Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Developmental Biology

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Summary

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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Abstract

Eines der wichtigsten Ziele für die regenerative Medizin ist die Erzeugung und die Wartung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs). Bis vor kurzem haben Anstrengungen zur hPSCs in HSCs differenzieren überwiegend hämatopoetische Vorläuferzellen generiert, die fehlen, HSC-Potenzial, und stattdessen ähneln Dottersack Hämatopoese. Diese resultierenden hämatopoetischen Vorläuferzellen können Dienstprogramm für in-vitro- Krankheit Modellierung von verschiedenen Erwachsenen hämatopoetischer Erkrankungen, insbesondere der lymphatischen Linien beschränkt haben. Allerdings haben wir vor kurzem beschrieben Methoden zum Generieren von Erythro-Myelo-lymphatischen multilineage endgültige hämatopoetischer Vorläuferzellen aus hPSCs mit einem Stadium-spezifische gerichtete Differenzierung-Protokoll, die wir hier erläutern. Durch enzymatische Dissoziation des hPSCs auf Basalmembran Matrix-beschichtete Plasticware Embryoid Körper (EBs) gebildet. EBs unterscheiden sich um Mesoderm durch rekombinante BMP4, die anschließend von der GSK3β-Inhibitor, CHIR99021 zum endgültigen hämatopoetischen Programm angegeben ist. Alternativ wird primitive Blutbildung durch den PORCN-Inhibitor, IWP2 angegeben. Hämatopoese wird weiter durch die Zugabe von rekombinanten VEGF und unterstützende hämatopoetischen Zytokinen angetrieben. Die daraus resultierende hämatopoetischen Vorfahre generiert, mit dieser Methode haben das Potenzial für Krankheiten und Entwicklungsstörungen Modellierung, in Vitroverwendet werden.

Introduction

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) sind definiert als mit humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) und haben die einzigartige Fähigkeit, nicht nur in der Selbsterneuerung unter geeigneten Wachstumsbedingungen, aber auch die Fähigkeit, sich in alle Zelltypen differenzieren abgeleitet aus den drei Mikrobeschichten: Entoderm, Mesoderm und Ektoderm1. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeiten halten hPSCs große Verheißung für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und zellbasierte Therapien2. Während mehrere Zelltypen erfolgreich von hPSCs unterschieden wurde, ist eine große Herausforderung der in-vitro- Spezifikation ausschließlich Erwachsenen-wie hPSC hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen.

Eine wahrscheinlich Hindernis für die Entwicklung der menschlichen HSCs aus hPSCs ist das Vorhandensein von mehreren hämatopoetischen Programmen innerhalb der menschlichen Embryos3. Das erste Programm, das entsteht, "primitive Hämatopoese," bezeichnet, entsteht im Gewebe extraembryonic Dottersack und zeichnet sich durch seine vorübergehende Produktion von Erythroblast Vorfahren (EryP-CFC), Makrophagen und Megakaryozyten am besten. Vor allem, dieses Programm gibt keinen Anlass, HSCs, noch gibt es Anlass zu T- und B lymphoiden Vorläuferzellen. Allerdings der Dottersack vorübergehend eingeschränkt definitive hämatopoetischen Vorfahren, wie z. B. der Erythro-myeloischen Vorläuferzellen (EMP4,5,6,7,8) hervorrufen und die erythroiden-defizienten lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP9). Jedoch sind weder EMPs noch LMPPs, voll multipotenten oder HSC-ähnliche Engraftment in Erwachsenen Empfänger in der Lage. Im Gegensatz dazu wird später in der Entwicklung, das klassisch definierte "definitive" hämatopoetische Programm im Großraum Aorta-Gonade-Wachstum des Embryos richtige, was zu allen Erwachsenen hämatopoetischen Linien, einschließlich der HSC angegeben. Die Spezifikation dieser intra embryonalen definitive hämatopoetischen Zellen tritt in einer Kerbe-abhängigen Weise über eine endotheliale-hämatopoetischen Übergang von Hemogenic Endothel (er)3,10,11 ,12,13,14. Abgesehen von Rekonstitution Kapazität Multilineage potenzielle und Notch-Abhängigkeit von diesen Zellen lässt sich diese endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus der EMP und die LMPP (rezensiert in Referenzen3,13 unterscheiden ).

Verständnis der Mechanismen für primitiv und definitive hämatopoetischen Spezifikation von hPSCs dürfte für die reproduzierbare Produktion von definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen über eine Vielzahl von hPSC Linien von entscheidender Bedeutung. Bis vor kurzem existierten hPSC Differenzierung Protokolle, die multipotente primitive und definitive hämatopoetische Vorläuferzellen trennen konnte nicht15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Viele Ansätze mit fetalen bovine Serum (FBS) und/oder Stromazellen Kokultur zuerst umrissen der hämatopoetische Potenzial der hPSC Differenzierung, mit einer Mischung aus primitiven und endgültige hämatopoetischen potenzielle15,16, 17,19,22,23,25. Weitere, viele serumfreien hämatopoetischen Protokolle haben die Signal-Anforderungen für die Spezifikation von Mesoderm aus hPSCs, die blutbildenden potenzielle18,20,21, birgt beschrieben 24. wie diese Methoden noch heterogene Mischungen beider Programme hervorbrachte, deren Einsatz in klinische Anwendungen und Entwicklungsmechanismen Verständnis kann jedoch begrenzt.

