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Chemistry

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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Abstract

Introduction

99m Tc continua a ser o radioisótopo dominante usada na medicina nuclear de diagnóstico, com mais de 50 milhões de procedimentos de imagem realizados por ano em todo o mundo 1, 2, 3. A maioria dos 99m agentes Tc utilizadas clinicamente são do tipo de perfusão radiofármacos. Há um número limitado de compostos-alvo de forma activa em que o 99mTc é dirigido para se ligar a um biomarcador específico através da ligação a uma construção de direccionamento. A criação de 99m alvo radiofármacos Tc é frequentemente prejudicado pela influência de 99m de complexos de Tc-ligando sobre a capacidade da molécula de direccionamento para ligar o biomarcador de interesse, ou os isótopos de meia-vida não é suficiente para utilização com biomoléculas peso molecular mais elevado tais como anticorpos. O último requer tipicamente vários dias antes de as imagens são adquiridas para que a biomolécula para limpar a partir de não-alvo tiss ues. Pré-segmentação oferece uma abordagem alternativa para superar esses desafios.

Pré-segmentação combinada com a química bioorthogonal tem demonstrado ser uma forma eficaz de desenvolver novas sondas imagem molecular para ambos fluorescência e radio-imagiologia 4, 5, 6, 7, 8. A reacção inversa de electrões demanda de Diels-Alder (IEDDA) entre derivados -cicloocteno trans (TCO) 1,2,4,5-tetrazina (Tz) e, como se mostra na Figura 1, tem sido demonstrado ser particularmente eficaz 6. A reação IEDDA com estes componentes podem apresentar cinética rápida na PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) e alta seletividade, sendo ideal para aplicações in vivo pré-segmentação 9, 10.

e_content "> A abordagem mais comum utilizado envolve a administração de um vector de TCO-derivado de segmentação e depois de um período de atraso suficiente, uma tetrazina radiomarcado é administrado. tetrazinas marcados radioactivamente com base em 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, e 111 no foram relataram 11, 12, 13, 14, 15. em contraste, há apenas um relatório de um marcado com 99m Tc Tz, o qual foi preparado usando um tipo de ligando HYNIC requerendo o uso de co-ligandos para prevenir a ligação e degradação de proteínas in vivo 16. Como alternativa, relatamos aqui a síntese de 99m Tc (I) marcado tetrazinas usando uma família de ligandos que formam complexos estáveis com um tridentados [99mTc (CO) 3] + núcleo.


Figura 1: A reacção IEDDA bioorthogonal entre tetrazina e -cicloocteno trans. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A família de ligandos preparados contêm quelatos tridentados que variam em polaridade e da natureza do grupo de ligação entre a região de ligação do metal e a Tz (Figura 2). O objetivo foi identificar a 99m Tc-tetrazina construir que poderiam efetivamente localizar e reagir com os locais TCO marcados in vivo e rapidamente claro, não ligadas, a fim de produzir alta meta-se não-alvo rácios. Para testar os ligandos, um TCO-derivado de um bisfosfonato (TCO-PA) foi utilizado 17. Nós mostramos anteriormente que TCO-BP localiza a áreas do metabolismo ósseo activo e pode reagir comtetrazinas radiomarcados in vivo 18. É um reagente conveniente para testar novas tetrazinas, porque ele pode ser preparado num único passo e experiências podem ser realizadas em ratinhos normais onde a localização ocorre principalmente nas articulações (joelhos e ombros).

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Protocol

Os estudos em animais foram aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster, em conformidade com a Canadian Council on Animal Care (CCAC) orientações.

1. A radiomarcação de ligandos TZ-tridentados com 99m Tc

CUIDADO: Os seguintes procedimentos requerem o uso de compostos radioactivos. O trabalho só deve ser feito em um laboratório licenciado com a adesão a normas de segurança e eliminação. reacções de micro-ondas deve ser realizada num forno de microondas especificamente concebido para a síntese química.

  1. Síntese de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20
    1. Em um frasco de microondas, combinar 8 mg de K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg de Na 2 CO 3, 20 mg de Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O e 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purge o frasco durante 10 min com gás argônio.
    2. Adicionar 4 ml de 99m TcO ~ 4 - (1.100 MBq, ~ 30 mCi) em 0,9% de solução salina para o frasco.
    3. Aquece-se a reacção num micro-ondas durante 3,5 minutos a 110 ° C, após 10 s de agitação para garantir uma mistura completa dos reagentes.
    4. Ajuste o pH da solução para 3,5-4 com ~ 400 mL de HCl 1M. Verifique utilizando papel de pH.
  2. Radiomarcação de tetrazina ligantes 1-5
    1. Dissolve-se 2 mg de cada ligando (compostos 1-5) em 250 mL de MeOH 21.
    2. Adicionar 250 uL de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) a cada solução.
    3. Aquece-se a mistura de reacção utilizando um forno de microondas durante 20 min a 60 ° C.
      NOTA: Este passo foi idêntico para todos os 5 tetrazinas.
    4. Para os compostos 2 a 5, evapora-se o solvente e re-dissolve os produtos resultantes em 1 mL de 1: v / v 1 DCM: TFA.
    5. Aquecer os produtos de reacção dissolvidos (2-5) a 60 ° C em um micro-ondas durante 6 min (2-4) ou 10 min (5).
    6. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, evapora-se o solvente usando um evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) e dissolve-se o composto seco em 1: 1 de ACN: H 2 O ou 1: 1 de MeOH: H2O, antes da purificação por HPLC.
    7. Purifica-se os compostos marcado com 99m Tc (1-5), incluindo a separação do produto marcado do ligando não marcado tetrazina, utilizando HPLC (C 18 de fase inversa). Tipicamente, usar um gradiente de eluição de 30:70 ACN: H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) a 40:60 ACN: H2O ao longo de 20 min (18 min) e uma coluna analítica C 18 4,6 x 100 mm. Use tanto UV (254 nm) e detecção gama.
      1. Aqui uma pequena amostra de cada produto marcado e comparar o seu tempo de retenção HPLC para o de um co-injected, não radioactiva, marcada com Re padrão (0,125 mg em 20% de metanol-H2O). O padrão marcado com Re é identificada no rastreio de UV HPLC, e eluir, ao mesmo tempo que o composto 99m Tc-rotulada no rastreio γ-HPLC. Esta co-injecção mostra picos em tempos de retenção semelhantes, o que confirma a identidade do composto de 99m Tc-rotulados.
    8. Evapora-se o solvente a partir das fracções de HPLC utilizando um evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm).
    9. Formular o composto purificado, a uma concentração de 7,4 kBq / mL em PBS, contendo BSA a 0,5% e 0,01% de Tween-80.
    10. Para garantir os compostos marcados são estáveis, realizar um estudo de estabilidade in vitro. Incubar o composto formulado a 37 ° C durante 1, 4 e 6 h, injectando uma pequena quantidade (3,7 MBq) da mistura em HPLC em cada ponto de tempo para avaliar a estabilidade.

2. Estudos Bio-distribuição Pré-alvo

    Preparação de animais
    1. Utilizando ratos fêmeas de 7-9 semanas de idade, ratinhos Balb / c (n = 3), administrar TCO-BP formulado em solução salina (20 mg / kg) (5 mg / mL), por via de injecção na veia da cauda-.
    2. Coloque o mouse no dispositivo de contenção física, e identificar as veias localizadas nas superfícies laterais da cauda e limpe com um algodão embebido em álcool. Em cerca de 2 cm da extremidade da cauda, ​​inserir uma agulha de calibre 30 a um ângulo raso, paralelo à veia. Lentamente pressionar o êmbolo para injetar, remova a agulha e aplicar gaze limpa no local da injecção com uma ligeira pressão até o sangramento parar.
    3. A 1 h após a injecção de TCO-BP, administrar ~ 0,74 MBq (20 uCi) de 99m Tc-tetrazina formulados em 100 ul de 0,5% de BSA, 0,01% de Tween-80 em PBS, através de injecção na veia da cauda.
  1. Estudos biológicos e de distribuição
    1. No ponto de tempo desejado (t = 6 H), anestesiar os ratos utilizando 3% de isoflurano e mistura gasosa de oxigénio de 2%. Demonstrar uma parae pitada retirada no rato anestesiado para garantir que eles estão em plano cirúrgico de anestesia.
    2. Recolha de sangue (1 mL) através de punção cardíaca utilizando uma seringa pré-tratada com heparina. Colocar o mouse sobre as suas costas com o nariz no cone do nariz para anestesia continuou e localizar o apêndice xifóide no animal.
      1. Inserir uma agulha G 25, ligeiramente à esquerda da linha média do animal no âmbito do processo xifóide, em um ângulo de 20 °. Totalmente inserir a agulha, e, lentamente, puxar o êmbolo para ver sangue no centro da agulha se o coração foi perfurado. Ligeiramente reajustar a agulha, mantendo o êmbolo, se necessário, para perfurar o coração. Lentamente extrair o sangue para dentro da seringa.
    3. Eutanásia do animal por deslocamento cervical, sob anestesia.
    4. Coloque cada animal em um saco plástico e usar um calibrador de dose (configuração Tc 99m) para medir todo o nível de atividade do corpo.
    5. Coletar os seguintes tecidos e fluidos em pré-pesamed contando tubos: sangue, osso (joelho e ombro), vesícula biliar, rins, fígado, estômago (com conteúdo), intestino delgado (com conteúdo), intestino grosso e ceco (com conteúdo), tireóide e traqueia, bexiga com urina , e cauda.
    6. Lavar tecidos apropriados (excluindo sangue, vesícula biliar e bexiga urinária) em PBS para remover o sangue e secar antes de colocar os tecidos em tubos de contagem adequadas.
    7. Coloque carcaça de animal em um saco plástico e medir a atividade do corpo inteiro residual usando um calibrador de dose.
    8. Pesar cada tubo que contém uma amostra de tecido. Subtrair o peso inicial do tubo para obter uma massa de tecido.
    9. Usar um calibrador de dose (99m Tc definição) para medir a quantidade de actividade de uma amostra de teste (100 uL) no momento da injecção para cada rato.
      NOTA: Esta amostra teste é igual ao volume de injecção, dando, assim, a contagem de actividade no momento da injecção.
    10. Na altura da medição do tecido, umaliquot 5 uL da amostra de teste utilizado anteriormente. Utilizar um contador de raios gama múltiplos detectores (configuração Tc 99m) e contam para obter a contagem por minuto (CPM) para a amostra de teste de 5 mL.
    11. Use os dois valores obtidos em 2.2.9 e 2.2.10 para calcular a atividade e relacionamento CPM usando a equação 1 para obter um factor de conversão (CPM uCi -1).
      (1) equação 1
    12. Utilizar o contador gama para medir a quantidade de radioactividade em cada tecido ou amostra de fluido.
    13. Use equação 1 para calcular a quantidade de actividade em cada tecido ou fluido no momento da medição em relação à dose total injectada. Este valor é em seguida normalizado pelo peso do órgão e relatados como percentagem da dose injectada por grama (ou seja,% ID / g) de tecido.
    14. Siga os passos 2.1.2 a 2.2.13 para conduzir um experimento de controle negativo usando os marcado com 99m Tc ligantes tetrazina na Absence de TCO-BP. Sacrifício ratinhos (n = 3) em 0,5, 1, 4 e 6 h pós-injecção e obter o tecido ou fluido, tal como descrito acima.

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Representative Results

Os ligandos foram sintetizados utilizando diferentes ligantes e agentes quelantes através de um simples estratégia de aminação redutiva (Figura 2), seguido por acoplamento do produto a um tetrazina comercialmente disponíveis 22, 23. A marcação radioactiva foi realizada utilizando o mesmo método para todos os compostos e era altamente reprodutível. O processo foi optimizado variando o pH, a quantidade de ligando, tempo de reacção e temperatura depois do que o Tc-99m compostos radiomarcados 1-5 foram obtidos de moderado a alto rendimento radioquímico: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42% (4), e 54% (5). Após purificação por HPLC de ligando que não reagiu e evaporação usando um evaporador, os compostos foram formulados em PBS contendo 0,5% de BSA e 0,01% de Tween 80 antes da injecção. A actividade específica do p tetrazina urified 99m Tc-marcado foi de ~ 1,48 MBq / ug. Os estudos foram realizados para avaliar a estabilidade dos marcado com 99m Tc ligandos tetrazina antes dos estudos in vivo. A estabilidade foi monitorizada por HPLC a 1, 4 e 6 h, sem causar degradação visível ao longo de 6 h (Rt = 14 min), como pode ser visto na Figura 3 para o composto 4 como um exemplo.

Figura 2
Figura 2: Os compostos 1-5 foram produzidos utilizando ligantes diferentes (Y) e agentes quelantes (x), como mostrado (em baixo). Todos os compostos foram radiomarcados com [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + utilizando as mesmas condições de reacção (topo), com a excepção de uma, que não requerem o passo (ii).

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Figura 3: Resultados do ensaio de estabilidade utilizando o Composto 4. vestígios γ-HPLC de 4 incubados em PBS a 37 ° C durante 1, 4 e 6 h.

Para o teste in vivo, utilizaram-se ratinhos Balb / C saudáveis. Resumidamente, para cada composto, os grupos de ratinhos (n = 3) foram injectados com o TCO-BP (100 uL, 20 mg / kg), a que se seguiu a administração dos compostos Tc-99m marcados 1 h mais tarde. Às 6 h pós-injecção dos complexos 99mTc, os animais foram sacrificados e as concentrações de actividade em vários tecidos e fluidos determinada. Os dados resultantes são apresentados como percentagem de dose injectada por grama de tecido (% ID / g) e é mostrada na Figura 4. Índices representativos de osso (joelho ou ombro) ao sangue para cada um dos compostos Tz cinco 99m Tc-rotulados são apresentados na Tabela 1. Estes dados indicam CLmais cedo que o composto 3 fornecida segmentação óptima combinada com a depuração do sangue, e que havia uma variação substancial entre os compostos marcados Tc-99m em conta a localização fora do alvo de tecido. Um estudo de controlo negativo utilizando ratinhos CD1 (n = 3) foi realizada, em que os ratinhos foram injectados com ligandos de 99m Tc-tetrazina na ausência de TCO-BP. Os ratos foram sacrificados às 0,5, 1, 4 e 6 h e% ID / g foi determinada para todos os tecidos e fluidos. Para todos os compostos testados, em que os dados para o Composto 2 é apresentada na Figura 5, não absorção significativa foi observada no osso ou outros tecidos (coração, pulmões, baço, músculo esquelético) não mostrados na Figura 4.

Figura 4
Figura 4. Resultados Bio-de distribuição de 99m Tc-rotulados derivados tetrazina 1-5 (barras indicated). Os dados apresentados foram obtidos a partir de tecidos seleccionados e fluidos feita 6 h pós-injecção dos derivados radiomarcados, e a actividade foi normalizada para o peso do tecido ou fluido, como média percentagem de dose injectada por grama de tecido ou de fluido (% ID / g) ± SEM. alvos osso são indicados por •. NOTA: Todos os restantes tecidos não mostrados tinha média de% ID / g, que era inferior a 1%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Os resultados de Bio-de distribuição para o estudo de controle usando tetrazina marcado com 99m Tc (2) sem injecção antes da TCO-BP. Os dados apresentados foram obtidos a partir de tecidos seleccionados e fluidos retirados de 3 murganhos às 0,5, 1, 4, e 6 horas após a injecção de 2. A actividade foi normalizada para o tecido oupeso do fluido, como dose média por cento injectada por grama de tecido ou fluido (% ID / g) ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composto
relação 1 2 3 4 5
Ombro: Blood 3,5: 1 3,5: 1 21: 1 7,8: 1 0,8: 1
Joelho: Blood 6,9: 1 5,6: 1 26: 1 12: 1 1,3: 1

Tabela 1. tecido do osso: rácios de sangue determinados a partir de estudos de bio-distribuição.

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Discussion

Uma colecção de quelatos tridentados ligada-tetrazina de polaridades diferentes foi preparado, e a utilidade dos seus complexos 99mTc na reacção com um derivado IEDDA TCO in vivo foi avaliada. Um método eficaz e reprodutível rotulagem 99m Tc foi desenvolvido para cinco tetrazina-quelatos, onde a concentração de ligando foi 10 -3 M. A etapa de marcação foi seguida por desprotecção de t- butilo (para os compostos 2-5). A elevada concentração de ligando foi usada para melhorar o rendimento radioquímico e reduzir os tempos de reacção que minimizou a degradação da tetrazina 21. O produto foi isolado e separado do ligando não marcado e quaisquer impurezas radioquímica por HPLC, o que resulta em rendimentos variando radioquímica 31-83%, com todos tendo pureza radioquímica> 99% e uma actividade específica elevada de ~ 1,48 MBq / ug. Todos os compostos mostraram-se estáveis ​​em PBS contendo 0.5% de BSA e 0,01% de Tween80 durante até 6 h (figura 3).

compostos bisfosfonatos, como TCO-BP, se localizam nas regiões do metabolismo ósseo ativo ou lesão, que incluem articulações do joelho e ombro em camundongos. Portanto TCO-BP fornece um meio simples de avaliar a eficácia de novas tetrazinas radiomarcados para entregar isótopos in vivo. Avaliação da bio-distribuição de todos os cinco 99mTc- tetrazinas mostrou absorção em articulações do joelho e ombro 6 h pós-injecção, o que demonstra bem sucedida de pré-direccionamento para o osso in vivo (Figura 4). Estudos anteriores confirmou que radiomarcado TCO-BP acumula no osso 18, enquanto que a construção de 99m Tc-tetrazina (2) dada por si só não o faz (Figura 5). Isto permite concluir que a absorção óssea era devido à reacção IEDDA.

As construções mais lipofílicos 1 e 2 (1); 7,6 ± 2,7 (2)) e o ombro (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). Concentrações elevadas de radioactividade foram também observados na vesícula biliar, do fígado e dos intestinos, o que é consistente com a distribuição de 99m Tc-tetrazina lipofílico composto 2 na ausência de TCO-PA (Figura 5). Outros tecidos não-alvo e órgãos, tais como o músculo esquelético e o baço não mostraram qualquer absorção significativa (<1%) quando os estudos de biodistribuição foram realizados sobre os 99mTc- tetrazinas na ausência do TCO-PA (Figura 5) , assim que estes órgãos não foram levados para os experimentos de pré-segmentação. Além disso, experimentos bio-distribuição com os 99mTc- tetrazinas sozinho revelou boa folga a partir de tecidos não-alvo às 6 h após a injeção. Consequentemente, this ponto de tempo, o que está dentro de uma meia-vida do isótopo, foi seleccionado como o ponto no tempo para comparar os diferentes ligandos radiomarcados tetrazina.

A 99m polar composto mais Tc-tetrazina 3 tendo um ligante PEG 5 mostrou muito alto joelho e captação de ombro (16,2 ± 4,8 e 20,7 ± 4,9, respectivamente). Houve também menor actividade observada no fígado e intestinos. O correspondente derivado de PEG 10 também mostrou ligação ao osso e absorção reduzida no fígado em comparação com os compostos 1 e 2. O derivado mais polar 5, mostraram uma redução da ligação de todos os outros constructos que é susceptível de osso, devido à sua rápida eliminação.

A absorção óssea e osso alta: proporções de sangue (Tabela 1), em especial para os compostos 3 e 4 demonstram que o pré-direccionamento e a reacção IEDDA pode ser usado para loccompostos Alize marcado com 99m Tc in vivo. Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para avaliar qualquer tetrazina radiomarcado incluindo próxima geração de Tc (I) -tetrazine ligandos. Deve notar-se que, para a classe de ligandos, que foram utilizados neste estudo, as estruturas podem ser facilmente variada mudando a natureza dos grupos dadores e linkers entre o complexo de metal e o tetrazina, sem alterar significativamente o método de síntese do ligando 21. Uma vez que uma molécula de ligação é identificada, um método kit de imediato, o que provavelmente irá incluir métodos de purificação de fase sólida, pode ser desenvolvida para suportar a tradução clínica.

(I) o complexos Tc aqui relatados criar a oportunidade de preparar novos radiofármacos 99m Tc usando uma grande variedade de diferentes moléculas alvo derivado do TCO incluindo anticorpos. Anticorpos, apesar de suas excelentes propriedades de segmentação anteriores à criação de tecnécio marcado tetrazinas, não seria typicaliado ser usado com 99m Tc por causa da sua depuração lenta (dias), o que é muito mais longo do que a meia-vida do isótopo (~ 6 h). Uma aplicação adicional da química aqui relatado é que a mesma classe de ligandos podem ser preparadas com o beta radionuclídeos emissores 186 Re e 188 Re. Os análogos de iso-estruturais Re (I) dos agentes de Tc (I), quando combinados com o tumor em busca de propriedades TCO-BP pode ser utilizado para tratar metástases ósseas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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