Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ангиогенез, определяемый как рост новых кровеносных сосудов из уже существующих судов, включает в себя эндотелиальные клетки, перицитов, гладкие мышечные клетки, клетки иммунной системы, а также координацию с лимфатическими сосудами и нервами. Нескольких ячеек, многоступенчатая система взаимодействия требует исследование ангиогенеза в физиологически соответствующей среде. Таким образом, в то время как использование в пробирке моделей клеточных культур обеспечили механистических понимание, общая критика в том , что они не перепросматривать сложности , связанные с сетью микрососудов. Целью данного протокола является демонстрация возможности сделать покадровой сравнения неповрежденных микрососудистых сетей до и после стимуляции ангиогенеза в культуре тканей крыс брыжейки. Культивированный ткани содержат микрососудистых сетей, которые поддерживают их иерархию. Иммуногистохимическое маркировка подтверждает наличие эндотелиальных клеток, клеток гладкой мускулатуры, перицитов, кровеносных сосудов и лимфатических сосудов. Вddition, мечения тканей с BSI-лектинов позволяет сравнение замедленную регионов локальной сети до и после сыворотки или фактора роста стимуляции характеризуется повышенной капиллярной всходов и плотности сосудов. По сравнению с моделями общих клеточных культур, этот метод обеспечивает инструмент для исследования эндотелиальных клеток линии дифференцировки и ткани специфического ангиогенного оценки лекарственных средств в физиологически соответствующих капиллярных сетей.

Introduction

Рост сети микрососудов и ремоделирования являются общие знаменатели для функции тканей, заживление ран, а также несколько патологий и ключевой процесс ангиогенеза, определяется как рост новых кровеносных сосудов из существующих 1, 2. Для тканевой инженерии новых сосудов или проектирование ангиогенные терапии на основе, понимая важность клеточной динамики, вовлеченных в ангиогенез имеет решающее значение. Тем не менее, этот процесс является сложным. Он может варьироваться в определенных местах в пределах сети микрососудов и включает в себя несколько типов клеток (т.е. эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц, перицитов, макрофаги, стволовые клетки) и несколько систем (лимфатическую сети и нейронных сетей). Хотя модели в пробирке внесли огромный вклад в изучение взаимосвязи между различными клетками , участвующими в ангиогенезе 3, их физиологическое значение может быть подорвана из - за Thei г ограниченную сложность и тот факт , что они не точно отражают сценарий в естественных условиях. Для преодоления этих ограничений, трехмерных систем культивирования 3, исключая виво модели ткани 4, микрофлюидальные системы 5, 6, и вычислительные модели 7 были разработаны и внедрены в последние годы. Тем не менее, все еще существует необходимость в модели с возможностью покадровой для исследования ангиогенеза в неповрежденных микрососудистых сетях бывших естественных условиях. Создание новых моделей покадровой для изучения ангиогенеза с этим уровнем сложности обеспечит бесценным инструментом, чтобы понять основные механизмы, регулирующие ангиогенез и улучшить методы лечения.

Потенциальная модель , которая позволяет ех естественных условиях исследование ангиогенеза через неповрежденной сети микрососудов является брыжейки модель культуры крысы> 8. В недавней работе мы показали, что в крови и лимфатической микрососудистых сети остаются жизнеспособными после культивирования. Что еще более важно, брыжейки модель культуры крысы могут быть использованы для исследования функциональных перицитов-эндотелиальной взаимодействия клеток, крови и лимфатической соединений эндотелиальных клеток и покадровой обработки изображений. Целью данной работы является предоставление нашего протокола для метода формирования изображений в заданный промежуток времени. Наши показательные результаты документирования нескольких типов клеток, которые остаются жизнеспособными после стимуляции ангиогенеза с сывороткой и предлагают примеры использования этого метода для количественной оценки тканей специфические ангиогенные ответов, а также исследования отслеживания клеток эндотелия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных и процедуры были одобрены Institutional Animal Care и использования Комитетом по Tulane университета (IACUC) путем.