Wir haben vor kurzem auf diesen Studien aufgebaut haben skizziert die Bühne-spezifische Signal Anforderungen an ACTIVIN/NODAL und WNT signalisieren in primitive und endgültige hämatopoetischen Spezifikation vom hPSC abgeleitet Mesoderm18,26 . Letzteres war besonders einzigartig, da die Nutzung der Bühne-spezifische WNT Signalmanipulation für die Spezifikation von ausschließlich primitiv oder ausschließlich endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen26ermöglicht. Während Mesoderm-Spezifikation, die Hemmung der kanonischen WNT signalisieren mit dem PORCN-Inhibitor IWP2 führt bei der Spezifikation von CD43+ EryP-CFC und myeloischer Vorläuferzellen mit kein nachweisbar lymphoide Potenzial. In scharfem Kontrast, Stimulation der kanonischen WNT-Signal mit dem GSK3β-Inhibitor, CHIR99021, in der gleichen Phase der Differenzierung führte in die völlige Abwesenheit von nachweisbaren CD43+ EryP-CFC, während gleichzeitig führt zu den Spezifikation der CD34+CD43 HE. Diese Bevölkerung besaß myeloische, HBG-erythroiden und T-lymphatischen Potenzial zum Ausdruck bringt. Spätere Analysen identifiziert, das er als Ausdruck CD7327,28 und CD18428und sein hämatopoetischen Potential fehlt Kerbe-abhängige28war. Weitere, einzellige klonale Analysen gezeigt, dass diese endgültige hämatopoetischen Linien von multipotenten Einzelzellen28abgeleitet werden können. Zusammen genommen, zeigen diese Studien, dass die Bühne-spezifische WNT signalisieren Manipulation pur primitive hämatopoetischen Vorläuferzellen oder multipotenten Kerbe-abhängige definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen angeben kann.

Hier beschreiben wir unsere Differenzierungsstrategie, die ausschließlich primitive oder endgültige hämatopoetischen Stammväter, durch Manipulation der kanonischen WNT signalisieren während mesodermalen Musterung und ihre nachgelagerten hämatopoetischen Linie Assays ergibt. Dieses Protokoll ist von großem Wert für die Ermittler, die die Produktion von entweder primitiv oder endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hPSCs für regenerative Medizin Anwendungen interessiert sind.

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Protocol

1. Reagenzien

  1. erhalten Zelle Linien embryonaler oder HiPSCs 1, Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) 29, OP9 DL4 Stroma 30 , 31.
  2. Reagenz Vorbereitung
    1. bereiten die 0,1 % w/V Lösung von Gelatine in PBS. Sterilisieren durch Autoklavieren und nach Aliquotierung bei 4 ° C lagern.
      1. Bereiten die Gelatine beschichtet Plastikwaren. Mantel 6-Well-Platten mit 1,5 mL 0,1 % Gelatine-Lösung. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Unmittelbar vor der Anwendung, Aspirieren verbleibenden Gelatinelösung.
    2. Bereiten die MEF-Medien durch die IMDM mit 15 % V/V FBS und 1 X Antibiotika. Ergänzen mit 2 mM L-Glutamin und 400 µM Monothioglycerol (MTG) vor der Verwendung und Lagerung bei 4 ° c
    3. Vorbereitung der hPSC Nährmedien als Lösung der DMEM/F12 mit 20 % V/V Ko Serum Ersatz (KOSR), 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 X Antibiotika, 55 µM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10 ng/mL bFGF. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und Lagerung im Dunkeln bei 4 ° c
    4. Vorbereitung der serumfreien Wash Medien als eine Lösung mit 5 % V/V KOSR DMEM/F12 und 4 mM HCl. Filter mit 2 µm Filter, Aliquoten, sterilisieren und Lagerung im Dunkeln bei 4 ° c
    5. Machen eine 1 mg/mL DNase ich Lösung durch Auflösen der DNase I für 3-4 h in eiskaltem, sterilen deionisiertes Wasser auf Eis. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und speichern Aliquote bei-20 ° c
    6. Bereiten die STOP-Lösung mit WASH Medien: Fügen Sie 10 % FBS und 10 µg/mL DNase ich. Die Stopplösung sollten bereit sein, unmittelbar vor der Benutzung.
    7. Vorbereitung die Basalmembran Matrix (z. B. Matrigel, genannt Matte hereon) Mischung Lösung.
      Hinweis: Alle Schritte Vorbereitung und Verwendung der Matten Mischung sollte durchgeführt werden, auf Eis oder bei 4 ° C. Thaw Matte im Eis bei 4 ° C über Nacht gefroren. MAT 1:1 zu verdünnen, durch Zugabe von 10 mL eiskaltes IMDM und Chill im Eis bei 4 ° C über Nacht. Verdünnen Sie MAT Mischung mit einem zusätzlichen 20 mL eiskaltes IMDM und Chill im Eis bei 4 ° C über Nacht. Aliquot in vorgekühlt Tuben und Speicher bei-20 ° C bis zur Verwendung. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, tauen Sie MAT Mischung über Nacht bei 4 ° C.
      1. Mantel der Matte Kultur Zellplatten.
        Hinweis: Alle Schritte des MAT Lackplatten sollte auf Eis durchgeführt werden. Pre-chill 6-Well und 24-Well-Platten bei-20 ° C für mindestens 1 h. Wenn Sie Fell Platten fertig sind, legen Sie sie auf dem Eis. Jedes gut mit 4 X verdünnt Matte entfernen und die Wiederverwendung von jede überschüssige Lösung zu beschichten. Lassen Sie für 30-60 min auf Eis und aspirieren Sie überschüssige Matte. Trocknen Sie die Matten beschichteten Platten in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator für ein Minimum von 3 h. Verwendung innerhalb von 72 h Beschichtung.
    8. Bereiten Sie die Lösung 10 % Bovine Serum Albumin (BSA) durch Auflösen von 10 % w/V BSA im eiskalten, destilliertem, entionisiertem Wasser bei 4 ° C für ca. 3-4 h Filter mit 2 µm Filter in einer lichtundurchlässigen Flasche und speichern bei 4 sterilisieren ° C.
    9. Bereiten Sie die Ascorbinsäure-Lösung. Lösen Sie langsam eine 5 mg/mL Lösung von L-Ascorbinsäure in eiskalten, destilliertem, entionisiertem Wasser auf Eis für 3-4 h Wirbel gelegentlich bis aufgelöst auf. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und speichern Aliquote bei-20 ° c
    10. Serumfreien Differenzierung (SFD) Medien vorbereiten, indem man eine Lösung von 75: 25 von IMDM:Ham ' s f-12, dann fügen Sie 0,5 % BSA, 1 x B27 und 0,5 x N2 Ergänzungen. Bei 4 ° C. Add 1 x L-Glutamin, 50 µg/mL Ascorbinsäure 400 µM MTG und 150 µg/mL Holo-Transferrin unmittelbar vor der verwenden.
    11. Bereiten serumfreien Stammzellen Nährmedien (z. B. StemPro, genannt SP34 hereon) pro Hersteller ' Anweisungen. Bei 4 ° C. Add 1 x L-Glutamin, 50 µg/mL Ascorbinsäure 400 µM MTG und 150 µg/mL Holo-Transferrin unmittelbar vor der verwenden.
    12. 0,2 % Kollagenase II Lösung durch auflösende Kollagenase II, eine Endkonzentration von 0,2 % w/V in 1:4 FBS:PBS Lösung zubereiten. Lösen sich im Wasserbad 37 ° C für mindestens 15 min. Filter Lösung mit 2 µm Filter zu sterilisieren und speichern Aliquote bei-20 ° c
    13. Bereiten die Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS) Puffer als eine Lösung von 5 % FBS in IMDM unmittelbar vor der verwenden.
    14. Bereiten OP9 Medien als Lösung der α-MEM, 20 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 X Antibiotika. Filter mit 2 µm Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° c
    15. Zu Methylcellulose-basierte Medien (z. B. MethoCult, als MeC hereon bezeichnet) erhalten, als Pre-regelmÄÑig 3 mL Mengen oder als einen 100-mL-Flasche. Wenn die 100 mL MeC, bei der Ankunft, mit Teilen in 2,5 mL Aliquots in 14 mL konische Röhrchen.
      Hinweis: Alle Aliquote lagern Sie bei-20 ° c MeC mittleren Aliquote sollte unmittelbar vor dem Auftauen verwenden.

2. Mesoderm Differenzierung der hPSCs

  1. wachsen der hPSC Zelllinien auf MEFs zu 70-80 % Konfluenz in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2.
    Hinweis: Sollte die hPSCs scharfe, undifferenzierte Grenzen haben.
  2. Bereiten Matte beschichtet Plasticware 24 h vor der hPSCs Passagierung.
    Hinweis: Die Gesamtzahl der Matte beschichtet 6 wohlen Teller variiert hPSC Linien. In der Regel genügen drei 6-wohlen Teller pro 6-Well Schale von konfluierende hPSCs auf MEFs.
    1. Perform Freiung Feeder-Erschöpfung mit unterschiedlichen Seitenverhältnissen konfluierende hPSCs:MAT Wells (1:4, 1:3, 1:2, etc.) vor der ersten Differenzierung bestimmen, wieviele Matte beschichtet 6 wohlen Teller für nachfolgende Differenzierungen verwendet werden sollen.
      Hinweis: sollte 24 h nach der Beschichtung auf Matte, die hPSCs 80-90 % Zusammenfluss mit Zelle Klumpen von ca. 10-20 Zellen in der Größe sein.
  3. Aspirieren hPSC Medien und 1 mL 37 ° C 0,25 % Trypsin-EDTA zu jedem gut für 1 min. Absaugen und fügen Sie 1 mL STOP Medien in jede Vertiefung. Mit einem Zelle Schaber, kratzen Sie die Zellen aus der Platte. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer in jede Vertiefung.
    1. Mit einer 2 mL serologische pipettieren, genannte 3 - 5 Mal zu brechen große Klumpen von Zellen und die Zellen auf ein 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge hPSCs 330 X g für 5 min.
  4. Aufschwemmen der Zellen in einem Gesamtvolumen von hPSC Medien entspricht 2 mL pro Well von der Matte beschichtet Kunststoffteile verwendet werden. Die Kunststoffteile 2 mL/Brunnen des hPSCs hinzu und inkubieren Sie über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2.
  5. 24 h später, aspirieren Sie die Medien und ersetzen Sie mit 37 ° C 0,05 % Trypsin-EDTA für 1 min. Aspirieren Trypsin-EDTA und 1 mL STOP Medien hinzufügen. Kratzen Sie die Zellen kräftig mit einer Zelle-Spachtel. Fügen Sie 1 mL WASH Medien in jede Vertiefung. Mit einer 2 mL serologische Pipettieren genannte Zellen 1-2 Mal und auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 220 X g für 5 min.
    Hinweis: Die Länge der Zeit von Trypsin-EDTA Behandlung shouLD werden durch den Prüfarzt für jede hPSC Zeile bestimmt. Die Trypsin-Behandlung sollte so lange wie möglich angewendet werden, ohne dass einzellige Dissoziation. Dieser Schritt sollte lösen alle hPSCs von den MAT-beschichteten Platten, aber nicht in einzelne Zelle Dissoziation führen. Daraus resultierende EBs sollte im Durchschnitt 6-10 Zellen,.
  6. Aspirieren der Medien. Mit einer 5 mL serologische pipettieren, sanft Aufschwemmen der Zellen in 20 mL WASH Medien. Zentrifuge bei 220 X g für 5 min.
  7. Sanft Aufschwemmen der EBs im Tag 0 Medien (Tabelle 1). 2 mL der Differenzierung Medien mit EBs in jede Vertiefung eine 6-Well Low-anhaftende Zelle Kulturschale mit einer 10 mL serologische Pipettieren zu verzichten. Platz in einem 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 (Multi-Gas) Inkubator.
    Hinweis: Tag 0 Medien: SFD Medien ergänzt mit 10 ng/mL BMP4 (Tabelle 1). Für jeden zwei Platten aus hPSCs, verwenden Sie ein 6-Well Low-anhaftende Zelle Kulturschale.
  8. 24 h später hinzufügen 2 mL Tag1 Medien (Tabelle 1). Die Zellen über Nacht in einem Multi-Gas-Inkubator inkubieren.
    Hinweis: Tag 1 Medien: SFD Medien ergänzt um 10 ng/mL BMP4 und 10 ng/mL bFGF in jede Vertiefung (Tabelle 1).
  9. 18 h später sanft ernten die EBs mit 5 mL serologische pipettieren und Spin 100 X g für 5 min. Waschen und die gesamte Kultur mit 10 mL IMDM kombinieren. Spin 100 X g für 5 min. Aspirat Medien.
    Hinweis: Schmutz gibt es in den Kulturen. Dieser Zentrifugationsschritt bei niedriger Drehzahl (100 X g) werden die Trümmer entfernt.
  10. Sanft Aufschwemmen der EBs in SFD Medien ergänzt mit Tag2 Medien (Tabelle 1) und dann 2 mL pro Bohrloch in 6-Well Low-anhaftende Zellplatten Kultur zu verzichten. Brüten in einem 37 ° C-Multi-Gas-Inkubator für 30 h
    Hinweis: Tag 2 Medien: 10 ng/mL BMP4, und 5 ng/mL bFGF und die entsprechenden WNT Agonist oder Antagonist (Tabelle 1).
    1. Add 3 µM CHIR99021 endgültige hämatopoetische Vorläuferzellen angeben. Alternativ fügen Sie 3 µM IWP2 und 1 ng/mL Activin A primitive hämatopoetische Vorläuferzellen angeben.
  11. Weiter zu Abschnitt 3 für Angabe der hämatopoetischen Vorläuferzellen.

3. Spezifikation von CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen

  1. nach 30 h, isolieren die EBs mit einer 2 mL serologische Pipettieren am Tag3 der Differenzierung. Übertragen auf ein 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren bei 330 X g für 5 min. sanft Aufschwemmen und waschen mit 10 mL IMDM. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder bei 330 X g für 5 min.
  2. Aufschwemmen der EBs in Tag3 Medien (Tabelle 2) und 2 mL in jede Vertiefung des Low-Anhänger 6-Well Platten zu verzichten. Inkubieren Sie Zellen in einem 37 ° C-Multi-Gas-Inkubator für 72 h
    Hinweis: Tag 3 Medien: SP34, ergänzt mit 15 ng/mL VEGF und 5 ng/mL bFGF (Tabelle 2). Fügen Sie mehr Medien pro Bohrloch hinzu, wenn der pH-Wert des Mediums, geerntet am Tag3 der Differenzierung (d.h., gelb-Orange-Medien) erheblich verändert hat. Alternativ verwenden Sie weniger EBs pro Bohrloch am Tag 0.
  3. Nach 72 h Inkubationszeit, fügen Sie 2 mL Tag 6 Medien (Tabelle 2) in jede Vertiefung. Brüten in einem 37 ° C-Multi-Gas-Inkubator für weitere 48 h
    Hinweis: Tag 6 Medien: SP34 Medien ergänzt mit 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPA, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 und 50 ng/mL IGF-1 (Tabelle 2). Wenn mehr Medien in Schritt 3.1 hinzugefügt wurde, fügen Sie die entsprechende Menge an Medien in Schritt 3.2 so dass die endgültige Zytokin-Konzentrationen unverändert.
  4. Isolieren der CHIR99021 behandelt EBs am 8. Tag der Differenzierung. Fahren Sie mit Abschnitt 4.
  5. IWP2-behandelten EBs am 8. Tag der Differenzierung in ein 50 mL konische Röhrchen geerntet werden. Zentrifuge bei 330 X g für 5 min. sanft Aufschwemmen in Tag 8 Medien (Tabelle 2). 24 h in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator in niedrigen anhaftende Gerichte inkubieren. Fahren Sie mit Abschnitt 4.
    Hinweis: Tag 8 Medien: SP34 Medien ergänzt mit 100 ng/mL SCF 2 IU EPA, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L und 30 ng/mL IL-3 (Tabelle 2).

4. Enzymatische Dissoziation der EBs und hämatopoetischen Vorläuferzellen Isolation

  1. isolieren die EBs mit einer serologischen Pipettieren in ein 50 mL konische Rohr. Zentrifuge bei 330 X g für 5 min. Aspirat aus der Überstand.
  2. 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA hinzufügen der EBs. Vortex für 5 S. Inkubation bei 37 ° C Wasserbad für 8 min. hinzufügen 5 mL Stopp-Lösung. Zentrifuge bei 330 X g für 5 min. Aspirat aus der Überstand.
  3. Aufschwemmen der EBs in 5 mL Kollagenase II. Wirbel für 5 s und im Wasserbad 37 ° C inkubieren. Nach 60 min, Wirbel für 5 s und 5 mL Stopp-Lösung. Drehen mit 330 X g für 5 min. Aspirat aus der Überstand.
  4. In 1 mL des Puffers FACS, Aufschwemmen der Zellen. Ein 40 µm-Sieb Zelle durchlaufen Sie Zellen. Dies entfernt alle undissoziierten Zelle Klumpen.
  5. Zählen die Zellen. Aliquoten 1 x 10 6 Zellen in ein 14 mL konische Rohr. Drehen der Zellen bei 330 X g für 5 min. Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen/mL in Puffer FACS. Aliquoten und Pool 10 % der Zellen in jedem Zustand für Ablaufsteuerungen durchflusszytometrischen Farbe. Die Zellen Antikörper für 30 min auf Eis, im Dunkeln inkubieren.
    Hinweis: Siehe Fluorophor Kombinationen in Tabelle Materialien vorgeschlagen.
    1. Für IWP2-behandelten Zellen verwenden Antikörper Anti-CD34 und Anti-CD43.
    2. Für CHIR99021-behandelten Zellen verwenden Sie Anti-CD34, Anti-CD43, Anti-CD73 und Anti-CD184 Antikörper.
  6. Die Zellen zweimal mit FACS Puffer spülen. Drehen sich mit 330 X g für 5 min. Aufschwemmen der Zellen auf eine Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen/mL.
  7. Analysieren oder Isolat Zellen durch Durchflusszytometrie. Analysieren Sie für primitive hämatopoetischen Vorläuferzellen die CD34 und CD43 Ausdruck ( Abbildung 2A). Für definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen, isolieren das HE (CD34 + CD43 CD73 CD184 ) durch FACS ( Abb. 2 b). Sammeln Sie die Zellen in Röhrchen mit gekühlten FACS Puffer.
  8. Zu beurteilen, das definitive hämatopoetische Potenzial von isolierten HE, weiter zu Abschnitt 5 für den Endothelzellen, hämatopoetischen Übergang oder Abschnitt 7 für T-lymphatischen Assay. Weiterhin für primitive hämatopoetischen CFC-Assays, Abschnitt 6.

5. Endothelial-hämatopoetischen Übergang

  1. Spin der isolierten CD34 + CD43 CD73 CD184 Zellen bei 330 X g für 5 min. Aufschwemmen Zellen in er Medien bei 200.000 Zellen/mL ( Tabelle 2). Verteilen Sie die Zellen in 50 µL-Aliquots in eine 96-Well Low-anhaftende Zellplatte Kultur. Die Zellen über Nacht in einem 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 Multi-Gas Inkubator inkubieren.
    Hinweis: Er Medien: SP34 Medien ergänzt mit 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPA 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL Angiotensin II und 100 µM Losartan Kalium bei 2 x 10 5 Zellen/mL (Tabelle 2).
  2. Bereiten Sie die 24-Well MAT-beschichtete Platten (siehe Schritt 1.2.7.1),.
  3. Werden die Zellen über Nacht in Klumpen von 6-10 Zellen aggregieren. Übertragen Sie für jede 50 µL Volumen von reaggregated Zellen sanft die Zellen in der Mitte einer 24-Well MAT-beschichtete Platte am nächsten Morgen. Sanft lege Platte in 37 ° C Multi-Gas Inkubator für 4-6 h, bis die Zellen verbunden sind.
  4. Add 1 mL frisch HE Medien in jede Vertiefung, nachdem die Zellen verbunden sind. Die Zellen in einem 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 Multi-Gas Inkubator inkubieren, bis die blutbildenden Zellen sichtbar sind (in der Regel 5-7 Tage; Abb. 2D). Weniger als 100 X Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop zu visualisieren.
  5. Ernten die definitive hematopoietic Vorfahre indem Sie sanft den HE-Medien aus Zellen. Dieses Medium durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren und sammeln. Adhärenten Zellen in den Brunnen, hinzufügen 0,5 mL 0,25 % Trypsin-EDTA, Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. hinzufügen 0,5 mL Stopplösung in jede Vertiefung. Durchlaufen Sie die Zellen durch die gleichen 40 µm Zelle Sieb, alle Anhänger zu bündeln und nicht anhaftende Zellen zusammen. Drehen mit 330 X g für 5 min.
    1. Um die CFC-Potenzial dieser Massen-Kultur zu beurteilen, fahren Sie mit Abschnitt 6.
  6. Zellen zweimal im FACS Puffer zu waschen. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  7. Aufschwemmen der Zellen in FACS Puffer 5 x 10 6 Zellen/ml. Die Zellen mit Anti-CD45 und Anti-CD34 Antikörper für 30 min auf Eis im Dunkeln Fleck (vorgeschlagen Fluorophore sind in der Tabelle der Werkstoffe).
  8. Waschen die Zellen zweimal in FACS-Puffer. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  9. Isolieren die CD34 + CD45 + Zellen durch FACS ( Abbildung 2E). Sortieren Sie die Zellen in gekühlten FACS Puffer.
  10. Bewerten die definitive CD34 + CD45 + hämatopoetischen Vorläuferzellen als benötigte (CFC Assay in Abschnitt 6, lymphatischen Potenzial in Abschnitt 7 oder eine andere wissenschaftsinitiierten Assay).

6. CFC-Assay

  1. tauen Aliquote des MeC für jede Probe für die CFC-Assay verwendet.
  2. Der Zellen zu definierten (Schritte 4.5, 4.7, 5.5 oder 5,9) in MeC hinzufügen. Vortex gründlich und lassen Sie die MeC-Kulturen für 5-10 min, stehen bis Luftblasen zu, gemäß der Hersteller zerstreuen ' Anweisungen. Mit einem 16 ½ gauge Nadel auf eine 3 mL Spritze, entfernen Sie vorsichtig die MeC 2 mL.
    Hinweis: Typische Beschichtung dichten reichen von 1.000-20.000 Zellen/mL, abhängig von der Häufigkeit der erwarteten Vorläuferzellen.
  3. Verzichten, sorgfältig, 1 mL MeC Zelle Mischung in jedem der zwei 35 mm Gewebekultur Schalen. Verteilen Sie gleichmäßig die MeC in den 35 mm-Gerichten durch sanft klopfen und drehen der Schale. Legen Sie jedes der oben genannten Gerichte in einem 15 cm Gewebekultur Schüssel mit Wasser gefüllt. In einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator inkubieren.
  4. Visualisieren die MeC-Kulturen mit einem Licht Mikroskop 40 X Vergrößerung. Quantifizieren Sie die verschiedenen FCKW erhalten. Analysieren Sie die primitiven CFC-Assays 8-10 Tage nach der Beschichtung ( Abbildung 2). Analysieren Sie die Definitive CFC-Assays 14 Tage nach der Beschichtung. Repräsentative CFC Assay Kolonie Morphologien sehen Sie in Abbildung 2F.

7. T-Zell-Assay etablieren Definitive hämatopoetischen Potenzial

  1. , wachsen die OP9 DL4 Zellen bis zum Zusammenfluss in 100 mm Gewebekultur Gericht 30 31 , 32.
    1. Tauwetter OP9-DL4 Zellen 72-96 h vor der Beschichtung der T-Zell-Assays. Aufschwemmen Sie OP9 DL4 Zellen in 10 mL OP9 Medien und in einem 10 cm Teller zu verzichten. Wachsen in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator bis 70-90 % Zusammenfluss.
    2. Bis zur Ernte der OP9 DL4 Zellen aus einer Schüssel 100 mm entfernen Sie das Medium und 5 mL 0,25 % Trypsin-EDTA 5 min. stoppen die Trypsin-Aktivität mit 5 mL OP9 Medien. Drehen der Zellen bei 330 X g für 5 min. Aufschwemmen Zellen in 1 mL OP9 Medien und die Zellen zu zählen.
      Hinweis: Ein 10 cm Teller konfluierende OP9 DL4 Zellen ergibt ca. 10 x 10 6 OP9 DL4 Zellen.
    3. 48 h vor der T-Zell-Test, Platte 2 x 10 6 Zellen in 12 mL OP9 Medien in einer 24-Well-Schale (0,5 mL/Na). Wachsen in einem 37 ° C 5 % CO 2 Inkubator.
  2. 1 von OP9 DL4 Zellen in OP9 Medien ergänzt mit gut 2.000-10.000 Zellen untersucht werden (wie in den Schritten 4.5, 4.7, 5.5 oder 5,9) hinzufügen: 30 ng/mL SCF (ersten 6 Tage nur), 5 ng/mL IL-7 und 5 ng/mL FLT3-L. Inkubation bei 37 ° C 5 % CO 2 inc Ubator. Keine Medien Änderungen bei diesem Schritt.
  3. Alle 4 - 5 Tage, passage die T Zelle Vorfahre auf Frischzellen OP9 DL4 Stromatumoren in einer 6-Well-Schale. Genannte Zellen mit einer 1 mL pipettieren und durchlaufen einen 40 µm-Filter um Klumpen zu entfernen. Drehen Sie mit 330 X g für 5 min. Absaugen aus den Medien. Aufschwemmen der Zellen in 2 mL frische OP9 Medien ergänzt mit 5 ng/mL IL-7 und 5 ng/mL Flt3-L und auf Frischzellen OP9 DL4.
    Hinweis: 48 h vor Passagierung, Platte 2 x 10 6 OP9 DL4 Frischzellen in 12 mL OP9 Medien und 2 mL/Brunnen in 6-wohlen Teller verteilen.
  4. Nach mindestens 21 Tagen Kokultur genannte Zellen kräftig und durchlaufen einen 40 µm-Filter, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Mit 330 X g für 5 min drehen und aspirieren des Überstands.
  5. Waschen die Zellen zweimal im kalten FACS-Puffer. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  6. Aufschwemmen der Zellen in FACS Puffer 5 x 10 6 Zellen/ml. Fleck-Zellen mit Anti-CD45, Anti-CD56, Anti-CD4 und CD8-Anti Antikörper für 30 min auf Eis im Dunkeln (empfohlene Fluorophor sind Kombinationen in Table of Materials). Wenden Sie einen lebenden/Toten Zelle Fleck (DAPI, etc.) um Schmutz aus der Analyse.
  7. Waschen die Zellen zweimal in FACS-Puffer. Drehen mit 330 X g für 5 min.
  8. Analysieren die Zellen mit einem Durchflusszytometer um zu beurteilen, das Vorhandensein von T-Lymphozyten Stammväter ( Abbildung 3).

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Representative Results

Eine schematische Darstellung der Induktions von primitiven und endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hPSCs ist in Abbildung 1dargestellt. Mesoderm Musterung von kanonischer WNT signalisieren, während der 2. und 3. Tag der Differenzierung, gefolgt von hämatopoetischen Vorläuferzellen Spezifikation auftritt.

Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse und koloniebildenden Methylcellulose Assays hPSC abgeleitet hematopoietic Differenzierung Kulturen sind in Abbildung 2dargestellt. IWP2-behandelten Differenzierung Kulturen ergeben eine deutliche CD34+CD43 und CD34niedrig /CD43+ Bevölkerung, während Differenzierung CHIR-behandelten Kulturen haben < 1 % CD43+ Zellen am 8. Tag des Differenzierung (Abb. 2AB)26. Primitive hämatopoetische Vorläuferzellen unter IWP2 Bedingungen isoliert am Tag 9 abgeleitet werden überwiegend primitive erythroiden (EryP-CFC) und entstehen myeloischen Vorläuferzellen in der Methylcellulose-Assays während CHIR-behandelten Kulturen weitgehend frei von CFC werden Potenzial in diesem Stadium (Abbildung 2F). Stattdessen die CD34+CD43 Bevölkerung abgeleitet von der CHIR99021-Behandlung ist eine heterogene Bevölkerung mit endothelialen Vorläuferzellen sowie CD34+CD43CD73CD184 HE () Abbildung 2 b), die bei isoliert durch FACS, bilden zunächst eine Monolage endothelial-ähnliche Zellen (Abbildung 2D, linken), die dann einen endotheliale-hämatopoetischen Übergang, Runde, strahlenbrechende nicht-Anhänger wiederum erfährt blutbildenden Zellen (Abb. 2D, rechts). Diese blutbildenden Zellen durch Durchflusszytometrie für den Ausdruck von CD34 und CD45 beurteilt werden können (Abb. 2E). Hämatopoetische Vorläuferzellen, die isoliert von der EHT-Assays in Methylcellulose Assays verwendet werden und geben Anlass zu großen platzen-wie erythroiden Koloniebildenden Einheiten (BFU-E), kleine erythroiden Koloniebildenden Einheiten (CFU-E) und myeloischer Vorläuferzellen (KBE-M; ( Abb. 2F).

Abbildung 3 zeigt repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Analyse der die T-Lymphozyten-Assays aus CHIR99021 stammenden CD34+CD43CD73CD184 hämatopoetischen Vorläuferzellen (Abbildung 3A) und IWP2 abgeleitet (Abb. 3 b) CD34+CD43 hämatopoetischen Vorläuferzellen, nach 21 Tagen OP9 DL4 Kokultur. Das Vorhandensein von einem CD45+CD56CD4+CD8+ Bevölkerung in CHIR stammenden Vorfahren ist bezeichnend für definitive hämatopoetischen Potenzial innerhalb der Eingabe CD34+ Bevölkerung. CD34+ und CD43+ Vorfahren isoliert aus IWP2 stammenden Unterscheidungen keinen Anlass zu T-Lymphozyten in diesem Assay unter diese Differenzierung Bedingungen18,26.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls für die Festlegung der endgültigen und primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen. Darstellung der wichtigsten experimentellen Schritte und Timelines der Differenzierung von EBs, definitive und primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen. EBs entstehen am Tag 0 von hPSCs auf Matte beschichtet Plastikwaren. EBs angebaut in SFD Medien mit BMP4 in einem Multi-Gas-Inkubator. Am 1. Tag der Differenzierung werden Kulturen mit Medien ergänzt mit BMP4 und bFGF gefüttert. Am 2. Tag tritt ein Medienwechsel bei WNT Manipulation durch die Zugabe von CHIR99021 (CHIR) für definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen und IWP2 für primitive hämatopoetischen Vorläuferzellen. Am 3. Tag werden Medien in SP34, ergänzt mit VEGF und bFGF geändert. Am 6. Tag gefüttert werden Kulturen mit Medien mit hämatopoetischen Cytokinen ergänzt. Am 8. Tag der primitiven hämatopoetischen Spezifikation die Medien verändert und Zellen werden in einer 5 % CO2 Inkubator für 24 h, gefolgt von der hämatopoetischen Vorläuferzellen Zelle (HPC) Test verschoben. Am 8. Tag des endgültigen hämatopoetischen Spezifikation, CD34+CD43CD73CD184 Zellen sind durch FACS isoliert und untersucht für definitive Hemogenic endothelial Potenzial oder T-lymphatischen Potenzial (nicht abgebildet). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse der Differenzierung Kulturen und Erzeugung von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen. (A) repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Analyse von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus IWP2 behandelt EBs am 8. Tag. (B) repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Analysen von CHIR99021 behandelt EBs am 8. Tag. Hemogenic Endothel (er) kann identifiziert und isoliert als eine CD34+CD43CD73CD184 Bevölkerung. (C) koloniebildenden Potenzial der 9.Tag hämatopoetischen Vorläuferzellen aus IWP2 und CHIR99021 (CHIR) behandelt Differenzierung Kulturen. n = 3, Fehlerbalken darzustellen SD des Mittelwerts, Sternchen geben statistischen Signifikanz, mit der Student t-Test *** p < 0,0001. (D) repräsentative Fotos von isolierten Zellen er nach 4 Tagen (links) oder 7 + Tage (rechts) des Wachstums auf Matte beschichtet Plastikwaren. Ursprüngliche Vergrößerung, 100 X. Skalieren von Balken = 100 µm. (E) repräsentative Durchflusszytometrie CD34 und CD45 Ausdruck vom endgültigen hämatopoetischen Vorläuferzellen nach 9 Tagen der Kultur. (F) repräsentative Foto zeigt Morphologie der EryP-CFC (links), KBE-M (Mitte), BFU-E und CFU-E (rechts). Ursprüngliche Vergrößerung 40 X. Skalieren von Balken = 100 µm. Pfeile zeigen die Kolonien benannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: endgültige hämatopoetischen Potenzialanalyse. Repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Analysen von T-Lymphozyten Potenzial der CHIR abgeleitet CD34+CD43CD73CD184 hämatopoetischen Vorläuferzellen (A) oder (B) CD34 IWP2 abgeleitet+CD43 hämatopoetischen Vorläuferzellen, 28 Tage nach Kokultur mit OP9 DL4 Zellen. Die T-Lymphozyten-Potenzial von einer Probe gilt als positiv, wenn es mehr als 100 CD45 gibt+ Ereignisse erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

alt = "immer" > SFD Medien Tag 0 Tag1 2. Tag endgültig Tag 2-Grundkörper BMP4 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL bFGF – 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL Activin A – – – 1 ng/mL CHIR99021 – – 3 ΜM – IWP2 – – – 3 ΜM

Tabelle 1: SFD-basierte Medien tagelang 0 - 2.

SP34 Medien Tag3 Tag 6 Tag 8 ER
VEGF 15 ng/mL 15 ng/mL 5 ng/mL
bFGF 5 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL
SCF 200 ng/mL 100 ng/mL 100 ng/mL
EPA 4 IU 2 IE 2 IE
IL-6 20 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-11 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL
IGF-1 50 ng/mL 25 ng/mL 25 ng/mL
TPO 30 ng/mL 30 ng/mL
FLT - 3L 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-3 30 ng/mL 30 ng/mL
BMP4 10 ng/mL
SHH 20 ng/mL
Angiotensin II 10 µg/mL
Losartan Kalium 100 ΜM

Tabelle 2: SP34-basierte Medien für 3 Tage - 8 und er.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine rasche, Serum-frei, Stroma Methode für die Differenzierung von primitiven oder definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen. Mesodermalen Spezifikation der primitiven oder definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen kann zuverlässig mit unserem Protokoll, welches eindeutig niedermolekularer Hemmer der kanonischen WNT signalisieren nutzt erreicht werden. Bühne-spezifische WNT Aktivierung durch den GSK3β-Inhibitor CHIR9902133 gibt Anlass zu endgültigen hämatopoetischen Mesoderm, während WNT Hemmung durch die PORCN-Inhibitor IWP234 primitiver hämatopoetischer Mesoderm26gibt. Der Hinweis Diese Methode nicht robust zu einer engraftable HSC-wie Bevölkerung (nicht dargestellt) führen. Jedoch sind die definitive hämatopoetischen Vorfahre mit diesem Ansatz generiert zugänglich Transgen-induzierte Engraftment potenzielle35, Hervorhebung ihrer Einsatzmöglichkeiten in Zukunft translationalen.

Ein entscheidende Faktor für erfolgreiche hPSC Differenzierung ist die Anfangsgröße der EBs, die vom hPSCs gebildet werden. Im Idealfall sollte der EBs um 6-10 Zellen in der Größe. Die Differenzierung Kulturen können eine Mischung aus beiden Programmen akzessorisch angeben, wenn der EBs zu groß ist, möglicherweise aufgrund unsachgemäßer Signal Aktivierung innerhalb der EB sind. Differenzierung Kulturen sollte für optimale EB Größe innerhalb der ersten 24 Stunden der Differenzierung visuell überprüft werden. Alternativ, wenn der hPSCs auf einzelne Zellen vollständig dissoziiert sind, unterziehen die hPSCs stattdessen Anoikis Zelle Tod36, was zu schlechten hämatopoetischen Differenzierung.

Eine erfolgreiche Differenzierung geben Anlass zu ausschließlich primitiver hämatopoetischer Vorläuferzellen, wenn IWP2 während mesodermalen Spezifikation auf Tag 2 und 3 dieser Differenzierung-Protokoll verwendet wird. Am 8. Tag der Differenzierung, sollte die IWP2 abgeleitet Kultur bestehen unterschiedliche CD34+CD43, CD34Mitte/niedrigenCD43+und CD34CD43+ Populationen (Abbildung 2A). Die CD34-Mitte/niedrigenCD43+ Bevölkerung ergeben sich primitive erythroiden und myeloischer Vorläuferzellen; zwar die CD34CD43+ Bevölkerung in erster Linie führt zu erythroiden Vorläuferzellen mit begrenzten myeloische potenzielle18. Das primitive hämatopoetische Potenzial kann durch die Methylcellulose-Test auf das Vorhandensein von EryP-CFC (Kap. 6), welche wird überwiegend zum Ausdruck bringen das embryonale Globin HBE im Vergleich zu fetalen HBG26bestätigt werden, 28,37. Ebenso die Anwesenheit von CD43+ hämatopoetische Vorläuferzellen in diesem Stadium können zuverlässig verwendet werden, um das Vorhandensein von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen18,23,26. Es sei darauf hingewiesen, dass CD43 Ausdruck nicht exklusiv für Vorfahren der primitiven hämatopoetischen Programm18,23,26 ist, und kann nicht als alleinige Metrik verwendet werden, um Primitive hämatopoetischen bewerten mögliche, bleibt als Immunophenotype und NOTCH-Abhängigkeit des menschlichen EMP Fußgelenkes (rezensiert in3).

Wenn CHIR99021 während mesodermalen Musterung in Tag 2 und 3 der Differenzierung verwendet wird, wird eine Bevölkerung von ausschließlich endgültige hämatopoetischen Vorläuferzellen angegeben werden. Am 8. Tag des Protokolls Differenzierung, sollte eine unverwechselbare CD34 CHIR99021 abgeleiteten Kulturen bestehen+CD43 Bevölkerung, mit wenig bis keine CD43 Ausdruck26. Die CD34+CD43 Bevölkerung ist eine heterogene Bevölkerung von Endothelzellen mit hämatopoetischen, venöse und arterielle Potenzial, das abgegrenzt werden können basierend auf CD73 und CD184 Ausdruck mit HE Zellen fehlt des Ausdrucks der beiden 27,28. Bei der endgültigen er ist isoliert nach durchlaufen eine Kerbe-abhängige Endothelzellen, hämatopoetischen Übergang (Abschnitt 5)28 erbringt es CD34+CD45+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, die BFU-E und myeloische Zellen auslösen werden Methylcellulose, aber nicht EryP-CFC26,28 (Abbildung 2). Darüber hinaus können BFU-E Kolonien isoliert und bewertet für die Globin-Analyse, welche wird überwiegend zum Ausdruck bringen das fetale Globin HBG im Vergleich zu embryonalen HBE (nicht dargestellt)26,28, 37. im Gegensatz dazu kann der lymphatischen Potenzial direkt beurteilt werden von HE, isoliert, wie die Kerbe-abhängige Endothelzellen, hämatopoetischen auf der OP9-DL4 Stroma18,26,28 Übergangs. Das endgültige, den, das er mit dieser Methode angegeben, enthält Erythro-Myelo-lymphatischen Vorläuferzellen bei einer klonalen Ebene28, funktional unterscheidet es von unser gegenwärtiges Verständnis der EMP oder LMPP Vorfahren3. Als solche, das Vorhandensein von T-lymphatischen und HBG-Ausdruck erythroiden potenzielle, gepaart mit fehlender EryP-CFC Potenzial lässt sich zuverlässig die definitive hämatopoetische Spezifikation von hPSCs anzeigen. Note, Beurteilung ausschließlich für Stammväter, die Anlass zu HBGkönnen-kann das definitive Potential, als ähnlich wie oben beschrieben, die menschlichen EMP und deren Signal-Anforderungen nicht genau zu bestimmen, wurde nicht mit dem Ausdruck Erythroblasts bis dato (rezensiert in Referenz3) gekennzeichnet.

Diese einfache Differenzierungsstrategie ist sehr mächtig, denn es ermöglicht die Erzeugung von ausschließlich primitive oder ausschließlich definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen, Krankheit vergleichende Studien über die beiden Programme von Patienten abgeleitet iPSCs Modellierung ermöglicht oder hPSCs gen geändert. Ebenso können die menschliche Entwicklungsprozesse abgefragt werden, z. B. entdecken, was zusätzliches Signal Pathway(s) Selbsterneuerung Kapazität und damit HSC-ähnlichen Potenzial von definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen übertragen müssen.

Zusammenfassend gibt WNT Manipulation während mesodermalen Musterung in hPSCs primitive CD43+ oder definitive CD34+CD45+ hämatopoetischen Vorläuferzellen, die isoliert und zur Untersuchung der Hämatopoese hPSC abgeleitet werden können.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Innere Medizin, Abteilung Hämatologie, Washington University School of Medicine unterstützt. CD wurde von T32HL007088 von der National Heart, Lung and Blood Institute unterstützt. CMS wurde von einer amerikanischen Gesellschaft von Hämatologie Scholar Award unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

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References

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