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Developmental Biology

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Azimi, M. S., Motherwell, J. M., Murfee, W. L. An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks. J. Vis. Exp. (120), e55183, doi:10.3791/55183 (2017).

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Abstract

L'angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, coinvolge le cellule endoteliali, periciti, cellule muscolari lisce, cellule del sistema immunitario, e il coordinamento con i vasi linfatici e nervi. Il multi-cella, interazioni multi-sistema comportano la necessità di ricerca di angiogenesi in un ambiente fisiologicamente rilevanti. Così, mentre l'uso di modelli di coltura cellulare in vitro hanno fornito intuizioni meccanicistici, una critica comune è che essi non riassumono la complessità associata con una rete microvascolare. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la possibilità di fare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte, prima e dopo la stimolazione dell'angiogenesi nei tessuti di ratto coltivate mesentere. tessuti coltivati ​​contengono reti microvascolari che mantengono la loro gerarchia. etichettatura immunoistochimica conferma la presenza di cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, vasi sanguigni e vasi linfatici. In unddition, etichettatura dei tessuti con BSI-lectina consente un confronto time-lapse di aree di rete locali prima e dopo la stimolazione siero o fattore di crescita caratterizzato da un aumento della germinazione capillare e densità dei vasi. Rispetto ai modelli comuni di coltura cellulare, questo metodo fornisce uno strumento per gli studi di lignaggio delle cellule endoteliali e specifica valutazione dei farmaci angiogenico tessuto in fisiologicamente rilevanti reti microvascolari.

Introduction

Crescita della rete microvascolare e rimodellamento sono denominatori comuni per la funzione dei tessuti, la guarigione della ferita, e molteplici patologie e un processo chiave è l'angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da quelli esistenti 1, 2. Per Tissue Engineering nuovi vasi o la progettazione di terapie basate angiogenici, comprendendo l'importanza delle dinamiche cellulari coinvolti nell'angiogenesi è fondamentale. Tuttavia, questo processo è complesso. Può variare in punti specifici all'interno di una rete microvascolare e coinvolge più tipi di cellule (ad esempio cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, macrofagi, cellule staminali) e sistemi multipli (reti linfatici e reti neurali). Sebbene i modelli in vitro hanno contribuito enormemente ad esaminare il rapporto tra le diverse cellule coinvolte nell'angiogenesi 3, la loro rilevanza fisiologica può essere compromessa a causa di thei r limitata complessità e il fatto che essi non riflettono strettamente uno scenario in vivo. Per superare queste limitazioni, sistemi di coltura tridimensionale 3, ex vivo modelli di tessuto 4, sistemi microfluidici 5, 6, e 7 modelli di calcolo sono stati sviluppati e introdotti negli ultimi anni. Tuttavia, vi è ancora la necessità di un modello con funzionalità time-lapse per studiare l'angiogenesi in reti microvascolari intatti ex vivo. La creazione di nuovi modelli di time-lapse per gli studi di angiogenesi con quel livello di complessità fornirà uno strumento prezioso per comprendere i meccanismi alla base che regolano l'angiogenesi e per migliorare le terapie.

Un modello potenziale che permette alla ex vivo indagini dell'angiogenesi attraverso una rete microvascolare intatto è il modello di cultura mesentere ratto> 8. Nel recente lavoro, abbiamo dimostrato che il sangue e le reti microvascolari linfatici rimangono vitali dopo la cultura. Ancora più importante, il mesentere modello di cultura del ratto può essere utilizzato per studiare le interazioni funzionali periciti-endoteliale di cellule del sangue, e le connessioni delle cellule endoteliali linfatiche, e time-lapse imaging. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire il nostro protocollo per il metodo time-lapse imaging. I nostri risultati rappresentativi documentano le molteplici tipi di cellule che rimangono vitali dopo la stimolazione dell'angiogenesi con siero e offrono esempi di utilizzo di questo metodo per quantificare specifiche risposte angiogenici dei tessuti così come endoteliali studi di monitoraggio delle cellule.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure sono state approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della Tulane University (IACUC).

1. Procedura di impostazione chirurgica

  1. strumenti Autoclave, forniture chirurgiche, e le forniture di cultura prima dell'intervento. forniture chirurgiche per ogni ratto sono: 1 telo, 1 telo con foro pre-cut (0,5 x 1,5 in) al centro, garze, e 1 underpad assorbente. Strumenti chirurgici includono: 1 bisturi con lama numero 10, 2 paia di pinzette, e un paio di forbici sottili. forniture Cultura includono: 1 telo, 1 paio di pinzette, e preparati inserti 6 pozzetti con filtri in policarbonato.
  2. Sterilizzare una piattaforma plexiglass, una fase chirurgica e uno spazio banco chirurgica con il 70% di etanolo. Mantenere la fase chirurgica in una vaschetta sterile fino al momento dell'uso.
    1. Creare una fase chirurgica perforando un approssimativamente 2 da 1 nel foro al centro di un piatto di coltura a 100 mm. Successivamente, utilizzare carta vetrata per lisciarebordi taglienti e aggiungere uno strato di colla di silicone ai bordi del foro per creare una superficie sollevata per i tessuti.
    2. In alternativa, progettare la fase chirurgica utilizzando il software CAD e di fare del 3-D stampa (Figura 1).
  3. Posizionare un underpad assorbente sterile verso il basso e porre una piattaforma di plexiglas su di esso. Posizionare il telo, senza un foro pretagliato, su un tampone riscaldato accanto al underpad assorbente.
  4. Pre-caldo sterile PBS (PBS), mezzi di comunicazione e soluzione salina a 37 ° C. Inserire i supporti e PBS in piatti della cultura separati in cima alla piastra elettrica e il luogo di soluzione salina in una provetta da 50 ml accanto alla configurazione chirurgica.
  5. Assicurarsi che tutti i pacchetti vengono aperti prima dell'inizio della chirurgia per garantire una manipolazione sterile di tutti i materiali. Un elenco completo degli strumenti comuni utilizzati in questa procedura sono elencati nella Tabella di materiali chirurgici specifici e strumenti.

2. Mesentery Tissue raccolta

  1. Usa adulti ratti maschi Wistar (350 ± 25 g, 6 - 8 settimane di età). Altri ceppi e l'età dei ratti possono essere sostituiti.
  2. Anestetizzare ratto con una iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (8 mg / kg di peso corporeo). Confermare il ratto è sotto anestesia da pizzicare tra le dita per controllare che la risposta riflessa; ci dovrebbe essere nessuno. analgesia preventiva per questa procedura terminale non è necessaria.
  3. Radere la regione addominale e rimuovere i capelli rimanenti con crema depilatoria. Pulire la pelle addominale due volte con alcool isopropilico al 70% seguita da iodopovidone. Per le salviettine il chirurgo deve iniziare al centro del sito chirurgico e spostare all'esterno dell'area preparata in modo circolare da non sovrapporsi aree che sono stati precedentemente lavati con lo stesso pezzo di garza sterile o tampone di cotone sterile. Poi il trasferimento degli animali al setup chirurgica sterile e posizionare in cima alla piattaforma plexiglassmodulo.
  4. Utilizzando una lama di bisturi, fare un 0.75 a - 1.25 in incisione nell'intestino a partire dal 1 nel sotto lo sterno. Fare attenzione a non forare l'intestino o meso (1 strato di pelle, 1 strato di tessuto connettivo, e 1 strato di muscolo).
  5. Posizionare un drappo con un foro pre-taglio sopra l'incisione e posizionare una fase chirurgica sterile in cima al telo. Assicurarsi che le allinea apertura con l'incisione. Utilizzare applicatori di cotone con punta sterile per individuare ed estrarre l'ileo attraverso l'apertura fase chirurgica.
  6. Tirare 6 - 8 finestre mesenterica attraverso la fase utilizzando applicatori con punta in cotone, e fare attenzione a non toccare le finestre (Figura 1). I tessuti sono tipicamente raccolti dalla regione ileo dell'intestino tenue partire vicino cieco. Mantenere tessuti esposti umido con soluzione salina sterile riscaldato se necessario utilizzando una siringa sterile a gocciolare la soluzione.
  7. Euthanize il ratto mediante iniezione intracardiaca di sodio pentobarbital (0,2 ml per topo). Prima di rimuovere mefinestre senteric, assicurano il ratto è eutanasia palpando il cuore; ci dovrebbe essere nessun impulso.
  8. Rimuovere i tessuti mesentere desiderato utilizzando pinzette per afferrare il cuscinetto di grasso e forbici sottili per tagliare la finestra. Lasciare un bordo di grasso (2 mm) intorno alla finestra. Lavare i tessuti una volta riscaldato PBS sterile e una volta in media.
  9. Rientro ileo esteriorizzato alla cavità addominale e smaltire animali secondo le linee guida istituzionali.

3. Mesentere Tissue Culture per gli Studi Time-Lapse

  1. Trasferimento forniture autoclave cultura (vedere paragrafo 1.1) e dei tessuti ad una cappa a flusso laminare sterile.
  2. Utilizzare le pinzette per trasferire ogni tessuto in cima ad una membrana filtrante di policarbonato. tessuti afferrare da parte del cuscinetto di grasso per evitare di danneggiare il sistema vascolare.
  3. si diffuse rapidamente il tessuto con il cuscinetto adiposo, facendo attenzione a non toccare la finestra. Invertire l'inserto con il tessuto nel fondo di una piastra da 6 pozzetti e coprire con 3 mL di supporti (Figura 1
  4. Ripetere i passaggi 3,2-3,3 per ogni tessuto e la cultura in condizioni normali incubatore (5% di CO 2, 37 ° C) per un massimo di 5 giorni.

4. Time-Lapse Imaging di Mesentere Tissue

  1. Il giorno dell'imaging, integrare i media in ciascun pozzetto con coniugato BSI-lectina ed incubare in condizioni standard di coltura per 30 min. Lavare i tessuti due volte con mezzi privi di lectina. BSI-lectina macchia rimarrà visibile sul tessuto mesentere per un massimo di 3 giorni in coltura.
  2. Trasferire la lastra ad una fase microscopio. Identificare i vasi sanguigni e linfatici in base alla loro morfologia e la struttura di rete.
  3. Individuare un'area di rete desiderata su ogni tessuto e prendere le immagini. Prendere nota del dell'imagingposizione per garantire la stessa regione verrà catturato per le immagini successive. Se si utilizza un palco motorizzato, documentare le coordinate.
  4. Rientro tessuti per l'incubatore e continuare alla cultura fino punto finale desiderato. Ripetere i passaggi 4,1-4,3 come necessario a seconda momenti sperimentali desiderati.