1. Хирургическая процедура настройки

  1. Автоклавы инструменты, хирургические принадлежности и расходные материалы культуры до операции. Хирургические расходные материалы для каждой крысы включают в себя: 1 драп, 1 драпировку с предварительно вырезанное отверстие (0,5 х 1,5 дюйма) в центре, марлевые тампоны и 1 впитывающего лежащей снизу. Хирургические инструменты включают в себя: 1 скальпель с номером 10 лезвия, 2 пары пинцет и пару тонких ножниц. принадлежности культуры включают в себя: 1 простыня, 1 пара пинцета, и подготовили вставки пластины 6-а с поликарбонатом фильтрами.
  2. Стерилизовать плексигласа платформу, хирургический этап и хирургическая Benchtop пространство с 70% этанола. Держите хирургический этап в стерильной миске до использования.
    1. Создание хирургической стадии путем бурения приблизительно 2 в 1 с в отверстие в центре культуры блюдо 100 мм. Затем, используйте наждачную бумагу для сглаживаниялюбые острые края и добавить слой силиконового клея к краям в отверстие, чтобы создать приподнятую поверхность для тканей.
    2. В качестве альтернативы, разработать хирургический этап с использованием программного обеспечения САПР и сделать с помощью 3-D печати (рисунок 1).
  3. Поместите стерильный абсорбирующий вниз и лежащей снизу лежал оргстекло платформу на вершине. Поместите драпировку, без предварительно вырезанное отверстие, через нагретую площадку рядом с абсорбирующим лежащей снизу.
  4. Предварительно теплой стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) средства массовой информации и физиологический раствор до 37 ° С. Место СМИ и PBS в отдельной посуде культуры на вершине грелку и место физиологического раствора в мл коническую трубку 50, рядом с хирургической установки.
  5. Убедитесь, что все пакеты открыты до начала операции, чтобы обеспечить стерильную обработку всех материалов. Полный перечень общих инструментов, используемых в данной процедуре, перечислены в разделе Таблица конкретных хирургических материалов и инструментов.

2. Mesenterу тканей Уборочная

  1. Использование взрослых самцов крыс Wistar (350 ± 25 г; 6 - 8-недельного возраста). Другие штаммы и возраст крыс могут быть замещены.
  2. Обезболить крысу через внутримышечной инъекции кетамина (80 мг / кг массы тела) и ксилазина (8 мг / кг массы тела). Подтвердите крыса находится под наркозом, зажимая между пальцами, чтобы проверить наличие рефлекторной реакции; не должно быть ни одного. Преимущественное обезболивание для этого терминала процедуры не требуется.
  3. Бритье брюшной области и удалить оставшиеся волосы с помощью крема для удаления волос. Протрите кожи живота дважды с 70% изопропилового спирта с последующим повидон-йода. Для салфетками хирург должен начаться в центре места операции и перейти к внешней стороне на подготовленную поверхность в круговом образом, чтобы они не перекрывают друг друга областей, которые были предварительно вымыты с той же самой части стерильной марли или стерильного ватного тампона. Затем перенесите животное в стерильном хирургической установки и место на вершине плексигласа Platформа.
  4. Используя лезвие скальпеля, сделать 0,75 - 1,25 в разрез в кишечнике, начиная с 1 в ниже грудины. Будьте осторожны, чтобы не проколоть кишечника или брыжейки (1 слой кожи, 1 слой соединительной ткани, а также 1 слой мышц).
  5. Поместите драпировку с предварительно вырезанное отверстие через надрез и поместить стерильный хирургический этап на вершине салфетке. Убедитесь, что открытие совпадет с разрезом. Используйте стерильные ватные наконечником аппликаторы, чтобы найти и вытащить подвздошной через отверстие хирургической стадии.
  6. Вытащите 6 - 8 брыжейки окна через стадию с использованием ватным аппликаторы, и будьте осторожны , чтобы не коснуться окна (Рисунок 1). Ткани обычно собирают из подвздошной области тонкой кишки, начиная около слепой кишки. Держите открытые ткани влажной с подогреваемой стерильным физиологическим раствором по мере необходимости с помощью стерильного шприца капают раствор.
  7. Эвтаназии крыс путем инъекции внутрисердечной пентобарбитала натрия (0,2 мл на крысу). Перед удалением меняsenteric окна, убедитесь, что крыса эвтаназии пальпации сердце; не должно быть никакого пульса.
  8. Удалить нужные ткани брыжейки с помощью пинцета, чтобы захватить жировой ткани и тонкие ножницы, чтобы вырезать окно. Оставьте границу жира (2 мм) вокруг окна. Вымойте ткани раз в подогретой стерильной PBS и один раз в средствах массовой информации.
  9. Возвращение экстериоризированного подвздошной в брюшную полость и распоряжаться животного в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

3. Брыжейка культуры ткани для ЗАМЕДЛЕННАЯ исследований

  1. Передача автоклавного поставок культуры (смотри раздел 1.1) и ткани в стерильный ламинарный.
  2. Используйте пинцет для передачи каждой ткани поверх мембраны из поликарбоната фильтра. Захват тканей жировой ткани, чтобы не повредить сосудистую сеть.
  3. Быстро распространение ткани с помощью жировой ткани, соблюдая осторожность, чтобы не коснуться окна. Инверсия вставку с тканью в нижней части 6-луночного планшета и накрыть 3 мл среды (рисунок 1
  4. Повторите шаги 3.2 - 3.3 для каждой ткани и культуры в стандартных условиях инкубатора (5% СО 2, 37 ° С) в течение до 5 дней.

4. Замедленная Визуализация брыжейки ткани

  1. В день съемки, дополняют средства массовой информации в каждую лунку с сопряженными BSI-лектин и инкубировать в стандартных условиях культивирования в течение 30 мин. Вымойте ткани дважды лектин свободных средств массовой информации. BSI-лектин пятно остается видимым на брыжейки ткани до 3-х дней в культуре.
  2. Перенести пластину на предметный столик микроскопа. Выявление кровеносных и лимфатических сосудов, основанные на их морфологии и структуры сети.
  3. Найдите нужную область сети на каждой ткани и делать снимки. Примите к сведению изображенияместо, чтобы обеспечить тот же регион будет захвачен для последующих изображений. При использовании моторизованного столика, документировать координаты.
  4. Возвращение тканей в инкубаторе и не продолжают культуру до желаемой конечной точки. Повторите шаги 4.1 - 4.3 по мере необходимости в зависимости от требуемых экспериментальных точек времени.

