Maak de verdunningen in FCM.
    3. De 96-well plaat, voeg ofwel 100 μ; L van FCM met de respectievelijke VX-809 concentratie of 100 ul FCM alleen en incubeer de plaat.
  2. Meten Assay
    LET OP: VX-770 voorraden worden in porties verdeeld in 20 mM, terwijl FSK is op 10 mM; beide opgeslagen bij -80 ° C. Bij het ontdooien, laten bij kamertemperatuur en bescherming tegen licht.
    1. Neem een ​​flesje van calceïne en DMSO en laat bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    2. Voeg 5,1 pl DMSO aan het flesje waar de calceïne wordt geleverd als poeder, ongeopend. Gebruik anders een reeds gesuspendeerd calceïne flacon met 2,5 ul van calceïne.
    3. Voeg 2,5 ul van calceïne tot 580 ul van BM in een 1,5 ml tube en labelen.
    4. Voeg 10 ul van deze kleurstofoplossing (BM + calceïne) aan elk putje met een herhaling pipet.
    5. Resuspendeer eenmaal met een meerkanaals zodat de kleurstof goed gemengd.
    6. Incubeer de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten.
    7. Tijdens de calceïne incubatie, beginnen met de voorbereiding van de FSKen VX-770 oplossingen, indien nodig.
    8. Bij gebruik van een VX-770 potentiator, stelt een dosis-response curve in drievoud met de volgende concentraties: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 en 30 uM. Bij een FSK titratie, de concentraties: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 en 5,0 pM. Maak de verdunningen in BM.
      OPMERKING: Bij FSK, VX-770, of andere geneesmiddelen toegevoegd op de tweede dag, de verdunningen moeten met 2x eindconcentratie, aangezien 100 pl FSK / geneesmiddel titratieoplossing ontvangt elke worden putje toegevoegd, die reeds 100 pl bevatten van FCM.
    9. Breng de FSK en VX-770-oplossingen, een P200 pipet, en tips om de microscoop kamer.
    10. Voor het afbeelden van de FIS-test, gebruik dan een live-cell imaging confocale microscoop uitgerust met een geautomatiseerde podium, een verwarmde kamer, en de CO 2 stroom.
      OPMERKING: De volgende stappen verwijzen naar een specifiek microscoop. Verschillende instellingen moeten gelden voor andere microscopen volgende fabrikantinstructies.
    11. Zet de 96-wells plaat in de plaathouder.
    12. Voer de instellingen voor confocale beeldvorming.
      1. Stel de levende beeldvormingstechniek tot 37 ° C en 5% CO2 en laat de kamer vooraf incubeer gedurende minimaal 30 minuten vóór de meting.
      2. Gebruik de optie 'Smart setup "om de Alexa Fluor-488 track te selecteren.
      3. Stel de 5X lens en scangebied om 0.6x om uit te zoomen en vastleggen van de gehele ook.
      4. Pas de laservermogen en detector gevoeligheid voor de optimale detectie van calceïne-groen gelabelde organoids over de achtergrond in te schakelen. Pengat kan worden verhoogd tot 130 urn en de beelduitmiddel kan worden ingesteld op 2.
      5. Stel de bitdiepte op 8 en de framemaat tot 512 x 512.
      6. Gebruik de optie tijdreeksen aan de meettijd, frequentie en intervallen.
        LET OP: Voorgesteld voor regelmatige metingen: 1 uur 10 min interval: cycli = 7 (cyclus 1 is T = 0). Voor het meten van een verminderde zwelling, organoids kunnen worden afgebeeld tot 3 uur.
      7. Gebruik de optie tegel aan de individuele goed posities handmatig te bepalen.
    13. Voeg 100 ul van de FSK en / of VX-770 oplossingen voor de corresponderende putjes, volgens dezelfde volgorde als de meting. Beginnen met het toevoegen van de oplossingen in de eerste afgebeeld goed en ga verder met de beeldvorming bestelling.
    14. Start de meting.
    15. Nadat het experiment is voltooid, sla het bestand op.
  3. Analyse van FIS analysegegevens
    1. Een "organoïde analyse" macro voor gegevensanalyse van de FIS assay met het analyseprogramma per beeldanalyse software dat alle structuren afgebeeld door Alexa-488 nummer herkent en vult de geïdentificeerde structuren voor de toename van totale organoïde ruimte boven de berekening verschillende tijdstippen.
    2. Open het bestand met de verworven beelden in de beeldanalyse-programma.
    3. Selecteer de macro voor organoïde analyse.
    4. <li> Stel de drempel voor de signaal-ruisverhouding in een goed evenwicht op tijdstip 1 en controleer of alle organoïde structuren worden herkend en gevuld.
      1. Aankomst 4-6 putten of alle structuren bestaan ​​op tijdstip 7. erkend Iets wijzigen van de drempel zodat de achtergrondsignalen op tijdstip 7 niet worden herkend als structuren (de specifieke drempel enigszins veranderen tussen experimenten).
    5. Stel de criteria van minimale oppervlaktegrootte van erkende voorwerpen 1000 um 2.
    6. Druk op "analyseren" om te beginnen. De analyse duurt ongeveer 3 minuten, afhankelijk van de gebruikte software.
    7. Wanneer de software is voltooid, gaat u naar "create table" en selecteer de volgende gegevens: zowel nummers (tabel moet toenemen in deze volgorde), tijdstippen, en de totale oppervlakte per putje.
    8. Bestand opslaan als een .xlm naar een spreadsheet programma om te exporteren.
    9. In dit programma, het berekenen van de relatieve toename van de oppervlakte per well door het gebied van tijdstip 1 bij 100%. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) van tijdstippen 1-7 per conditie; de ondergrens van het gebied (Y-waarde) ingesteld op 100%. FSK of geneesmiddel titraties (X-as) uitgezet tegen de AUC (Y-as).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1A toont een representatief verse isolatie van crypten ingesloten op BMM. De crypten zijn afkomstig uit een colorectale biopsie van een CF onderwerp. Gewoonlijk wordt een organoïde gegenereerd uit elke crypt (Figuur 1 A - C). Door het disfunctioneren van het CFTR meeste colon CF organoids niet blaas, maar zijn compact en met uitsteeksels en oculaties (Figuur 2A - 2B). Echter, sommige CF organoïde culturen, vooral bij hoge residuele functie, een paar organoids met cystische vorm (figuur 2C), net als wild-type organoïde culturen (figuur 2D).