5. Tessuto immunomarcatura

  1. BSI-lectina Etichettatura
    1. Incubare tessuti per 30 min a 37 ° C con 01:40 lectina FITC-coniugato in mezzi (2,5 mL di soluzione di anticorpi per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti) seguito da due risciacqui con supporti. Per risciacqui, aggiungere media e quindi sostituire immediatamente.
  2. Live / Etichettatura Morto
    1. Incubare tessuti per 10 minuti a 37 ° C con 1: 500 2 mM etidio omodimero-1 e 1: 500 1 mM calceina AM in mezzi (2,5 mL di soluzione di anticorpi per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti) seguito da due risciacqui con supporti.
  3. BSI-lectina / NG2 Labeling
    1. tessuti Stendere su un microscopio scivolaronoe (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    2. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    3. Per l'etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 di coniglio anticorpo policlonale NG2 e 5% di siero normale di capra (NGS). Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    4. Per l'etichettatura anticorpo secondario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 di capra anti-coniglio coniugato CY2-anticorpi (GAR-CY2) e 5% NGS. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    5. Incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS. Per risciacqui, aggiungere PBS e quindi sostituire immediatamente.
    6. Per montare le diapositive, coprire i tessuti con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e posto coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.
  4. LYVE-1 / PECAM Labeling
    1. Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    2. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    3. Per l'etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 200 monoclonale biotinilato anticorpo CD31 e 1: 100 policlonale di coniglio LYVE-1 anticorpi in PBS + 0,1% saponina + 2% di albumina sierica bovina (BSA) + 5% NGS . Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    4. Per l'etichettatura anticorpo secondario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: anticorpi streptavidina 500 CY3 coniugato e 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    5. Per montare scivoli, i tessuti di copertura con 50:50 soluzione PBS e glicerolo e mettere un coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.
  5. BrdU / BSI-lectina Etichettatura
    1. Aggiungere 1 mg / mL BrdU a media e sostituire il supporto del tessuto con una soluzione di BrdU. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
    2. Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    3. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min).
    4. Denaturare il DNA del tessuto a 2 M HCl per 1 ora a 37 ° C. Lavare tessuti in PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    5. Per l'etichettatura anticorpo primario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 monoclonale anti-BrdU in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    6. Per l'etichettatura anticorpo secondario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: anticorpi 100 di capra anti-topo Cy3-coniugati (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    7. Per montare le diapositive, i tessuti di copertura con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e luogo coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.
  6. BSI-lectina / etichettatura CD11b
    1. Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso.
    2. Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    3. Per l'etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 topo anti-ratto CD11b in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min).
    4. Per l'etichettatura anticorpo secondario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS+ 0,1% saponina (3 x 10 min).
    5. Incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS.
    6. Per montare le diapositive, i tessuti di copertura con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e luogo coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto.

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Representative Results

Dopo 3 giorni in coltura, tessuti sono stati etichettati con un / morti kit di sopravvivenza / citotossicità diretta per dimostrare la fattibilità del microcircolo nel ratto mesentere cultura modello (Figura 2A). La maggior parte delle cellule presenti nel mesentere è rimasto vitale nella cultura in cui le cellule endoteliali sono stati individuati in base alla loro posizione nei segmenti microvascolari. Proliferazione delle cellule endoteliali è stata confermata anche mediante l'etichettatura lectina / BrdU (Figura 2D). Liscio cellule muscolari e la presenza pericyte lungo i vasi è stato confermato con l'etichettatura NG2 (Figura 2B). Etichettatura per LYVE1 e PECAM identificate con ramificazione reti linfatiche e microvascolari sangue e ha confermato la mantenuto linfatico contro fenotipo delle cellule endoteliali nel sangue (Figura 2C).

La funzione di time-lapse di questo modello è stato utilizzato per l'etichettatura del microvareti scular con BSI-lectina in diversi momenti e di imaging stessa regione all'interno della rete nel corso del tempo; Questa proprietà è particolarmente utile per indagare specifiche risposte angiogenici dei tessuti. L'integrazione di media con 10% di siero causato una robusta risposta angiogenica dopo 3 giorni di stimolazione. Inoltre, nuovi segmenti di navi e germogli capillari sono stati identificati per giorno 5 della stimolazione (Figura 3). Il metodo time-lapse imaging consentito per il confronto quantitativo delle aree di rete prima e dopo la stimolazione (Figura 4). Per questo studio rappresentativo, che conferma i nostri risultati precedenti 9, il numero di navi per area vascolare e il numero di germogli capillari per area vascolare sono stati quantificati un'immagine 4X per il tessuto da. segmenti di vasi sanguigni sono stati definiti come i segmenti di cellule endoteliali del sangue lectina-positivi presenti tra i due punti di ramificazione e germogli capillari sono stati definiti come cieco finito segmenti provenienti da una nave ospite. Confronto Time-lapse di aree di rete ha consentito inoltre il monitoraggio di segmenti di cellule endoteliali (figura 5) e l'identificazione del sangue / vasi linfatici mis-patterning (Figura 6). Labeling dei tessuti coltivati per lectina e CD11b inoltre confermato la presenza di macrofagi residenti interstiziali (Figura 7) in reti rimodellamento.

Figura 1
Figura 1. finestre mesenteriche erano situati estraendo il piccolo intestino attraverso una fase chirurgica. La fase chirurgica è stato progettato e realizzato da stampa 3-D. Il foro ellittico al centro è di circa 2 da 1 (A). Le finestre mesenterici sono state poi distribuite su di un inserto di membrana e l'inserto è stato invertito e mettere in un pozzo (B). Barra di scala = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. I vasi sanguigni rimangono vitali nel modello di topo cultura mesentere. Live / saggio morto eseguita dopo la cultura ha mostrato un elevato rapporto di cellule vive (verde) per le cellule morte (rosso) in particolare lungo i vasi sanguigni (A). Tessuti mesentere stati etichettati con lectina e anti-NG2, identificare periciti (rosso) accanto navi (verde) e per confermare che differenti tipi di cellule sono presenti nei tessuti post-coltura (B). I tessuti sono stati etichettati anche contro PECAM / LYVE-1 per identificare sangue (rosso) le navi da linfatici (verde) navi (C). Per indagare se le cellule microvascolari subiscono la proliferazione in coltura, tessuti mesentere sono stati etichettati con lectina / anti-BrdU . Su segmenti capillari etichettati con lectina (verde), più celle sono stati confermati per essere proliferativa (rosso) (D). Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura di imaging 3. Time-lapse del mesentere ratto permette l'osservazione rimodellamento microvascolare nel corso della cultura. Una risposta angiogenica robusta è stata osservata dopo 3 (B) e 5 giorni (C) di coltura con siero stimolazione 10%. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. reti microvascolari nel modello di topo cultura meso sono stati ripresi prima e dopo l'angiogenesi. Confronto della stessa rete marcata con lectina al giorno 0 e al giorno 3 (A, B) post-stimolazione con 10% di siero identifica nuovi vasi. Lectin etichette anche una popolazione di cellule interstiziali non identificati. Quantificazione di densità dei vasi (C, D) e il numero di germogli capillari per area vascolare (E, F) ha confermato un incremento sia metriche per ogni tessuto. C, E) Prima (giorno 0) e dopo (giorno 3) confronti per il tessuto. D, F) Confronto tra il giorno 0 e al giorno 3 medie usando un accoppiato test t confermato una differenza significativa sia del numero medio di segmenti nave (p <0,0001) ed il numero medio di germogli (p <0,00001) per area vascolare . barre bianche rappresentano giorno 0, e le barre nere rappresentano giorno 3. ValuES sono medie ± SEM. Per questa analisi rappresentante, 13 tessuti sono state raccolte da 2 ratti. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Il modello di cultura mesentere ratto può essere utilizzato per lo studio vascolare destino dell'isola e l'incorporazione nelle reti vicine. Utilizzando time-lapse imaging, isole vascolari, definito come segmenti endoteliali scollegati, sono stati identificati al giorno 0 e la loro connessione alla rete vicina è stata confermata dal giorno 3 stimolazione post-angiogenica. Tessuti mesentere state stimolate con bFGF (A, B) e VEGF / PDFG-BB (C, D). frecce Hollow mostrano segmenti sconnessi al giorno 0 e frecce continue rappresentano il collegamento dell'isola alla networK. Frecce indicano la posizione delle connessioni tra un'isola vascolare e vicina rete. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. time-lapse immagini dimostrano la capacità di osservare linfatico e vasi sanguigni patterning. Linfatico (l) le navi può essere distinto da arteriole (A) e venule (v) sulla base di etichettatura morfologia al giorno 0 (A). Il giorno 5 post-stimolazione con 10% di siero, morfologia linfatica viene persa e navi sembrano essere integrato con le vicine vasi sanguigni angiogenici (B). Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per visualizzare un più grandeversione di questa figura.

Figura 7
Figura 7. I macrofagi restano presenti nei tessuti di ratto coltivate mesenterica. Lectina / CD11b co-etichettatura dei tessuti coltivati ​​per 3 giorni con 10% di siero suggeriscono che lectina cellule interstiziali positive sono un sottoinsieme dei macrofagi. (A) Una immagine rappresentativa di etichettatura BSI-lectina. L'etichettatura (B) CD11b nel medesimo campo visivo. (C) L'immagine risultante dalla fusione. Le frecce individuare esempi di co-etichettatura. Barre di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo documenta un metodo per l'utilizzo del modello di cultura di ratto mesentere come uno strumento ex vivo per l'imaging time-lapse di crescita della rete microvascolare. Impieghi precedenti nel nostro laboratorio ha stabilito l'uso del nostro modello di 1) angiogenesi 8, 2) linfoangiogenesi 8, 3) periciti-endoteliali interazioni cellulare 8, e 4) anti-angiogenico test anti-droga 9. La possibilità per l'imaging dei tessuti di ratto coltivate mesentere in più punti di tempo offre un metodo quantitativo per valutare le risposte di crescita tessuto-specifici e il tracciamento delle interazioni cellula-cellula durante vari stimoli angiogenici. L'aumentata proliferazione di cellule endoteliali durante l'angiogenesi e la presenza di periciti sono coerenti con il nostro precedente lavoro 8 e convalidare le interazioni dinamiche tra diversi tipi cellulari durante l'angiogenesi nei tessuti di ratto coltivate mesenterici.

nei sistemi di coltura cellulare in vitro, il mesentere modello di cultura ratto è unico perché la crescita si verifica all'interno di una rete microvascolare vera intatto. Si consideri in contrasto con il test dell'anello aortico, che è stato istituito per studiare germinazione angiogenica dai segmenti aortici in un gel di collagene 10. Mentre germinazione nell'anello aortico coinvolge più tipi di cellule, germogli capillari crescono dei segmenti escisse dell'aorta, che è molto diversa dallo scenario in vivo. Il modello fetta cervello è un altro modello ex vivo, ma è privo di vasi linfatici. Inoltre, il modello fetta cervello non ha mostrato di essere in grado di time-lapse imaging prima e dopo la stimolazione angiogenico 11. Un altro modello ex vivo che è stato recentemente introdotto è il modello culturale retina. Il vantaggio del modello retina è che l'angiogenesi si verifica da microvascu intattoreti lar all'interno del tessuto 12, 13. Per questi modelli, ceppi di topi GFP-transgenici possono essere utilizzati per poter osservare capillare germinazione nel tempo, ma purtroppo, il mesentere topo è avascolare 14, eliminando la sostituzione topi mesentere GFP-transgenici per mesentere ratto, come utilizzato nel nostro modello. Inoltre, mostriamo che una semplice etichettatura lectina di tessuti di ratto mesentere in cultura è sufficiente per determinare la crescita della rete a tempi diversi e in confronto agli altri modelli ex vivo, il modello consente l'osservazione simultanea sia sangue e di cellule endoteliali linfatiche.

BSI-lectina è stato utilizzato in questo lavoro di visualizzare le reti microvascolari e rilevare le risposte angiogenici. Lectina è una struttura di proteina che si lega a glicoproteine ​​sulle cellule endoteliali ed è stato selezionato per questo protocollo grazie al suo tempo di incubazione breve rispetto a ANTIB endotelialemarcatori ody. Lectin è meno costoso di anticorpi e non richiede il fissaggio; può anche essere facilmente miscelato nei mezzi di coltura e sostituito con mezzi freschi Al termine del periodo di incubazione. Mentre sono necessari ulteriori studi per chiarire i potenziali effetti della tecnica di etichettatura lectina sul processo angiogenetico, i nostri risultati rappresentativi (Figura 4) dimostrano che l'angiogenesi robusta può essere indotta e lavoro precedente 9 dimostra che l'angiogenesi nelle reti lectina etichettato può essere inibito tramite il targeting Fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF). marcatori anticorpali possono potenzialmente essere utilizzati come un approccio etichettatura alternativa quando vi è la necessità per i marcatori più specifici, o quando vi è la necessità di studiare altri tipi di cellule che sono presenti nelle reti microvascolari come le cellule muscolari lisce, periciti e nervi. Un altro metodo potenziale per le cellule visualizzando sarebbe gene trasfezione.

Il vantaggio di utilizzare il modello di ratto mesentere time-lapse è stata evidenziata nei risultati rappresentativi per questo protocollo. Il confronto delle immagini prima e dopo il trattamento riduce i problemi di variabilità che influenzano l'analisi statistica non associato. Le risposte specifiche espianto variavano dal 20% al 233% di aumento nella densità dei vasi e dal 40% al 3500% di aumento nella densità germogli. Le cause specifiche di questa variazione rimangono sconosciute, ma misurare la crescita nello stesso tessuto nel tempo presentano la capacità di confermare risposte specifiche dei tessuti.

Analisi comparativa delle immagini in diversi momenti durante la crescita microvascolare consente anche per il monitoraggio di cellule endoteliali. Ad esempio, il nostro laboratorio ha identificato isole vascolari come segmenti di cellule endoteliali in prossimità delle reti microvascolari scollegati dalla vicine reti 15, 16. Per confermare che queste isole si collegano al networ vicinak in risposta a stimoli angiogenici, il modello di cultura di ratto meso è stato utilizzato. Come mostrato in Figura 5, isole vascolari sono stati monitorati dopo la stimolazione dei tessuti con fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) o VEGF più fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF). Abbiamo anche dimostrato risultati simili stimolazione posta siero (dati non mostrati qui). Dopo la stimolazione dell'angiogenesi, le isole vascolari originariamente disconnesse possono essere trovati collegati con le reti nelle vicinanze.

Altre applicazioni potenziali del modello culturale mesentere ratto potrebbe sfruttare la capacità di indagare i rapporti tra linfatici e vasi sanguigni e le rispettive cellule endoteliali e la tracciabilità del destino delle cellule interstiziali. Time-lapse immagini delle stesse reti microvascolari prima e dopo stimolazione con il 10% di siero in questo modello forniti esempi di potenziale integrazione vasi linfatici-sangue (Figura 6). Prima di stimolazione, linfatica e sanguigna Vessels si distinguevano basata sulla morfologia nave. Dopo la stimolazione, linfatica contro l'identità dei vasi sanguigni è diventato meno chiaro. Il potenziale di interazioni delle cellule endoteliali linfatico / sangue è supportata dall'osservazione di cellule PECAM + / LYVE-1- endoteliali sangue di collegamento con PECAM + / LYVE-1 + cellule endoteliali linfatiche (dati non mostrati qui). Queste osservazioni supportano l'utilizzo del modello di cultura di ratto mesentere per indagare linfatico / sangue plasticità delle cellule endoteliali. Figura 6A evidenzia anche l'etichettatura lectina di cellule interstiziali apparenti. Mentre questo etichettatura è incoerente e eterogenea da tessuto a tessuto, fa sottolineare la presenza di cellule dei tessuti residenti endogene. Etichettatura CD11b di tessuti coltivati (Figura 7) suggerisce che queste cellule interstiziali lectina-positiva possono essere un sottoinsieme dei macrofagi. Dato l'interesse emergente nel coinvolgimento dei macrofagi nell'angiogenesi 20, una forza supplementare delmodello potrebbe essere il suo utilizzo per monitorare le dinamiche dei macrofagi nel corso del tempo.

Proprio come gli altri modelli in vivo ex, una limitazione di corrente di studiare l'angiogenesi nel modello di topo cultura mesentere è la mancanza di flusso di sangue. Sollecitazione a taglio causata dal flusso di sangue è stato dimostrato di giocare un ruolo nella morfologia delle cellule endoteliali e la proliferazione e l'angiogenesi 17, 18, 19. Per i risultati rappresentativi presentati in Figura 4, l'assenza di sforzi di taglio da solo può essere sufficiente a indurre una risposta angiogenica nelle reti coltivate. Tuttavia, sappiamo che sulla base delle nostre prima pubblicazione che caratterizza la cultura modello di ratto mesentere 8, che le cause supplementazione dei media è aumentato angiogenesi rispetto alla sola media. Studi futuri incorporano flusso all'interno delle reti microvascolari coltivate sono indubbiamente necessari per imitare più da vicino lanello scenario vivo. I potenziali approcci per il flusso di incorporare potrebbero includere incannulamento di arterie che alimentano di rete o anche incannulamento di ulteriori arterie a monte all'interno del confine grasso delle finestre mesenterici. Tuttavia, nonostante la mancanza di flusso, la vitalità di più tipi di cellule, la manutenzione del sangue e reti microvascolari linfatici e proliferazione cellulare durante l'angiogenesi supporta maggiore livello relativo del modello di coltura ratto mesentere di complessità rispetto alla cella base in vitro.

In conclusione, questo protocollo descrive un semplice, riproducibile metodo ex vivo per l'imaging risposte angiogeniche in reti microvascolari intatti. Tale metodo offre un'alternativa alla cella base in vitro per valutare la dinamica cellulare angiogeniche in posizioni specifiche all'interno di un ambiente di rete. Il metodo offre anche un nuovo strumento per indagare l'angiogenesi, linfoangiogenesi e sangue / linfatici mis-patterning contemporaneamente.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drape Cardinal Health 4012 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps
Scalpel Handle Roboz Surgical Instrument RS-9843 Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length
Sterile Surgical Blade Cincinnati Surgical 0110 Stainless Steel; Size 10
Culture Dish (60 mm) Thermo Scientific 130181 10/Sleeve
Graefe Forcep (curved tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5135 Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Graefe Forcep (straight tweezers) Roboz Surgical Instrument RS-5130 Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length
Noyes Micro Scissor Roboz Surgical Instrument RS-5677 Noyes Micro Dissecting Spring Scissors;
Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length
Gauze Pads FisherBrand 13-761-52 Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply
Cotton-Tippled Applicators FisherBrand 23-400-124 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only
6-Well Plate Fisher Scientific 08-772-49 Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic
Sterile Syring 5 mL Fisher Scientific 14-829-45 Luer-Lok Tip
Sterile Bowl Medical Action Industries Inc. 01232 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use
6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) SIGMA Z681792-3EA 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile
Polycarbonate Filter Membrane SIGMA TMTP04700 Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain
Name Company Catalog Number Comments/Description
Beuthanasia Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 011168 Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium 
Ketamine Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Kateset 100 mg/mL
Xylazine LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) MWI #: 000680 Anased 100 mg/mL
Saline Baxter 2F7122
PBS Invitrogen 14040-133
MEM Invitrogen 11095080
PenStrep Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 16000-044
BSA Jackson ImmunoResearch 001-000-162
Saponin  SIGMA S7900-100G
Isopropyl Alcohol Fisher Scientific S25372
Povidone-Iodine Operand 82-226
Hydrochloric Acid SIGMA 320331
Methanol Fisher Scientific 67-56-1
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
FITC-conjugated Lectin SIGMA L9381-2MG
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody SIGMA AB5320
PECAM (CD31) Antibody BD Biosciences 555026
LYVE-1 Antibody AngioBio Co. 11-034
Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 111-585-144
Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 115-227-003
Streptavidin Cy3-conjugated Antibody Jackson ImmunoResearch 016-160-084
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224
Normal Goat Serum  Jackson ImmunoResearch 005-000-121
5-Bromo-2'-Deoxyuridine SIGMA B5002
Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine                        Clone Bu20a Dako M074401-8
Mouse Anti-Rat CD11b  AbD Serotec MCA275R

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References

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