5. Ткань иммунноокрашивания

  1. BSI-лектин Этикетировочное
    1. Инкубируйте ткани в течение 30 мин при температуре 37 ° С с 1:40 ФИТЦ-конъюгированного лектина в средах (2,5 мл раствора антител на лунку в 6-луночный планшет) с последующими двумя полосканий со средствами массовой информации. Для полосканий, добавить носитель, а затем немедленно заменить.
  2. Live / Dead Этикетировочное
    1. Инкубируйте ткани в течение 10 мин при температуре 37 ° С с 1: 500 2 мМ этидий гомодимер-1 и 1: 500 1 мМ кальцеина AM в среде (2,5 мл раствора антител на лунку в 6-луночный планшет) с последующими двумя полосканий со средствами массовой информации.
  3. BSI-лектин / NG2 Этикетировочное
    1. Спред ткани на микроскоп соскользнуле (1 - 2 ткани / слайд) и дайте высохнуть. Удалить лишний жир с помощью скальпеля, нажав вниз твердо акцизным жир.
    2. Закрепить ткани в холодном метаноле в течение 30 мин при -20 ° С. Промыть тканей с PBS (3 х 10 мин).
    3. Для получения первичной маркировки антител инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 100 кроличьего поликлонального антитела NG2 и 5% сыворотки нормальной козьей (NGS). Промыть тканей с PBS (3 х 10 мин).
    4. Для вторичной маркировки антител инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 100 козы к антителам кролика cy2-конъюгированные антитела (GAR-cy2) и 5% NGS. Промыть тканей с PBS (3 х 10 мин).
    5. Инкубируйте ткани в течение 30 мин при комнатной температуре с 1:40 ФИТЦ-конъюгированного лектина в PBS с последующей двух промывок PBS. Для полосканий, добавьте PBS, а затем немедленно заменить.
    6. Для крепления слайдов, охватывают ткани с 50:50 PBS и растворе глицерина и место покровное на вершине. Уплотнение скользящие края, используя лак для ногтей.
  4. LYVE-1 / РЕСАМ Этикетировочное
    1. Спред ткани на предметное стекло (1 - 2 ткани / слайд) и дайте высохнуть. Удалить лишний жир с помощью скальпеля, нажав вниз твердо акцизным жир.
    2. Закрепить ткани в холодном метаноле в течение 30 мин при -20 ° С. Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    3. Для получения первичной маркировки антител инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 200 мышиной моноклонального CD31 антитела и 1: 100 кроличьего поликлонального LYVE-1 антитела в PBS + 0,1% сапонина + 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 5% NGS , Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    4. Для вторичной маркировки антител, инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 500 Cy-3 конъюгированного стрептавидина антитела и 1: 100 GAR-CY2 в PBS + 0,1% сапонина + 2% БСА + 5% NGS. Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    5. Для крепления слайдов, покровных тканей с 50:50 PBS и растворе глицерина и помещают покровное на вершине. Уплотнение скользящие края, используя лак для ногтей.
  5. BrdU / BSI-лектин Этикетировочное
    1. Добавить 1 мг / мл BrdU к средствам массовой информации и заменить ткани носитель с BrdU раствором. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С.
    2. Спред ткани на предметное стекло (1 - 2 ткани / слайд) и дайте высохнуть. Удалить лишний жир с помощью скальпеля, нажав вниз твердо акцизным жир.
    3. Закрепить ткани в холодном метаноле в течение 30 мин при -20 ° С. Промыть тканей с PBS (3 х 10 мин).
    4. Денатурации ДНК ткани в 2 М HCl в течение 1 ч при 37 ° С. Мытье ткани в PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    5. Для получения первичной маркировки антител, инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 100 мышиное моноклональное анти-BrdU в PBS + 0,1% сапонина + 2% БСА + 5% NGS. Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    6. Для вторичной маркировки антител, инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 100 козьего анти-мышиного Cy-3 антитела, конъюгированного (GAM-Су3) в PBS + 0,1% сапонина + 2% БСА + 5% NGS. Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    7. Для крепления слайдов, покровных тканей с 50:50 PBS и растворе глицерина и место покровное на вершине. Уплотнение скользящие края, используя лак для ногтей.
  6. BSI-лектин / маркировка CD11b
    1. Спред ткани на предметное стекло (1 - 2 ткани / слайд) и дайте высохнуть. Удалить лишний жир с помощью скальпеля, нажав вниз твердо акцизным жир.
    2. Закрепить ткани в холодном метаноле в течение 30 мин при -20 ° С. Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    3. Для получения первичной маркировки антител инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 100 мышиное анти-крысиного CD11b в PBS + 0,1% сапонина + 2% БСА + 5% NGS. Промыть тканей с PBS + 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    4. Для вторичной маркировки антител инкубировать ткани в течение 1 ч при комнатной температуре с 1: 100 GAM-Су3 в PBS + 0,1% сапонина + 2% БСА + 5% NGS. Вымойте тканей с PBS+ 0,1% сапонина (3 х 10 мин).
    5. Инкубируйте ткани в течение 30 мин при комнатной температуре с 1:40 ФИТЦ-конъюгированного лектина в PBS с последующей двух промывок PBS.
    6. Для крепления слайдов, покровных тканей с 50:50 PBS и растворе глицерина и место покровное на вершине. Уплотнение скользящие края, используя лак для ногтей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После 3 -х дней в культуре ткани были помечены живой / мертвой комплекту жизнеспособность / цитотоксичность , чтобы продемонстрировать жизнеспособность микрососудов у крыс брыжейки модели культуры (фиг.2А). Большинство клеток, присутствующих в брыжейки остаются жизнеспособными в культуре, где эндотелиальные клетки были определены на основании их расположения в капиллярных сегментах. Пролиферации эндотелиальных клеток была также подтверждена лектин / BrdU маркировки (рис 2D). Гладкая мышечных клеток и присутствие перицитов вдоль сосудов было подтверждено NG2 маркировки (рис 2B). Этикетировочное для LYVE1 и PECAM идентифицированных разветвленности лимфатическую и микрососудистых сетей в крови и подтвердили поддерживать лимфатическую по сравнению с эндотелиальной клетки крови фенотипа (рис 2C).

Замедленной особенностью этой модели была использована мечения microvascular сети с BSI-лектина в различные моменты времени и с изображениями и ту же область в пределах сети с течением времени; эта возможность является особенно ценным для исследования ткани кровеносных сосудов конкретных ответов. Добавок среды с 10% сыворотки вызвала надежный ангиогенный ответ после 3-х дней стимуляции. Кроме того, новые сегменты сосудов и капиллярных ростки были идентифицированы 5 -й день стимуляции (рисунок 3). Метод покадровой обработки изображений позволил для количественного сравнения участков сети до и после стимуляции (рисунок 4). Для этого представительного исследования, которое подтверждает наши предыдущие результаты 9, количество сосудов в области сосудистой и количество капиллярных проростков в области сосудистой количественно определяли с одного 4X на изображении ткани. сегменты кровеносного сосуда были определены как лектин-позитивных сегментов эндотелиальных клеток крови, присутствующих между двумя точками ветвления и капиллярные ростки были определены как слепому, завершившийся сегменты, происходящие из-хозяина судна. Сравнение Покадровый сетевых регионов также включено отслеживание сегментов эндотелиальных клеток (рисунок 5) и идентификация крови / лимфатический сосуд неправильному кучность (рисунок 6). Маркировку культивируемых тканей для лектин и CD11b дополнительно подтвердили наличие интерстициальных макрофагов (рис 7) в сетях ремоделирования.