Voordat passeren van de organoids voor het uitbreiden van de kweek of zaaien een FIS assay, is het belangrijk dat de organoids een grote grootte met meerdere oculaties, zoals getoond in figuur 3A. Als de organoids zijn klein en zonder numerous oculaties wanneer verwerkt voor passage, wordt de organoïde cultuur negatief beïnvloed. Afhankelijk van de kwaliteit en de activiteit van essentiële groeifactoren zoals EGF, Wnt-3A en Rspo3 de organoids bereikt de gewenste grootte tussen 7 en 12 dagen (Figuur 3A). Na mechanisch afbreken, worden de oculaties verstoord en gebruikt om nieuwe organoids in de volgende passage (figuur 3B) te genereren. Indien voor de organoids invriezen, is het belangrijk dat zij getrypsiniseerd een klein formaat, zoals weergegeven in figuur 3C. Na behandeling met trypsine, worden de organoids plated voor 1 of 2 dagen om ze te laten herstellen van de stress van de manipulatie. Deze stap, tezamen met de geringe omvang van de organoids stand een 98% celopbrengst na ontdooiing (Figuur 4A).

Wanneer de organoids ontdooid, is het belangrijk om ze in hoge dichtheid, dus normaal gesproken, worden ze ontdooid in eenklein volume (Figure4A). Na een of twee dagen kweken, en na te hebben opgemerkt dat de organoids toenemen maat (vergelijk Figuur 4A met Figuur 4B - 4C), de organoids worden verdund in een verhouding van 20-30 organoids per 10 pl BMM, die de juiste dichtheid uit te groeien tot een groter formaat. Als de organoids te worden verdund, kunnen zij de groei vertragen en zelfs differentiëren en sterven. Als de organoids te druk, het gebrek aan ruimte of het verlies van groeifactoren remt eveneens de groei van de organoids en vermindert het aantal oculaties.

De beplating van organoids van levensvatbare kweken met weinig cellulair afval moet leiden tot omstandigheden waarbij> 95% van de organoids zwellen op FSK stimulatie, mits voldoende CFTR-functie aanwezig is (Figuur 5A - 5B). Organoids zwellen in een genotype en drug-afhankelijke manier, zoalsgeïllustreerd door representatieve beelden van organoids met twee F508del allelen (Figuur 5A) en organoids compound-heterozygoot voor F508del en S1251N (figuur 5B), een CFTR gating mutatie in verband met enkele resterende functie.

Zwelling kwantificeren, zijn totaal calceïne-groene oppervlakken geselecteerd voor elk tijdstip en uitgedrukt als percentage van T = 0 (gesteld op 100% Figuur 6A). Puin en kleine, niet-zwelling structuren doorgaans minder dan 5% van het totale oppervlak. Het relatieve oppervlak stijging wordt uitgedrukt per 10 min tijdsinterval en AUC (willekeurige eenheden) metingen worden gegenereerd voor elke omstandigheid (T = 0 tot 60 min, basislijn grenswaarde van 100% Figuur 6B). We vonden AUC de meest robuuste, want het enige variatie in de inleiding van zwelling, en een kromlijnige relatie dan 30-40 min FSK hoog niveau CFTR-functie omvat.

Figuur 6C). Organoids geassocieerd met CFTR restfunctie kan oplopen tot 4500 eenheden AUC na 60 min van 5 uM FSK stimulatie bij afwezigheid van CFTR modulatoren (200-220% oppervlaktegebied van pre-FSK omstandigheden). Organoïde zwelling bereikt een plafond bij ~ 4500 AUC-eenheden, vermoedelijk als gevolg van de fysieke beperkingen van de organoïde structuren, de snelheidsbeperkende invloed van basolaterale ionentransport, en de oprichting van ionen en vloeistof vervoert homeostase onder "gespannen" omstandigheden. FSK kunnen worden getitreerd om het dynamisch bereik van de assay bij deze hoge CFTR residuele niveaus verder uitbreiden restfunctie of zeer effectieve beter kwantificeren Verbinding behandeling (bijvoorbeeld, zoals aangegeven door de hogere activiteit van VX770 op de zwelling van S1251N organoids na stimulatie met lagere concentraties FSK Figuur 6D).

Figuur 1
Figuur 1: Oprichting van CF colorectale organoids van biopsies. (A) Representatieve beelden van geïsoleerde materiaal uit een rectale biopsie nadat ingebed in BMM naar de isolatie dag (passage 0, dag 0). De uitbreiding van de aangegeven crypte wordt getoond op de onderste rechter paneel. (B) Dezelfde crypten werden gevolgd na 7 dagen in kweek (passage 0, dag 7). Uitbreiding van dezelfde crypte die in paneel A getoond. (C) representatief beeld van dezelfde organoïde cultuur 11 dagen nadat ze split (passage 1, dag 11). Schaal bar = 100 urn.
159fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Representatieve beelden van de CF colorectale organoids afgeleid van patiënten met verschillende CFTR-mutaties. Representatieve beelden van de CF colorectale organoids van proefpersonen met F508del / F508del (A), F508del / R117H-7T (B), en F508del / S1251N (C) mutaties. (D) representatief beeld van een colorectale organoïde cultuur van een wild-type CFTR onderwerp. Schaal bar = 100 urn. Deze beelden werden verkregen zonder FSK stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5159 / 55159fig3.jpg "/>
Figuur 3: Het verwerken van CF colon organoids voor onderhoud en test of voor het invriezen. (A) Representatieve beelden van een CF colon organoïde cultuur klaar om te worden verwerkt voor zowel passage (B) of bevriezing (C). (B) Na het mechanisch afbreken, worden stukjes gevormd, waarin de nieuwe organoids de volgende doorgang zal genereren. (C) na behandeling met trypsine, zijn zeer kleine ronde organoids ontstaan alsmede levensvatbaarheid vergemakkelijken tijdens het invriezen. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Het opzetten van een CF colorectale organoïde cultuur uit bevroren organoids. (<strong> A - C) Representatieve beelden van een CF colorectale organoïde cultuur ontdooid op dag 0 (A). Beelden van dezelfde put werden één (B) en twee (C) dagen na. (D - G) Vertegenwoordiger beelden van de verdunning stap in paragraaf 5.9 beschreven. Zodra de organoids naar behoren uit ontdooien (dag 3 na het ontdooien) hersteld zijn, worden ze verdund, zodat ze de ruimte om te groeien (D) hebben. Beelden van dezelfde put werden zes (E), tien (F), en vijftien (C) dagen na ontdooien. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Forskolin-geïnduceerde zwelling van CForganoids. (A en B) Vertegenwoordiger beelden van F508del / F508del (A) of F508del / S1251N (B) colorectale organoids vóór of na 60 min stimulatie met FSK (5 micrometer) in de afwezigheid of aanwezigheid van VX-770 (3 urn]) of VX-770 in combinatie met VX-809 (3 pm). Schaalbalken = 200 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: kwantificeren Forskolin-geïnduceerde zwelling. (A) Representatieve beelden van organoïde gebied selectie door een beeldanalyse software van F508del / S1251N organoids vóór (0 min) en na 60 minuten van de stimulatie met FSK (5 uM) en VX770 (3 uM). Schaalbalken = 200 urn. (B) Represwoordiger beelden van het relatieve oppervlak toename van F508del / F508del of F508del / S1251N organoids gedurende 60 min van FSK (5 pm) stimulatie in afwezigheid of aanwezigheid van VX770 (3 pm) en / of VX809 (3 pm). (C) Oppervlakte onder de curve metingen van de in (B) (T = 60 min, basislijn drempel = 100%) condities. (D) Oppervlakte onder de curve metingen van F508del / F508del of F508del / S1251N organoids bij verschillende concentraties van FSK. Gegevens stellen het gemiddelde ± SD van enkele vertegenwoordiger experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier bieden we een compleet protocol voor de opwekking, expansie, invriezen en ontdooien van menselijke colorectale organoids. Terwijl we de menselijke organoïde culturen enige tijd geleden 17 hebben vastgesteld, is het soms moeilijk gebleken om de technologie in andere labs te vestigen zonder hands-on training. We verwachten dat deze protocollen een dergelijke opleiding zal vervangen.

-Wnt-3A geconditioneerd medium is een van de meest cruciale reagentia om te slagen bij het opzetten en onderhouden van een langdurige organoïde cultuur. Inderdaad, organoïde culturen zou "crash" wanneer ze worden blootgesteld aan Wnt-3A-conditoned medium met een lage activiteit. Aangezien Wnt-3A geconditioneerd medium in-house, zijn er verschillende aspecten waarmee rekening moet worden gehouden bij het genereren van een actief medium. Actieve Wnt-3A is slechts mogelijk in middelgrote hoogwaardige foetaal runderserum (FBS) die de juiste groeisignalen voorziet L cellen en de stabilisatie van hydrofobeWnt-3A moleculen. Wanneer Wnt-3A activiteit laag is (dat wil zeggen, lage TOP / FOP ratio's, zie hieronder), is het meestal de FBS dat het probleem veroorzaakt.

Commerciële recombinant Wnt werkt niet goed, zodat we niet aan het te gebruiken als een positieve controle voor de TOP / FOP Wnt reporter assay. De verhouding tussen TOP / Renilla en FOP / Renilla is een indicatie van Wnt activiteit van het geconditioneerde medium, zodat een goede batch van Wnt-3A geconditioneerd medium geeft een TOP / FOP verhouding hoger dan 25, in vergelijking met de TOP / FOP waarde van de negatieve controle: medium niet blootgesteld aan Wnt-3A-producerende cellen. Recombinant Noggin en R-spondin kan worden vervangen door Noggin en R-spondin geconditioneerd-medium 28, 29.

Het huidige protocol beschrijft ook een functionele test voor de CFTR-FIS assay. We hebben onlangs aangetoond dat de verhouding tussen de CFTR genotype en FIS en hoe dit reflecteert gepubliceerd CFTR genotype-fenotype relaties verkregen uit klinische registries (www.CFTR2.org) 25. Gebruik van deze test werden twee individuen met extreem zeldzame CFTR-mutaties geïdentificeerd waarvan organoids reageerden op Ivacaftor (VX-770) 25. Daarop volgende gebruik van deze geneesmiddelen resulteerde in duidelijke klinische respons, die het belang van de FIS bepaling om specifieke geneesmiddelen overeenkomen met patiënten met zeldzame mutaties in de afwezigheid van klinische onderzoeksgegevens. Essentieel voor de kwantificering van FIS zijn optimale groei en testomstandigheden, alleen uit een beperkt deel van niet-zwellende organoids (gewoonlijk minder dan 5%). Hoge niveaus van vuil leiden tot de onderschatting van zwelling, een groter aandeel niet-levensvatbare, niet-zwelling structuren worden herkend door de beeldanalyse software.

Correlaties tussen in vitro FIS reacties en eerder vastgestelde CFTR-afhankelijke biomarkers (zweet chloride concentratie en INTESTrechtelijke stroommetingen) aan het gepersonaliseerde niveau waren direct aantoonbaar in onze vorige studies 19, 25. Dit ondersteunde het idee dat restfunctie metingen met behulp van FIS op patiënten met CF huidige aanpak als een diagnostische of prognostische marker in een gepersonaliseerde manier kunnen aanvullen. De doorvoer van de FIS assay vergeleken met andere biomarkers van CFTR-functie, zoals zweet chloride-concentratie gemeten in vivo en intestinale stroommetingen in ex vivo rectale biopsies, zorgt voor een betere controle op technische variabiliteit. Het biedt ook een volledig CFTR-afhankelijke uitlezing en een groot dynamisch bereik door een titratie van FSK die nauwkeurig types residuele CFTR-functie.

De FIS test geeft alleen het effect van de individuele genotype voor de variabiliteit van drugdoeltreffendheid, terwijl modulatie van ziekte CF's met meer dan alleen CFTR-functie. voor druG reactie, de test weerspiegelt een potentiële weefselreactie. Hoewel zeer nauwkeurig CFTR meting wordt menselijke variatie in farmacokinetiek niet verwerkt, in tegenstelling tot andere in vivo 7, 8 of direct ex vivo metingen CFTR 32. Zoals eerder besproken, zijn niet CF modifiers (zowel genetische en omgevingsfactoren) ook invloed fenotype, waardoor een discrepantie tussen de in vitro waarnemingen of CFTR biomarkers en klinische fenotype 2. Verder is de identificatie van potentiële reagerende mutaties met behulp van cellijnen 33 geassocieerd met minder impact op patiënten die behoefte hebben aan een rectale biopsie voor de vestiging van organoids krijgen.

Multiple-CFTR targeting drugs zijn momenteel in ontwikkeling 1. Verwacht wordt dat klinische proeven een juiste voorspelling van de klinische werkzaamheid b niet zal toestaanased op CFTR mutatiestatus alleen. Zoals de FIS-test meet CFTR-functie en drugs reactie functioneel, kan de methode bij uitstek om te bepalen welk medicijn het beste werkt voor welke patiënt geworden. FIS test kan ook nuttig zijn voor de identificatie van patiëntengroepen worden opgenomen in registratietesten en voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen modaliteiten. Stimulatie van colorectale organoids plasma vóór en tijdens de behandeling kan verder bijdragen tot functionele hoeveelheden circulerende CFTR modulatoren in bloed mogelijk vergemakkelijken gepersonaliseerde dosering en de selectie van medicijndoseringen in klinische studies 30, 31 kwantificeren. Ten slotte kan FIS nuttig voor een betere basiskennis van CFTR-functie en de interacties met andere -zo ver grotendeels unknown- genetische modifiers van zijn functie zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de HIT-CF-programma van de Nederlandse CF Stichting (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), het Wilhelmina Kinderziekenhuis Research Fund en CZ en Zilverenkruis / Achmea. We willen graag bedanken S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, en G. Berkers (Department of Pediatric Longziekten, Wilhelmina Kinderziekenhuis, UMC Utrecht), en RHJ Houwen (Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, UMC Utrecht) voor het naderen van de patiënten en het krijgen van de biopsieën voor het genereren van een CF Biobank.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4, (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16, (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45, (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67, (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106, (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108, (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363, (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365, (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13, (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2, (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373, (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13, (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165, (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19, (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15, (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8, (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266, (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143, (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48, (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14, (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192, (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11, (3), 237-245 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics