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Chemistry

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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Abstract

Introduction

99m Tc rimane il radioisotopo dominante utilizzato in medicina nucleare diagnostica, con oltre 50 milioni di procedure di imaging condotti ogni anno in tutto il mondo 1, 2, 3. La maggior parte degli agenti 99m Tc usati clinicamente sono di tipo perfusione radiofarmaci. Ci sono un numero limitato di composti mirati attivamente in cui 99m Tc è diretto ad associare un biomarker specifico mediante legatura ad un costrutto targeting. La creazione di 99m mirata Tc radiofarmaci è spesso ostacolato dalla influenza di 99m complessi Tc-ligando sulla capacità della molecola targeting impegnare la biomarker di interesse, o gli isotopi emivita non è sufficiente per l'utilizzo con elevate biomolecole peso molecolare come gli anticorpi. Quest'ultimo richiede tipicamente diversi giorni prima immagini sono acquisite in modo che la biomolecola cancellare da non bersaglio tiss UES. Pre-targeting offre un approccio alternativo per superare queste sfide.

Pre-targeting combinato con la chimica bioorthogonal ha dimostrato di essere un modo efficace per sviluppare nuove sonde imaging molecolare sia per fluorescenza e radio imaging 4, 5, 6, 7, 8. La domanda di elettroni inversa Diels-Alder (IEDDA) reazione tra 1,2,4,5-tetrazina (Tz) e derivati -cyclooctene trans (TCO), come mostrato nella Figura 1, ha dimostrato di essere particolarmente efficace 6. La reazione IEDDA con questi componenti può esibire una rapida cinetica in PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) e alta selettività, che lo rende ideale per in vivo pre-targeting applicazioni 9, 10.

e_content "> L'approccio più comune utilizzato implica la gestione di un vettore targeting TCO-derivati e dopo un periodo di ritardo sufficiente, un tetrazina radioattivo viene somministrato. tetrazines radioattivo sulla base di 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, e 111 sono stati segnalato 11, 12, 13, 14, 15. al contrario, c'è solo un rapporto di un 99m Tc-etichettato Tz, che è stato preparato utilizzando un tipo ligando HYNIC richiedere l'uso di co-ligandi per prevenire legame proteico e la degradazione in vivo 16. in alternativa, riportiamo qui la sintesi di 99m Tc (I) etichettato tetrazines utilizzando una famiglia di leganti che formano complessi stabili con tridentati [99m Tc (CO) 3] + nucleo.


Figura 1: La reazione IEDDA bioorthogonal tra tetrazina e -cyclooctene trans. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La famiglia di leganti preparati contengono chelati tridentati che variano in polarità e la natura del gruppo linker tra la regione di legame del metallo e Tz (Figura 2). L'obiettivo era quello di individuare una 99m Tc-tetrazina costrutto che potrebbe efficacemente localizzare e reagire con i siti TCO-etichettati in vivo e rapidamente chiaro non collegate, al fine di produrre alta target-to-non-bersaglio rapporti. Per testare i ligandi, un TCO-derivato di un bisfosfonato (TCO-BP) è stato utilizzato 17. Abbiamo dimostrato in precedenza che il TCO-BP localizza alle aree di metabolismo osseo attivo e può reagire contetrazines radiomarcati in vivo 18. È un reagente conveniente per testare nuove tetrazines, perché può essere preparato in un'unica fase e gli esperimenti può essere eseguita in topi normali dove localizzazione luogo soprattutto nelle articolazioni (ginocchia e spalle).

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Protocol

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Consiglio di Ricerca Etica degli animali alla McMaster University in accordo con il Consiglio Canadese Animal Care (CCAC) le linee guida.

1. radiomarcatura di ligandi Tz-tridentati con 99m Tc

NOTA: Le seguenti procedure richiedono l'uso di composti radioattivi. Il lavoro dovrebbe essere fatto solo in un laboratorio autorizzato con aderenza alle norme di sicurezza e di smaltimento. reazioni microonde devono essere eseguiti in un forno a microonde specificamente progettato per sintesi chimica.

  1. Sintesi di [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20
    1. In una fiala forno a microonde, unire 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg di Na 2 CO 3, 20 mg di Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, e 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. spurgo la fiala per 10 minuti con gas argon.
    2. Aggiungere 4 ml di 99m TcO 4 - (~ 1.100 MBq, ~ 30 MCI) in soluzione fisiologica 0,9% al flaconcino.
    3. Riscaldare la reazione in un forno a microonde per 3,5 min a 110 ° C dopo 10 s di agitazione per assicurare una completa miscelazione dei reagenti.
    4. Regolare il pH della soluzione a 3,5-4 utilizzando ~ 400 ml di 1 M HCl. Verificare utilizzando carta pH.
  2. Radiomarcatura di tetrazina ligandi 1-5
    1. Sciogliere 2 mg di ciascun ligando (composti 1-5) in 250 ml MeOH 21.
    2. Aggiungere 250 ml di [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 MCI) a ogni soluzione.
    3. Riscaldare la miscela di reazione utilizzando un forno per 20 minuti a 60 ° C.
      NOTA: Questo passaggio era identica per tutti i 5 tetrazines.
    4. Per composti 2- 5, si evapora il solvente e re-dissolve i prodotti risultanti in 1 ml di 1: 1 v / v DCM: TFA.
    5. Riscaldare i prodotti di reazione disciolti (2-5) a 60 ° C in un forno a microonde per 6 minuti (2-4) o 10 min (5).
    6. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, si evapora il solvente usando un evaporatore (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6.000 rpm) e sciogliere il composto essiccato in 1: 1 ACN: H 2 O o 1: 1 MeOH: H 2 O, prima purificazione HPLC.
    7. Purificare i 99m Tc-marcato composti (1-5), tra cui la separazione del prodotto etichettato da senza etichetta ligando tetrazina, utilizzando HPLC (C 18 in fase inversa). Tipicamente, utilizzare un gradiente di eluizione di 30:70 ACN: H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 40:60 ACN: H 2 O oltre 20 min (18 min) e una analitica colonna C 18 4,6 x 100 mm. Utilizzare sia UV (254 nm) e la rilevazione di gamma.
      1. Prendere un piccolo campione di ciascun prodotto etichettato e confrontare il suo tempo di ritenzione HPLC a quella di un co-injette, non radioattivo, standard di Re-marcato (0,125 mg nel 20% di metanolo-H 2 O). Lo standard Re-marcato è identificato nella traccia UV HPLC, e verrà eluire al tempo stesso come il 99m Tc composto marcato nella traccia γ-HPLC. Questa co-iniezione mostra picchi a tempi di ritenzione comparabili, confermando l'identità del 99m Tc-etichettato compound.
    8. Evaporare il solvente dalle frazioni HPLC utilizzando un evaporatore (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6,000 rpm).
    9. Formulare il composto purificato ad una concentrazione di 7,4 kBq / ml in PBS, contenente 0,5% di BSA e 0,01% Tween-80.
    10. Per garantire i composti marcati sono stabili, effettuare uno studio in vitro stabilità. Incubare il composto formulato a 37 ° C per 1, 4 e 6 h, iniettando una piccola quantità (3,7 MBq) della miscela sulla HPLC ad ogni tempo per valutare la stabilità.

2. Studi Bio-Pre-distribuzione mirati

    Preparazione degli animali
    1. Utilizzando 7-9 settimane di età, i topi femmina BALB / c (n = 3), amministrare TCO-BP formulato in soluzione salina (20 mg / kg) (5 mg / mL), mediante iniezione coda vena.
    2. Posizionare il mouse in un dispositivo di contenzione fisica, e identificare le vene situate sulle superfici laterali della coda e pulire con un tampone imbevuto di alcol. A circa 2 cm dall'estremità della coda, inserire un ago da 30 gauge con un angolo basso, parallelamente alla vena. Premere lentamente lo stantuffo per iniettare, rimuovere l'ago ed applicare pulita garza al sito di iniezione con una leggera pressione fino a quando si arresta l'emorragia.
    3. Al 1 ore dopo l'iniezione di TCO-BP, amministrare ~ 0,74 MBq (20 pCi) di 99m Tc-tetrazina formulati in 100 ml di 0,5% di BSA, 0,01% di Tween-80 in PBS, tramite iniezione coda vena.
  1. Studi Bio-distribuzione
    1. Al punto di tempo desiderato (t = 6 h), anestetizzare i topi utilizzando 3% isoflurano e miscela gassosa di ossigeno 2%. Dimostrare un ae un pizzico di ritiro sul mouse anestetizzato per assicurare che siano in aereo chirurgico di anestesia.
    2. Raccogliere il sangue (1 mL) mediante puntura cardiaca usando una siringa pre-trattati con eparina. Posizionare il mouse sul dorso con il naso nel cono di naso per continuare l'anestesia e individuare il processo xifoideo sull'animale.
      1. Inserire un ago G 25, leggermente a sinistra della linea mediana dell'animale sotto il processo xifoideo, ad un angolo di 20 °. Inserire completamente l'ago, e lentamente tirare indietro lo stantuffo per vedere il sangue nel mozzo ago se il cuore è stato perforato. Leggermente regolare nuovamente l'ago tenendo lo stantuffo se necessario, forare il cuore. Lentamente prelevare il sangue nella siringa.
    3. Eutanasia dell'animale mediante dislocazione cervicale, mentre sotto anestesia.
    4. Mettere ogni animale in un sacchetto di plastica e utilizzare un calibratore di dosi (99m impostazione Tc) per misurare tutto il livello di attività del corpo.
    5. Raccogliere i seguenti tessuti e fluidi in pre-pesareEd contando tubi: sangue, midollo (ginocchio e della spalla), cistifellea, reni, fegato, dello stomaco (con il contenuto), piccolo intestino (con il contenuto), intestino crasso e cieco (con il contenuto), tiroide e trachea, vescica urinaria con l'urina , e la coda.
    6. Risciacquare tessuti idonei (ad esclusione del sangue, della cistifellea e vescica urinaria) in PBS per rimuovere il sangue e asciugare prima di mettere i tessuti nelle provette di conteggio appropriati.
    7. Mettere carcassa animale in un sacchetto di plastica e misurare l'attività residua di tutto il corpo con un calibratore di dosi.
    8. Pesare ciascuna provetta contenente un campione di tessuto. Sottrarre peso iniziale del tubo per ottenere la massa del tessuto.
    9. Utilizzare un calibratore di dosi (99m Tc impostazione) per misurare la quantità di attività in un campione di prova (100 mL) al momento dell'iniezione per ogni mouse.
      NOTA: Questo campione è uguale al volume di iniezione, dando così il conteggio attività al momento dell'iniezione.
    10. Al momento della misurazione del tessuto, unliquot 5 ml di campione usato in precedenza. Utilizzare un contatore gamma multi-detector (99m impostazione Tc) e contare per ottenere il conteggio al minuto (CPM) per il campione 5 ml.
    11. Utilizzare i due valori ottenuti in 2.2.9 e 2.2.10 per calcolare l'attività e rapporto CPM con l'equazione 1 per ottenere un fattore di conversione (CPM pCi -1).
      (1) Equazione 1
    12. Utilizzare il contatore gamma per misurare la quantità di radioattività in ogni tessuto o campione di fluido.
    13. Utilizzare equazione 1 per calcolare la quantità di attività in ciascun tessuto o fluido al momento della misura relativa alla dose totale iniettata. Questo valore viene quindi normalizzata per il peso degli organi e riportato come la dose percentuale iniettata per grammo (cioè,% ID / g) di tessuto.
    14. Seguire i passaggi 2.1.2 a 2.2.13 per condurre un esperimento di controllo negativo utilizzando i 99m Tc-marcato ligandi tetrazina nel Absence di TCO-BP. topi sacrificio (n = 3) a 0.5, 1, 4 e 6 ore dopo l'iniezione ed ottenere tessuti o fluidi come sopra descritto.

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Representative Results

I leganti sono stati sintetizzati utilizzando diversi linker e chelanti tramite una semplice strategia amminazione riduttiva (figura 2), seguita da accoppiamento del prodotto ad un tetrazina disponibile in commercio 22, 23. Radiomarcatura è stata effettuata utilizzando lo stesso metodo per tutti i composti ed era altamente riproducibile. Il processo è stato ottimizzato variando il pH, quantità di ligando, tempo di reazione e la temperatura dopo di che il 99m Tc-radiomarcato composti 1-5 sono stati ottenuti in moderata ad alta resa radiochimica: 83% (1), 45% (2), 31% (3), 42 (4)% e 54% (5). Dopo purificazione HPLC da legante non reagito ed evaporazione usando un evaporatore, i composti sono stati formulati in PBS contenente 0,5% di BSA e 0,01% Tween80 prima dell'iniezione. L'attività specifica del p tetrazina urified 99m Tc-marcato era ~ 1,48 MBq / mg. Gli studi sono stati condotti per valutare la stabilità dei 99m Tc-marcato ligandi tetrazina prima degli studi in vivo. La stabilità è stata monitorata mediante HPLC a 1, 4 e 6 h senza degradazione visibile su 6 h (R t = 14 min), come visibile in figura 3 per il composto 4 come esempio.

figura 2
Figura 2: Composti 1-5 sono stati prodotti utilizzando diversi linker (Y) e chelanti (X) come mostrato (in basso). Tutti i composti sono stati radiomarcati con [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + usando le stesse condizioni di reazione (in alto), con l'eccezione di 1, che non richiedeva stadio (ii).

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Figura 3: risultati di test di stabilità utilizzando composti 4. tracce γ-HPLC su 4 incubate in PBS a 37 ° C per 1, 4 e 6 h.

Per le prove in vivo, sono stati usati topi sani Balb / c. In breve, per ogni composto, gruppi di topi (n = 3) sono stati iniettati con TCO-BP (100 ml, 20 mg / kg), che è stata seguita dalla somministrazione di composti 99m Tc-etichettati 1 ore più tardi. A 6 ore dopo l'iniezione delle 99m Tc complessi, gli animali sono stati sacrificati e le concentrazioni di attività in vari tessuti e fluidi determinati. I dati risultanti vengono riportati come percentuale della dose iniettata per grammo di tessuto (% ID / g) ed è mostrato in Figura 4. Indici rappresentativi di osso (ginocchio o spalla) al sangue per ciascuno dei composti Tz cinque 99m Tc-marcati sono riportati nella tabella 1. Questi dati indicano clpresto che mescola 3 fornito ottimale di targeting in combinazione con gioco dal sangue, e che non vi era notevole variazione tra i composti 99m Tc-etichettati in materia di non centra la porta di localizzazione dei tessuti. Uno studio negativo di controllo utilizzando topi CD1 (n = 3) è stata condotta, in cui i topi sono stati iniettati con ligandi 99m Tc-tetrazina in assenza di TCO-BP. I topi sono stati sacrificati a 0,5, 1, 4 e 6 h e% ID / g è stato determinato per tutti i tessuti e fluidi. Per tutti i composti testati, in cui i dati per il composto 2 è presentata nella figura 5, nessun assorbimento significativo è stato osservato in osso o altri tessuti (cuore, polmoni, milza, muscolo scheletrico) non mostrate in figura 4.

Figura 4
Figura 4. Risultati Bio-distribuzione per 99m Tc-marcato derivati tetrazina 1-5 (bar indicaTed). I dati indicati sono stati ottenuti da tessuti selezionati e fluidi prelevati 6 ore dopo l'iniezione dei derivati ​​radiomarcati, e l'attività è stata normalizzata al tessuto o del peso del fluido, come percentuale media iniettato dose per grammo di tessuto o fluido (% ID / g) ± SEM. obiettivi Bone sono indicati da •. NOTA: Tutte le rimanenti tessuti non mostrati avuto media% ID / g che è stata inferiore all'1%. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Risultati Bio-distribuzione per lo studio di controllo utilizzando tetrazina 99m Tc-marcato (2) senza iniezione prima di TCO-BP. I dati indicati sono stati ottenuti da tessuti selezionati e fluidi prelevati da 3 topi a 0,5, 1, 4, e 6 ore dopo l'iniezione di 2. L'attività è stata normalizzata al tessuto oil peso del fluido, come dose media cento iniettata per grammo di tessuto o fluido (% ID / g) ± SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Composto
Rapporto 1 2 3 4 5
Spalla: Blood 3.5: 1 3.5: 1 21: 1 7.8: 1 0.8: 1
Ginocchio: Blood 6.9: 1 5.6: 1 26: 1 12: 1 1.3: 1

Tabella 1. TESSUTO OSSEO: rapporti di sangue determinati da studi bio-distribuzione.

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Discussion

Una collezione di tetrazina linked chelati tridentati di polarità variabile è stata preparata, e l'utilità dei loro complessi 99m Tc nella reazione IEDDA con un derivato TCO in vivo è stata valutata. Un metodo di etichettatura 99m Tc efficace e riproducibile stato sviluppato per cinque tetrazina chelati, dove la concentrazione del ligando era 10 -3 M. Il passo etichettatura è stata seguita da deprotezione del t-butil (per i composti 2-5). L'elevata concentrazione di ligando è stato usato per migliorare la resa radiochimica e ridurre i tempi di reazione che minimizzare la degradazione della tetrazina 21. Il prodotto è stato isolato e separato dal ligando non marcato ed eventuali impurità radiochimica per HPLC, comportino rese radiochimica vanno dal 31-83%, con tutti aventi> 99% di purezza radiochimica e un'alta attività specifica di ~ 1,48 MBq / ug. Tutti i composti hanno dimostrato di essere stabile in PBS contenente 0.5% BSA e 0,01% Tween80 fino a 6 ore (Figura 3).

composti bifosfonati, come TCO-BP, localizzano alle regioni del metabolismo osseo attivo o lesioni, che includono articolazioni del ginocchio e della spalla nei topi. TCO-BP fornisce quindi un mezzo semplice per valutare l'efficacia di nuovi tetrazines radioattivi per fornire isotopi in vivo. Valutazione della bio-distribuzione di tutti i cinque 99m Tc-tetrazines assorbimento mostrato in articolazioni del ginocchio e della spalla 6 h dopo l'iniezione, dimostrando successo pre-targeting osso in vivo (Figura 4). Precedenti studi hanno confermato che radiomarcato TCO-BP accumula all'osso 18, mentre il costrutto 99m Tc-tetrazina (2) proposta da solo non fa (Figura 5). Questo permette di concludere che l'assorbimento osseo era dovuta alla reazione IEDDA.

I costrutti più lipofile 1 e 2 (1); 7.6 ± 2.7 (2)) e la spalla (4,6 ± 1,4 (1); 4,8 ± 1,9 (2)). Elevate concentrazioni di radioattività sono stati osservati anche nella cistifellea, fegato e intestino, che è coerente con la distribuzione del 99m Tc-lipofilo tetrazina composto 2 in assenza di TCO-BP (Figura 5). Altri tessuti non bersaglio e organi come il muscolo scheletrico e la milza non hanno mostrato alcun significativo assorbimento (<1%) quando gli studi bio-distribuzione sono state eseguite sulle 99m Tc-tetrazines in assenza del TCO-BP (Figura 5) , in modo da questi organi non sono state prese per gli esperimenti pre-targeting. Inoltre, esperimenti di bio-distribuzione con i 99m Tc-alone tetrazines hanno rivelato una buona distanza dai tessuti non bersaglio a iniezione postale 6 h. Di conseguenza, this punto di tempo, che è entro un tempo di dimezzamento dell'isotopo, è stata scelta come punto di tempo per confrontare i differenti ligandi tetrazina radiomarcati.

Il 99m Tc-polare tetrazina composto più 3 recante una PEG 5 linker ha mostrato molto alto ginocchio e spalla assorbimento (16.2 ± 4.8 e 20.7 ± 4.9, rispettivamente). C'era anche minore attività osservata nel fegato e nell'intestino. La corrispondente PEG 10 derivato anche mostrato vincolante per l'osso e ridotto assorbimento nel fegato rispetto ai composti 1 e 2. Il derivato più polare 5, mostrato inferiori vincolante rispetto a tutti gli altri costrutti che è probabile dell'osso a causa della sua rapida clearance.

La captazione ossea elevata e ossa: rapporti sangue (Tabella 1), in particolare per composti 3 e 4 dimostrano che pre-targeting e la reazione IEDDA possono essere utilizzati per loccomposti alize 99m Tc-etichettati in vivo. I metodi qui riportati possono essere utilizzati per valutare eventuali tetrazina radiomarcato compresa prossima generazione di Tc (I) ligandi -tetrazine. Va notato che per la classe di leganti che sono stati utilizzati in questo studio, le strutture possono essere facilmente variate cambiando la natura dei gruppi donatori e linker tra il complesso metallico e tetrazina, senza alterare significativamente il metodo di sintesi legante 21. Una volta che una molecola di piombo è identificato, un metodo kit istante, che probabilmente includerà metodi di purificazione in fase solida, può essere sviluppato per supportare traslazione clinica.

Il TC (I) complessi riportati qui creano l'opportunità di preparare nuovi radiofarmaci 99m Tc utilizzando una vasta gamma di diverse molecole TCO-derivato mira, tra cui gli anticorpi. Anticorpi, nonostante le loro proprietà di targeting eccellenti prima della creazione di tecnezio marcato tetrazines, non sarebbe typically essere utilizzato con 99m Tc causa della loro lenta clearance (giorni), che è molto più lungo del tempo di dimezzamento dell'isotopo (~ 6 h). Un ulteriore applicazione della chimica qui riportato è che la stessa classe di ligandi può essere preparato con la beta emettitori radionuclidi 186 Re e 188 Re. I isostructural Re (I) analoghi degli agenti Tc (I) quando combinati con il tumore cerca proprietà di TCO-BP possono essere usati per trattare metastasi ossee.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Argon gas Alphagaz --- ---
Na2CO3 EMD Millipore 106395 ---
Na2B4O7·10H2O Anachemia S9640 ---
KNaC4H4O6·4H2O Anachemia 217255 ---
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging --- Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging --- To elute generator
1 M HCl Lab Chem --- ---
MeOH Caledon --- ---
ACN Caledon --- HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific Barnstead Nanopure ---
DCM Caledon --- ---
TFA Caledon --- ---
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1x
BSA Sigma Aldrich A7906 ---
Tween80 Sigma Aldrich P8047 ---
Isoflurane CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC Waters 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) ---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8 ---
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041 ---
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R ---
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter ---
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range ---
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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