Рисунок 1
Рисунок 1. Брыжеечные окна были расположены, вытащив тонкую кишку через хирургической стадии. Хирургический этап был разработан и сделан 3-D печати. Эллиптический отверстие в центре приблизительно 2 в 1 с на стадии (а). Мезентериальные окна затем были распространены на верхней части мембраны вставки, и вставка переворачивали и помещали в лунку (B). Шкала бар = 2 см.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Кровеносные сосуды сохраняют жизнеспособность в модели культуры крысы брыжейки. Живой / мертвый анализ выполняется после того, как культуры показал высокое отношение живых клеток (зеленые) мертвые клетки (красный) , специально вдоль кровеносных сосудов (А). Ткани брыжейки были помечены лектин и анти-NG2, для идентификации перицитов (красный) наряду с судов (зеленый) и подтвердить , что различные типы клеток присутствуют в тканях посткультура (B). Тканей были также помечены против PECAM / LYVE-1 для выявления крови (красные) сосуды из лимфатической (зеленый) сосуды (C). Для того, чтобы исследовать, если микрососудистых клетки подвергаются пролиферации в культуре, ткани брыжейки метили лектин / анти-BrdU , На капиллярных сегментов , помеченных лектина (зеленый), несколько ячеек были подтверждены быть пролиферативная (красный) (D). Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Время покадровой визуализации брыжейки крысы позволяет наблюдать микрососудов ремоделирования в течение культуры. Надежный ангиогенный ответ наблюдался после того, как 3 (В) и 5 дней (С) культуры с 10% стимуляции сывороткой. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Файлы / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Микрососудистые сети в модели культуры крысы брыжейки были обследованы до и после того, как ангиогенез. Сравнение той же сети , помеченный лектина в день 0 и 3 -й день (A, B) после стимуляции с 10% сыворотки выявляет новые сосуды. Лектин также этикетки популяцию неопознанных интерстициальных клеток. Количественное определение плотности сосудов (C, D) , а количество капиллярных проростков на сосудистую область (Е, F) , подтвердили увеличение обоих показателей для каждой ткани. С, Е) до (день 0) и после того, как (день 3) сравнения на ткани. D, F) Сравнение между днем 0 и день 3 средние с использованием парного критерия Стьюдента подтвердили значительную разницу в обоих среднее число сегментов сосудов (р <0,0001) и среднее число побегов (р <0,00001) в расчете на область сосудистой , Белые столбики представляют день 0, а черные полосы представляют День 3. Valuэс представляют собой средние значения ± SEM. Для этого репрезентативного анализа, 13 ткани собирали из 2-х крыс. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Модель культуры брыжейки крысы могут быть использованы для исследования сосудов остров судьбы и включение в близлежащих сетей. Использование покадровой обработки изображений, сосудистых островов, определяемый как отключенных эндотелиальных сегменты, были определены в день 0 и их подключение к близлежащей сети было подтверждено 3-й день после стимуляции развитие кровеносных сосудов. Ткани брыжейки стимулировали bFGF (A, B) и VEGF / PDFG-BB (C, D). Полые стрелки показывают разъединенные сегменты на 0-й день и сплошные стрелки представляют собой островную соединение с Networк. Наконечники указывают расположение соединений между сосудистым островом и близлежащей сети. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Время покадровой изображения демонстрируют способность наблюдать лимфатическую и кровеносных сосудов кучность. Лимфатической (л) суда можно отличить от артериол (а) и венул (v) на основе маркировки морфологии на день 0 (A). На 5 -й день после стимуляции с 10% сыворотки, лимфатический морфология теряется и сосуды , по всей видимости интегрировали с близлежащим ангиогенных кровеносных сосудов (В). Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Макрофаги остаются присутствуют в культивируемых тканях крыс брыжейки. Лектин / CD11b совместно этикетирование тканей, культивированных в течение 3-х дней с 10% сыворотки позволяют предположить, что лектин позитивные интерстициальные клетки представляют собой подмножество макрофагов. (А) представитель изображения маркировки BSI-лектинов. (B) CD11b маркировки в том же поле зрения. (C) объединенное изображение. Стрелки определить примеры совместного маркировки. Масштабные полоски = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол документов метод с использованием модели культуры крысы брыжейки в качестве инструмента для экс естественных условиях покадровой визуализации роста микрососудистой сети. Предыдущая работа в нашей лаборатории установила использование нашей модели 1) ангиогенеза 8, 2) лимфангиогенез 8, 3) перицитов-эндотелиальной взаимодействий клеток 8, и 4) антиангиогенная тестирования на наркотики 9. Способность к визуализации культивируемых тканей крысы брыжейки в различные моменты времени предлагает количественный анализ для оценки тканеспецифические ответов роста и отслеживание межклеточных взаимодействий при различных ангиогенных стимулов. Увеличение пролиферации эндотелиальных клеток во время ангиогенеза и наличие перицитах согласуются с нашей предыдущей работе 8 и проверки динамических взаимодействий между несколькими типами клеток во время ангиогенеза в культивируемых тканях крыс брыжейки.

в лабораторных системах клеточных культур, брыжейки модель культуры крыса является уникальным , поскольку рост происходит в интактной, реальной сети микрососудов. Рассмотрим в отличие от аортального кольца анализа, который был создан для изучения ангиогенеза из сегментов аорты в коллагеновый гель 10. В то время как прорастают аортального кольца включает в себя несколько типов клеток, капиллярные ростки вырастают из отделенных сегментов аорты, которая очень отличается от сценария в естественных условиях. Модель среза мозга еще одна бывшая модель естественных условиях, но она лишена лимфатических сосудов. Кроме того, модель срез мозга не было показано , чтобы иметь возможность покадровой обработки изображений до и после стимуляции ангиогенного 11. Другой бывший естественных условиях модель , которая была недавно введена в сетчатка модель культуры. Преимуществом модели является то, что сетчатка ангиогенез происходит от интактной microvascuLAR сети внутри ткани 12, 13. Для этих моделей, GFP-трансгенных линий мышей могут быть использованы , чтобы иметь возможность наблюдать капиллярную всходов в течение долгого времени, но , к сожалению, брыжейка мышь бессосудистая 14, устраняя GFP-трансгенные мыши брыжейки замещение брыжейки крысы, как и используемый в нашей модели. Кроме того, мы покажем , что простой лектин маркировки крысы брыжейки тканей в культуре достаточно , чтобы определить рост сети в различные моменты времени и в сравнении с другими моделями ех естественных условиях, наша модель позволяет одновременное наблюдение как кровеносных и лимфатических эндотелиальных клеток.

BSI-лектин был использован в данной работе для визуализации микрососудов сетей и выявления ангиогенные ответов. Лектин представляет собой структуру белка, который связывается с гликопротеинов на эндотелиальных клетках и был выбран для этого протокола из-за его короткого времени инкубации по сравнению с эндотелиальной АнтибOdy маркеры. Лектин дешевле, чем антитела, и она не требует фиксации; он также может быть легко смешаны в культуральной среде и заменяли свежей средой после окончания периода инкубации. В то время как будущие исследования необходимы , чтобы выяснить потенциальные последствия метода лектин маркировки на процессе ангиогенеза, наши репрезентативные результаты (рисунок 4) показывают , что прочный ангиогенез может быть вызван и предыдущая работа 9 показывает , что ангиогенез в лектиновых маркированы сетях может быть подавлена с помощью таргетинга фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Антитела маркеры потенциально могут быть использованы в качестве альтернативного маркировки подход, когда существует потребность в более специфических маркеров, или когда возникает необходимость исследовать другие типы клеток, которые присутствуют в микрососудистых сетях, таких как клетки гладких мышц, перицитов и нервов. Другой потенциальный метод для визуализации клеток будет трансфекция гена.

Преимущество использования покадровой модели крысы брыжейки была подчеркнута в представительных результатов для этого протокола. Сравнение изображений до и после лечения уменьшает проблемы изменчивости, которые влияют на непарных статистический анализ. Конкретные ответы эксплантов варьировалась от 20% до 233% увеличения плотности сосудов и от 40% до 3500% увеличение плотности проростков. Конкретные причины этого изменения остается неизвестным, но измерения роста в той же ткани, со временем представить возможность подтвердить тканевые конкретные ответы.

Сравнительный анализ изображений в различные моменты времени в процессе роста микрососудистой также позволяет отслеживать эндотелиальные клетки. Например, наша лаборатория определила сосудистые острова как сегменты эндотелиальных клеток в непосредственной близости от микрососудистых сетей, которые отключены от соседних сетей 15, 16. Для того, чтобы подтвердить, что эти острова подключиться к близлежащей NetworK в ответ на ангиогенные стимулы, была использована модель культуры крысы брыжейки. Как показано на рисунке 5, сосудистые острова отслеживались после стимуляции ткани с основным фактором роста фибробластов (bFGF) или VEGF плюс тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Мы также показали, Сходные результаты стимуляции сообщение в сыворотке (данные не показаны здесь). После стимуляции ангиогенеза, то первоначально разъединенные сосудистыми островки можно найти подключены к сетям соседних.

Другие возможные области применения модели культуры брыжейки крысы могли использовать возможность исследовать взаимосвязи между лимфатической и кровеносных сосудов и их соответствующих эндотелиальных клеток и отслеживания интерстициального судьбы клеток. Время покадровой изображения тех же микрососудистых сетей до и после стимуляции с 10% сыворотки в этой модели были приведены примеры потенциальной интеграции сосудов лимфатической с кровью (рисунок 6). До стимуляции, лимфатической и Vess кровиELS отличались основанные на морфологии сосуда. После стимуляции лимфатической в ​​сравнении идентичности кровеносных сосудов становится менее ясным. Потенциал взаимодействия эндотелиальных клеток лимфатической / крови поддерживается наблюдением PECAM + / LYVE-1- крови эндотелиальные клетки, соединяющие с PECAM + / LYVE-1 + лимфатическими эндотелиальными клетками (данные не показаны). Эти наблюдения поддерживают использование модели культуры крысы брыжейки для исследования эндотелиальных клеток пластичностью лимфатической / крови. Рисунок 6A также подчеркивает лектин маркировки очевидных интерстициальных клеток. Хотя эта маркировка не соответствует и гетерогенным из ткани к ткани, он делает акцент на присутствие клеток эндогенных резидентов ткани. CD11b маркировка культивируемых тканей (Рисунок 7) показывает , что эти лектин-позитивные интерстициальные клетки могут быть подмножеством макрофагов. С учетом возникающих интерес к макрофагальной участия в ангиогенеза 20, дополнительно прочностьМодель может быть его использование для отслеживания динамики макрофагов с течением времени.

Как и другие модели естественных условиях бывших, текущее ограничение изучения ангиогенеза в модели культуры крысы брыжейки является отсутствие кровотока. Касательное напряжение , вызванное потоком крови было показано, играют важную роль в морфологии клеток эндотелия и пролиферацию, а также ангиогенез 17, 18, 19. Для получения репрезентативных результатов , представленных на рисунке 4, отсутствие напряжения сдвига само по себе может быть достаточно , чтобы вызвать ангиогенный отклик в культивируемых сетях. Тем не менее, мы знаем , что на основе нашей первой публикации , характеризующего модель культуры крысы брыжейки 8, что средства массовой информации Программы дополнительного питания приводит к увеличению ангиогенеза в сравнении одних только средств массовой информации. Будущие исследования, включающие поток в культивируемых микрососудистых сетей, несомненно, необходимо более тесно имитироватьв естественных условиях сценария. Потенциальные подходы для включения потока могут включать в себя катетеризация питающей сети артериол или даже катетеризация артерии дальше вверх по течению в пределах жира границы мезентериальных окон. Тем не менее, несмотря на отсутствие потока, жизнеспособность нескольких типов клеток, содержание крови и лимфатической микрососудистых сетей, а также пролиферации клеток во время ангиогенеза поддерживает относительную повышенный уровень культуральной модели крыс брыжейки коэффициент сложности по сравнению с клеткой , основанной в моделях пробирке.

В заключение, этот протокол описывает простой, воспроизводимый ех естественных условиях метод для визуализации кровеносных сосудов ответы в неповрежденных микрососудистых сетях. Такой способ предлагает альтернативу клетке , основанную на моделях пробирке для оценки динамики ангиогенных клеток в определенных местах в сетевой среде. Способ также предлагает новый инструмент для исследования ангиогенеза, лимфангиогенез и кровь / лимфатическую СУИ-скороговорканин одновременно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407, (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4, (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7, (12), e50582 (2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19, (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10, (3), e0119227 (2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63, (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5, (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3, (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212, (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8, (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23, (2), 95-121 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics