Developmental Biology

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Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

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Abstract

혈관 신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장과 같이 정의, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 면역 세포 및 림프관 및 신경과 조정을 포함한다. 멀티 셀, 멀티 시스템의 상호 작용은 생리 학적으로 관련 환경에서 혈관 신생의 조사를 필요로한다. 시험관 내 세포 배양 모델의 사용은 기계적인 통계를 제공 한 상태 즉, 일반적인 비판은 미세 혈관 네트워크와 연관된 복잡성 요점을 되풀이하지 않는다는 것이다. 이 프로토콜의 목적은 전 배양 된 쥐 장간막 조직에서 혈관 신생을 자극 한 후 그대로 미세 혈관 망의 경과 비교를 할 수있는 능력을 입증하는 것이다. 배양 된 조직은 계층 구조를 유지하는 미세 혈관 네트워크를 포함한다. 면역 표지 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 혈관과 림프관의 존재를 확인한다. 안에ddition는 BSI-렉틴과 조직을 라벨은 이전과 증가 된 모세 혈관의 발아 및 혈관 밀도를 특징으로 혈청 성장 인자의 자극 후 로컬 네트워크 영역의 시간 경과 비교를 할 수 있습니다. 일반적인 세포 배양 모델에 비해,이 방법은 생리 학적으로 관련 미세 혈관 내피 세포 네트워크의 계통 연구 및 조직 특이 적 혈관 형성 약물 평가하는 툴을 제공한다.

Introduction

미세 혈관 망의 성장 및 리모델링 조직 기능의 공통 분모, 상처 치유, 및 여러 병리이며 주요 공정은 기존의 1, 2에서 새로운 혈관의 성장으로 정의 혈관이다. 새로운 혈관을 엔지니어링 또는 혈관 신생에 관여하는 세포 역학의 중요성을 이해 혈관 기초 요법을 설계 조직 중요하다. 그러나이 프로세스는 복잡하다. 이것은 미세 혈관 망의 특정 위치에서 변화 여러 종류의 세포 (즉, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 대식 세포, 줄기 세포) 및 여러 시스템 (림프 네트워크, 신경 네트워크)을 포함 할 수있다. 시험관 내 혈관 신생 모델 (3)에 관련된 다른 셀들 간의 관계를 검사에 엄청난 공헌하지만, 생리 학적 관련성 파묻혀 인해 훼손 될 수있다 제한된 복잡하고 밀접 생체 시나리오를 반영하지 않는다는 사실을 r에. 이러한 한계의 3 차원 배양 시스템을 극복하기 위해 3, 생체 조직의 모델 (4), 마이크로 유체 시스템의 5, 6, 최근 개발되어 소개되었다 7 계산 모델. 그러나, 미세 혈관 손상 네트워크 생체의 혈관 신생을 조사하는 저속 기능이 모델에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 복잡성의 수준과 혈관 신생 연구를위한 새로운 시간 경과 모델의 설립은 혈관 신생을 조절하는 기본 메커니즘을 이해하는 귀중한 도구를 제공하고 치료법을 개선 할 수 있습니다.

손상되지 않은 미세 혈관 네트워크를 통해 혈관 신생의 생체 조사를 가능하게하는 잠재적 인 모델은 쥐 장간막 문화 모델> 8. 최근 연구에서, 우리는 혈액과 림프 미세 혈관 네트워크는 문화 후 가능한 남아 있음을 증명하고있다. 더 중요한 것은, 래트 장간막 배양 모델은 기능적 주연 세포 - 내피 세포 상호 작용, 혈액 및 림프관 내피 세포 연결, 저속 촬상을 조사하는데 사용될 수있다. 본 연구의 목적은 시간 경과 영상 법을위한 우리의 프로토콜을 제공하는 것이다. 우리의 대표적인 결과는 혈청과 혈관의 자극 후 생존을 유지하고 조직 특이 적 혈관 반응뿐만 아니라 내피 세포 추적 연구를 정량화이 방법을 사용 예제를 제공하는 여러 세포 유형을 문서화합니다.

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Protocol

모든 동물 실험 및 절차는 튤 레인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 수술 절차 설정

  1. 오토 클레이브 기기, 수술 소모품 및 수술 이전에 문화 용품. 각각의 쥐에 대한 외과 용품은 다음과 같습니다 : 1 드레이프, 사전 절단 구멍 1 드레이프 (0.5 X 1.5) 중앙에, 거즈 패드, 1 흡수 underpad. 수술 도구는 다음과 같습니다 숫자 10 블레이드 1 메스, 핀셋 2 쌍, 미세 가위를. 1 드레이프, 핀셋 1 쌍, 폴리 카보네이트 필터를 6 웰 플레이트 삽입을 준비 : 문화 용품 등이 있습니다.
  2. 플렉시 글라스 플랫폼 외과 단, 70 % 에탄올 외과 탁상 공간 소독. 멸균 그릇에 사용할 때까지 수술 단계를 유지합니다.
    1. 100 밀리미터 배양 접시의 중앙에 구멍에서 1 약 2 드릴링하여 수술 단계를 만듭니다. 다음, 부드럽게 사포를 사용어떤 날카로운 모서리 및 조직에 대한 제기 표면을 생성하기 위해 구멍의 가장자리에 실리콘 접착제의 레이어를 추가합니다.
    2. 대안 적으로, CAD 소프트웨어를 사용하여 수술 단계를 설계 및 3-D 인쇄 (도 1)로 만든다.
  3. 아래로 멸균 흡수 underpad를 놓고 그 위에 플렉시 글라스 플랫폼을 배치합니다. 흡수성 underpad 옆에 가열 패드에, 미리 잘라 구멍없이 드레이프를 놓습니다.
  4. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) 사전 따뜻한 매체 및 37 ℃로 식염수. 다음 수술 설치에 50 ML 원뿔 튜브 가열 패드와 장소 식염수 꼭대기 별도의 배양 접시에 장소 미디어와 PBS.
  5. 모든 패키지는 모든 재료의 멸균 처리를 보장하기 위해 수술의 시작 이전에 개방되어 있는지 확인합니다. 이 절차에 사용되는 일반적인 도구의 전체 목록이 나열되어 특정 외과 재료 및 도구의 표.

2. Mesentery를 조직 수확

  1. 사용 성인 남성의 Wistar 쥐 (350 ± 25g 6 - 생후 8 주). 다른 균주와 쥐의 나이는 대체 할 수 있습니다.
  2. 케타민 (80 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏ 체중)의 근육 내 주사를 통해 쥐를 마취. 쥐가 반사 응답을 확인하기 위해 발가락 사이에 집어 마취하에 확인; 아무도이 없어야합니다. 이 단말기 절차에 대한 선제 진통제는 필요하지 않습니다.
  3. 복부를 면도와 제모 크림을 사용하여 나머지 머리를 제거합니다. 포비돈 - 요오드 다음 70 % 이소 프로필 알코올로 두 번 복부 피부를 닦아주십시오. 와이프를 들어 외과 수술 부위의 중심에서 시작해야하며, 이전에 멸균 거즈 또는 멸균 면봉 동일한 조각으로 세정 된 영역이 겹치지로서 원형 방식으로 제조 된 영역의 외부로 이동한다. 그런 다음 무균 수술 설정에 동물을 전송하고 플렉시 글라스 작은지면 위에 배치형태.
  4. 흉골 아래에서 일을 시작 장내에서 1.25 절개에 - 메스 블레이드를 사용하여, 0.75에서합니다. 창자 또는 장간막 (피부 1 층, 결합 조직의 1 층 및 근육의 1 층)에 구멍 않도록주의하십시오.
  5. 절개를 통해 사전 컷 구멍이있는 드레이프를 놓고 드레이프 위에 무균 수술 단계를 배치합니다. 절개와 열 정렬합니다 확인하십시오. 찾아 수술 단계의 개구부를 통해 회장을 끌어 멸균 면봉 어플리케이터를 사용합니다.
  6. 면봉 어플리케이터를 사용하여 스테이지를 통해 8 장간막 창 및 창 (그림 1)을 만지지 않도록주의 - 6 당깁니다. 조직은 일반적으로 맹장 근처부터 소장 회장 영역으로부터 수확된다. 솔루션을 물방울에 멸균 주사기를 사용하여 필요에 따라 가온 멸균 생리 식염수와 습기에 노출 조직을 유지합니다.
  7. 펜토 바르 비탈 나트륨의 심장 내 주사를 통해 쥐 (쥐 당 0.2 ml)에 안락사. 저를 제거하기 전에senteric 창, 쥐가 마음을 palpating에 의해 안락사되어 있는지 확인합니다; 맥박이 없어야합니다.
  8. 창을 절단하는 지방 패드 및 미세 가위를 잡기 위해 핀셋을 사용하여 원하는 장간막 조직을 제거합니다. 창 주위에 지방 (2mm)의 테두리를 남겨주세요. 미디어에 한 번 따뜻하게 멸균 PBS에 한 번 조직을 씻으십시오.
  9. 복강에 표면화 회장을 돌아 제도적 지침에 따라 동물 폐기하십시오.

타임 랩스 연구 3. 장간막 조직 문화

  1. 멸균 층류 후드로 전송 멸균 문화 용품 (1.1 절 참조) 조직.
  2. 폴리 카보네이트 필터 멤브레인 위에 각 조직을 전송하는 핀셋을 사용합니다. 지방 패드로 잡아 조직은 혈관의 손상을 방지합니다.
  3. 빠르게 창을 만지지 않도록 조심하면서, 지방 패드를 사용하여 조직을 확산. 6 웰 플레이트의 바닥에 티슈로 삽입 전환과 미디어의 3 ㎖ (그림 1 커버
  4. 최대 5 일 동안 표준 보육 환경의 각 조직과 문화 (5 % CO 2, 37 ° C) 3.3 - 반복 3.2 단계를 반복합니다.

장간막 조직 4. 타임 랩스 영상

  1. 촬상 당일 공액 BSI 렉틴과 각 웰에 용지를 보충하고, 30 분 동안 표준 배양 조건 하에서 배양한다. 렉틴이없는 미디어로 두 번 조직을 씻으십시오. BSI-렉틴의 얼룩은 문화에서 최대 3 일 동안 장간막 조직에 계속 표시됩니다.
  2. 현미경 스테이지에 접시를 전송합니다. 자신의 형태와 네트워크 구조를 기반으로 혈액과 림프 혈관을 확인합니다.
  3. 각 조직에서 원하는 네트워크 영역을 찾아 이미지를 가져 가라. 이미징에주의하십시오같은 지역을 보장하기 위해 위치 이후의 이미지 캡처됩니다. 전동 무대를 사용하는 경우, 좌표를 문서화합니다.
  4. 인큐베이터에 조직을 돌려 원하는 끝 지점까지 문화를 계속합니다. 반복 4.1 단계 - 4.3 원하는 실험 시점에 따라 필요.

5. 조직 Immunolabeling

  1. BSI-렉틴 라벨
    1. 미디어 두 린스 다음 미디어 1시 40분 FITC - 복합 렉틴 (6 웰 플레이트에 웰 당 2.5 mL의 항체 용액) 37 ° C에서 30 분 동안 조직을 품어. 린스를 들어, 미디어를 추가 한 다음 즉시 교체하십시오.
  2. 라이브 / 죽은 라벨링
    1. 1 37 ° C에서 10 분 동안 조직을 품어 : 500 2 MM의 에티 디움 호모 다이머-1 및 1 : 미디어 두 린스 다음 미디어 500 1 ㎜의 칼 세인의 AM (6 웰 플레이트에 웰 당 2.5 mL의 항체 용액).
  3. BSI-렉틴 / NG2 라벨
    1. 현미경에 확산 조직 하락전자 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    2. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    3. 100 토끼 폴리 클로 날 항체 NG2 5 % 정상 염소 혈청 (NGS) 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직을 배양한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    4. 이차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : 100 염소 항 - 토끼 항체 CY2 공역 (GAR-CY2) 5 %를 NGS. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    5. PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어. 린스를 들어, PBS를 추가 한 다음 즉시 교체하십시오.
    6. 슬라이드를 마운트하려면, 위에 50:50 PBS와 조직과 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 커버. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.
  4. LYVE-1 / PECAM 라벨
    1. 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    2. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    3. 200 마우스 모노클 비오틴 CD31 항체와 1 : 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 (100) 토끼 폴리 클로 날 LYVE-1 항체를 PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) + 5 % NGS . PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    4. 500 CY3 접합 스트렙 타비 딘 항체 및 1 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100-GAR CY2 차 항체의 표지의 경우, 1 일 실온에서 시간 동안 조직을 배양한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    5. 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 슬라이드, 커버 조직을 탑재하고 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.
  5. BrdU의 / BSI-렉틴 라벨링
    1. 미디어에 1 ㎎ / ㎖ BrdU의 추가 및 BrdU의 솔루션으로 조직 미디어를 교체합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 품어.
    2. 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    3. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS (3 × 10 분)으로 조직을 씻으십시오.
    4. 37 ° C에서 1 시간 동안 2 M 염산으로 조직 DNA 변성. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)에 조직을 씻으십시오.
    5. PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 모노클로 날 마우스 항 BrdU의 : 차 항체의 표지의 경우, (1)과 실온에서 1 시간 동안 조직을 배양한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    6. 이차 항체 라벨링 1 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : 100 염소 항 - 마우스 Cy3가 접합 된 항체를 PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS의 (GAM-Cy3에 참조). PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    7. 상단에 슬라이드, 커버 조직 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 마운트합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.
  6. BSI-렉틴 / CD11b를 라벨링
    1. 현미경 슬라이드에 조직을 확산 (1-2 조직 / 슬라이드) 및 건조 할 수 있습니다. 지방을 절제하기 위해 단단히 눌러 메스와 여분의 지방을 제거합니다.
    2. -20 ° C에서 30 분 동안 냉 메탄올에서 조직을 고정한다. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    3. 일차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 마우스 항 래트는 CD11b. PBS + 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분)와 조직을 씻으십시오.
    4. 이차 항체를 라벨링 한 실온에서 1 시간 동안 조직 배양한다 : PBS + 0.1 % 사포닌 + 2 % BSA + 5 % NGS 100 GAM-Cy3에. PBS로 조직을 씻으십시오+ 0.1 % 사포닌 (3 × 10 분).
    5. PBS로 두 린스 다음 PBS에서 1시 40분 FITC - 복합 렉틴과 실온에서 30 분 동안 조직을 품어.
    6. 상단에 슬라이드, 커버 조직 50:50 PBS와 글리세롤 솔루션 및 장소 coverslip에 마운트합니다. 매니큐어를 사용하여 슬라이드 가장자리를 밀봉합니다.

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Representative Results

문화 3 일 후, 조직은 쥐 장간막 문화 모델 (그림 2A)의 미세 혈관의 가능성을 입증하는 라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 키트와 함께 표시 하였다. 장간막에 존재하는 세포의 대부분은 미세 혈관 내피 세포에서 세그먼트의 위치에 기초하여 식별 된 배양 가능한 남았다. 내피 세포의 증식은 렉틴 / BrdU의 라벨링 (도 2D)에 의하여 확인 하였다. 따라서 혈관 평활근 세포와 주연 세포 존재 NG2 라벨링 (도 2B)로 확인되었다. LYVE1 및 PECAM에 대한 라벨링은 림프 및 혈액 미세 혈관 네트워크를 분기 파악하고 혈액 내피 세포 표현형 (그림 2C) 림프 유지 확인했다.

이 모델의 시간 경과 기능은 microva을 라벨로 사용 하였다상이한 시점에서 BSI 렉틴과 시간 경과에 따른 네트워크 내에서 동일한 영역을 이미징 scular 네트워크; 이 기능은 조직 특이 적 혈관 반응을 조사에 특히 유용하다. 10 %의 혈청과 미디어의 보충은 자극 3 일 후 강력한 혈관 신생 반응을 일으키는 원인이되었다. 또한, 새로운 선박 세그먼트와 모세관 콩나물은 5 일 자극 (그림 3)에 의해 확인되었다. (그림 4) 전과 자극 후 네트워크 영역의 양적 비교를 위해 허용 된 시간 경과 이미징 방법. 이전의 결과를 확증 9이 대표적인 연구를 들어, 혈관 면적당 혈관의 수 혈관 면적당 모세관 콩나물의 수는 조직 당 4X 화상으로부터 정량 하였다. 혈관 세그먼트 개의 분기점 모세관 콩나물 사이 본 렉틴 양성 혈액 내피 세포의 세그먼트로 정의 된이 종료 블라인드로 정의 된 호스트 용기로부터 유래 세그먼트. 네트워크 지역의 시간 경과 비교도 (그림 6) 내피 세포 세그먼트의 추적 (그림 5) 혈액 / 림프 혈관 잘못된 패턴을 식별 할 수 있었다. 렉틴과 CD11b를 배양 조직의 라벨링은 추가로 리모델링 네트워크에 침입 상주 식세포의 존재 (그림 7)를 확인했다.

그림 1
그림 1. 장간막 창은 수술 단계를 통해 소장을 잡아 당겨 위치했다. 수술 단계는 3-D 인쇄에 의해 설계되었다. 중앙의 타원형 구멍 (A)에 약 2 1에 의해에서입니다. 장간막 창 멤브레인 삽입물의 상부에 확산 된 후, 상기 삽입이 반전하고, 또한 (B)에 투입 하였다. 스케일 바 = 2cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 혈관은 쥐 장간막 문화 모델에서 가능한 남아있다. 배양 후에 수행 라이브 / 죽은 분석은 특히 혈관 (A)을 따라 사균 (적색)로 생균 (녹색)의 높은 비율을 보였다. 장간막 조직은 혈관 (녹색)과 함께 혈관 주위 세포 (적색)을 식별하고, 셀의 다른 유형 후 배양 조직 (B)의 존재 확인, 렉틴과 안티 NG2로 표지 하였다. 조직은 또한 PECAM 대해 표지 된 / LYVE-1의 혈액 림프 (적색) 용기를 식별하기 위해 (녹색), 용기 (C). 미세 혈관 세포 문화 확산을받을 경우 조사하기 위해, 장간막 조직은 렉틴 / 안티 - BrdU의 표지 하였다 . 렉틴 (녹색)로 표지 모세관 세그먼트 여러 세포 증식 (적색) (D) 인 것을 확인 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
쥐의 장간막의 그림 3. 시간 경과 영상은 문화의 과정을 통해 미세 혈관 재 형성을 관찰 할 수 있습니다. 강력한 혈관 신생 반응을 10 % 혈청으로 자극 배양 3 (B) 및 오일 (C) 이후에 관찰되었다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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쥐의 장간막 문화 모델 그림 4. 미세 혈관 네트워크는 이전과 혈관 신생 후 몇 군데 있었다. 10 %의 혈청과 함께 일 0 3 일 (A, B)에 렉틴으로 표시 동일한 네트워크 포스트 자극의 비교는 새로운 선박을 식별합니다. 렉틴은 정체 불명의 간질 세포의 인구 레이블. 혈관 밀도 (C, D) 및 혈관 영역 (E, F) 당 모세관 콩나물의 수를 정량화 각 조직 모두 통계의 증가를 확인했다. 전 C, E) (0 일) 및 조직 당 후 (3 일) 비교. D, F)의 비교가 제 0 일과 사이 짝 스튜던트 t 검정을 이용하여 3 평균 혈관 면적당 용기 세그먼트의 평균 개수 (p <0.0001) 및 콩나물의 평균 개수 (p <0.00001 모두에서 유의 한 차이)를 확인 . 화이트 바는 일 0 나타내고, 검은 색 막대는 하루 3. 가치있는을 나타냅니다ES는 SEM ± 평균입니다. 이 대표적인 분석을 위해, 조직은 13이 쥐에서 수확 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
쥐의 장간막 문화 모델 5도 인근 네트워크에 혈관 섬의 운명과 통합을 조사 사용할 수 있습니다. 연결이 끊긴 내피 세그먼트로 정의 시간 경과 영상, 혈관 섬, 사용, 0 일에 확인하고, 근처의 네트워크에 자신의 접속은 3 일 후 혈관 신생 자극에 의해 확인되었다. 장간막 조직은 bFGF의 (A, B) 및 VEGF / PDFG-BB (C, D)으로 자극 하였다. 빈 화살표는 일 0에 연결이 끊어진 세그먼트를 표시하고 실선 화살표는 networ에 섬 연결을 나타냅니다케이. 화살촉은 혈관 섬 인근 네트워크 사이의 연결의 위치를 ​​나타냅니다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. 시간 경과 이미지는 림프와 혈관 패턴을 관찰 할 수있는 능력을 보여줍니다. 림프 (L)은 혈관 세동맥 (a) 및 정맥 구별 될 수있다 (V) 0 일 (A)의 표시 형태에 기초하여. 10 % 혈청 5 일 후 자극에서 림프 형태 손실 및 혈관 근처의 혈관 신생 혈관 (B)와 통합 된 것으로 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

그림 7
그림 7 대 식세포는 배양 된 쥐의 장간막 조직에 존재 남아있다. 10 % 혈청 3 일간 배양 조직의 렉틴 / CD11b를 공동 라벨링 렉틴 긍정적 인 간질 세포는 대 식세포의 하위 집합하는 것이 좋습니다. (A) BSI-렉틴 라벨의 대표 이미지입니다. 도면의 동일한 필드 (B)는 CD11b 라벨. (C) 병합 된 이미지입니다. 화살표는 공동 라벨의 예를 식별한다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 미세 혈관 망 성장 저속 촬상 용 생체 도구 래트 장간막 배양 모델을 사용하는 방법을 설명합니다. 우리 실험실에서 이전 작업은 1 우리의 모델) 혈관 신생 (8), 2) 림프관 8, 3) 주연 세포 - 내피 세포 상호 작용 8, 4) 항 혈관 약물 검사 (9)의 사용을 설립했다. 여러 시점에서 배양 된 쥐 장간막 조직을 이미징 능력은 조직 - 특이 적 성장 반응과 여러 가지 혈관 신생 자극 중에 세포 - 세포 상호 작용의 추적을 평가하기위한 정량적 인 분석을 제공한다. 혈관 신생 동안에 내피 세포의 증가 된 증식 및 혈관 주위 세포의 존재는 이전 연구와 일치 8 배양 래트 장간막 조직에서 혈관 신생 동안 여러 종류의 세포들 사이의 동적 상호 작용을 확인.

체외 세포 배양 시스템에 비해 아가씨 = "jove_content은">, 쥐 장간막 문화 모델은 고유합니다. 대조적으로 콜라겐 겔 10 대동맥 세그먼트에서 혈관 신생 발아을 연구하기 위해 설립 된 대동맥 고리 분석을 고려하십시오. 대동맥 고리에 돋아하는 여러 세포 유형을 포함하는 동안, 모세관 콩나물은 생체 내 시나리오는 매우 다르다 대동맥의 적출 세그먼트에서 성장한다. 뇌 슬라이스 모델은 다른 생체 모델이지만, 림프관의 공극이다. 또한, 뇌 조각 모델은 이전과 혈관 신생 자극 (11) 후 시간 경과 이미징 할 수있는 것으로 표시되지 않았습니다. 최근 도입 된 또 다른 생체 모델 망막 배양 모델이다. 망막 모델의 장점은 그대로 microvascu 혈관에서 발생한다는 것이다조직 (12, 13) 내의 LAR 네트워크. 이 모델의 경우, GFP 유전자 변형 마우스 변종은 시간이 지남에 돋아 모세관을 관찰 할 수 있도록 사용할 수 있지만, 우리의 모델에서 사용으로 불행하게도, 마우스 장간막은 쥐 장간막의 GFP 형질 전환 마우스 장간막 대체를 제거 무혈성 (14)이다. 더욱이, 우리는 배양 래트 장간막 조직의 간단한 렉틴 라벨링 다른 시점에서 생체 내 모델 다른 비교 네트워크 성장을 결정하기에 충분한 것으로 보여, 우리의 모델은 혈액 및 림프관 내피 세포 모두를 동시에 관측 가능하다.

BSI-렉틴은 미세 혈관 네트워크를 시각화하고 혈관 반응을 검출하기 위해 본 논문에 사용되었다. 렉틴은 내피 세포에 당 단백질에 결합 내피 antib에 비해 인해 짧은 배양 시간에이 프로토콜 선정 된 단백질 구조ODY 마커. 렉틴 항체보다 저렴하며 고정 요구하지 않는다; 또한 쉽게 배지에 혼합 배양 기간이 종료 된 후 신선한 매체로 대체 될 수있다. 앞으로의 연구는 혈관 신생 과정에서 렉틴 라벨링 기술의 잠재적 효과를 규명하는 데 필요한 반면, 우리의 대표적인 결과 (도 4)을 보여 강력한 혈관 신생을 유도 할 수 있으며, 이전의 연구 9 렉틴 표시된 네트워크에서의 혈관 신생을 타겟팅로 억제 할 수 있음을 입증하는지 혈관 내피 성장 인자 (VEGF). 항체 마커는 잠재적으로보다 구체적인 마커에 대한 필요가있을 때 다른 표시 방식으로 사용 또는 수 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 신경 같은 미세 혈관의 네트워크에 존재하는 다른 유형의 세포를 조사 할 필요가있을 때. 시각화 셀 또 다른 잠재적 인 방법은, 유전자 형질 전환 될 것이다.

시간 경과 장간막 쥐 모델을 사용하는 장점은이 프로토콜의 대표적인 결과에서 강조되고있다. 전과 치료 후 이미지의 비교가 아닌 쌍 통계 분석에 영향을 미치는 변화의 문제를 줄일 수 있습니다. 이식편 특정 반응 용기 밀도의 20 % 내지 233 % 증가에서 새싹 및 밀도의 40 % 내지 3,500 % 증가로 변화. 본 변형 예에 대한 특정 원인 불명 남아 있지만, 시간이 지남에 따라 동일한 조직의 성장을 측정하는 조직 특이 적 반응을 확인하는 기능을 제시한다.

미세 혈관 성장 동안 상이한 시점에서 화상의 비교 분석은 또한 혈관 내피 세포의 추적을 허용한다. 예를 들어, 우리의 실험실 인근 네트워크 (15, 16)에서 분리되어 미세 혈관 네트워크 부근의 내피 세포 세그먼트와 같은 혈관 섬을 확인했습니다. 이 섬은 인근 networ에 연결되었는지 확인하려면혈관 신생 자극에 반응 K, 래트 장간막 배양 모델을 사용 하였다. 도 5에 도시 바와 같이, 혈관 섬은 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF를) 또는 VEGF 플러스 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)와 조직을 자극 한 후 추적했다. 우리는 또한 (데이터가 여기에 표시되지 않음)과 유사한 결과를 후 혈청 자극을 보여 주었다. 혈관 신생 자극 후, 원래 끊긴 혈관 섬 인근 네트워크 접속을 발견 할 수있다.

래트 장간막 배양 모델의 다른 잠재적 인 애플리케이션은 림프계 혈관 및 각 내피 세포 및 간질 세포의 운명 추적 간의 관계를 조사 할 수있는 기능을 활용할 수있다. 전이 모델의 10 % 혈청 자극 후 같은 미세 혈관 네트워크의 시간 경과 이미지는 잠재적 인 림프 - 투 - 혈관 통합 (그림 6)의 예를 제공했다. 자극, 림프 및 혈액 VESS 전ELS는 용기 형태에 따라 구분 하였다. 자극 후, 혈관 정체성 대 림프 덜 분명 해졌다. 림프 / 혈액 내피 세포 상호 작용의 가능성이 PECAM의 관찰에 의해 지원됩니다 PECAM와 연결 + / LYVE-1 혈액 내피 세포 + / LYVE-1 + 림프 내피 세포 (여기에 표시되지 않은 데이터). 이러한 관찰은 림프 / 혈액 내피 세포의 가소성을 조사하는 래트 장간막 배양 모델의 사용을 지원한다. 도 6a는 명백 간질 세포 렉틴 라벨링을 강조한다. 이 라벨은 일관성 및 조직으로부터 조직 균질이지만, 내인성 조직 상주 세포의 존재를 강조한다. 배양 된 조직의 CD11b를 라벨 (그림 7)이 렉틴 양성 간질 세포는 대 식세포의 하위 집합이 될 수 있음을 시사한다. 대 식세포 참여의 새로운 관심 혈관 신생 (20)에서의 추가 힘 주어모델은 시간이 지남에 대식 역 동성을 추적하는 그 사용이 될 수 있습니다.

많은 다른 생체 모델 같이 래트 장간막 배양 모델에서 혈관 형성을 연구의 전류 제한은 혈류의 부족이다. 혈류로 인한 전단 응력은 내피 세포 증식의 형태뿐만 아니라, 혈관 (17), (18, 19)의 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 그림 4에 제시된 대표적인 결과를 들어, 전단 응력의 부재는 단독으로 배양 된 네트워크에서 혈관 신생 반응을 유도하기에 충분했을 수 있습니다. 그러나, 우리는 쥐 장간막 문화 모델 (8)의 특성을 우리의 초기 출판을 기반으로 알고, 그 미디어의 보충의 원인은 형 미디어 대 혈관 신생을 증가했다. 배양 된 미세 혈관 네트워크 내에서 흐름을 통합하는 미래 연구는 의심 할 여지없이 더 밀접하게 모방하는 데 필요한생체 시나리오입니다. 통합 흐름에 대한 잠재적 접근 방식은 네트워크 공급하는 동맥의 삽관 또는 장간막 윈도우의 지방 테두리 내에서 더 상류 동맥도 삽관을 포함 할 수 있습니다. 그러나, 유동의 부족에도 불구하고, 여러 종류의 세포의 생존, 혈관 신생 동안 혈액 림프 미세 혈관 망 및 세포 증식의 유지 시험 관내 모델에 기초하여 셀에 비해 복잡도 래트 장간막 배양 모델의 상대적 증가 된 레벨을 지원한다.

결론적으로,이 프로토콜은 그대로 미세 혈관 망에서 혈관 신생 반응을 이미징하는 간단한 생체 재현 방법을 설명한다. 이러한 방법은 네트워크 환경 내의 특정 위치에서 혈관 세포 역학을 평가하기위한 시험 관내 모델에 기초하여 셀에 대한 대안을 제공한다. 이 방법은 또한 혈관, 림프관과 혈액 / 림프계 조사를위한 새로운 도구를 제공합니다 잘못을-후두둑동시에 닝.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

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References

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