Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Developmental Biology

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Summary

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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Abstract

Uno de los objetivos principales para la medicina regenerativa es la generación y mantenimiento de las células madre hematopoyéticas (HSCs) derivado de las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Hasta hace poco, tratando de distinguir hPSCs en HSCs ha generado predominante progenitores hematopoyéticos que carecen de potencial HSC y en cambio, se asemejan a saco vitelino hematopoyesis. Estos progenitores hematopoyéticos resultantes pueden haber limitado utilidad en vitro modelado enfermedad de varios desordenes hematopoyéticos adultos, particularmente los de los linajes linfoides. Sin embargo, recientemente hemos descrito los métodos para generar progenitores hematopoyéticos definitivos del multilineage Eritro-mielo-linfoide de hPSCs utilizando un protocolo específico de etapa diferenciación dirigida, que esbozamos aquí. A través de la disociación enzimática de hPSCs en recipientes de plástico recubierto por la matriz de membrana basal, se forman cuerpos embryoid (EBs). EBs se distinguen al mesodermo por BMP4 recombinante, que posteriormente se especifica que el programa hematopoyético definitivo por el inhibidor de la GSK3β, CHIR99021. Alternativamente, la hematopoyesis primitiva se especifica por el inhibidor de PORCN, IWP2. La hematopoyesis más es conducida a través de la adición de recombinante VEGF y apoyo citoquinas hematopoyéticas. Los progenitores hematopoyéticos resultantes generados mediante este método tienen el potencial para ser utilizado para la enfermedad y desarrollo modelado, in vitro.

Introduction

Las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) se definen como englobando células de vástago embrionarias humanas (hESCs) y las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) y tiene la capacidad única no sólo en auto renovación bajo condiciones de crecimiento apropiado, pero también, la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares derivados de las tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo1. Debido a estas habilidades, hPSCs sostener la gran promesa para la medicina regenerativa, modelado de enfermedades y terapias basadas en células2. Mientras que varios tipos de células se han diferenciado con éxito de hPSCs, un desafío importante es la especificación en vitro de adulto hPSC-derivó las células madre hematopoyéticas (HSCs) y progenitores hematopoyéticos definitivos.

Una probable barrera para el desarrollo de HSCs humanas de hPSCs es la presencia de múltiples programas hematopoyéticas en el embrión humano3. El primer programa que emerge, denomina "hematopoyesis primitiva", se origina dentro del tejido del saco vitelino extraembrionarias y mejor se caracteriza por su producción transitoria de progenitores erythroblast (EryP-CFC), macrófagos y megacariocitos. En particular, este programa no da lugar a las HSCs, ni da lugar a progenitores linfoides T y B. Sin embargo, el saco vitelino transitorio dan lugar a progenitores hematopoyéticos definitivas restringidos, como el progenitor mieloide Eritro (EMP4,5,6,7,8) y la eritroide deficiente linfoide cebada multipotent progenitora (LMPP9). Sin embargo, EMPs ni LMPPs son completamente multipotentes, o capaz de engraftment HSC-como en recipientes adultos. En cambio, más adelante en el desarrollo, el programa hematopoyético "definitivo" clásicamente definido se especifica en la región aorta-gónada-mesonefros del embrión adecuado, dando lugar a todos los linajes hematopoyéticos adultos, incluyendo el HSC. La especificación de estas células hematopoyéticas definitivas intra embrionarias ocurre de manera dependiente de la muesca, a través de una transición endotelial hematopoyético de hemogenic endotelio (él)3,10,11 ,12,13,14. Además de capacidad de reconstitución, el potencial del multilineage y muesca-dependencia de estas células pueden utilizarse para distinguir estos progenitores hematopoyéticos definitivos de la EMP y LMPP (revisado en las referencias3,13 ).

Comprender los mecanismos de especificación hematopoyética primitiva y definitiva de hPSCs es probablemente esencial para la producción reproducible de progenitores hematopoyéticos definitivos a través de una variedad de líneas hPSC. Hasta hace poco, hPSC protocolos de diferenciación que podrían separar multipotentes definitivos y primitivos progenitores hematopoyéticos no existían15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Muchos enfoques con suero bovino fetal (FBS) y/o co-cultivo stromal en primer lugar describe el potencial hematopoyético de hPSC diferenciación, con mezclas de primitivo y definitiva hematopoyética potencial15,16, 17,19,22,23,25. Además, muchos protocolos sin suero hematopoyéticos han descrito los requisitos de señal para la especificación del mesodermo del hPSCs que alberga hematopoyética potencial18,20,21, 24. sin embargo, como estos métodos todavía dieron lugar a mezclas heterogéneas de ambos programas, su uso en aplicaciones clínicas y mecanismos del desarrollo de la comprensión puede ser limitada.

Recientemente hemos construido en estos estudios, después de haber descrito los requisitos de señal de la fase específica de ACTIVIN NODAL y WNT de señalización en la especificación hematopoyética primitiva y definitiva del mesodermo derivado hPSC18,26 . El último era particularmente único, como el uso de la manipulación de señales WNT fase específica permite la especificación de exclusivamente primitivo o exclusivamente de progenitores hematopoyéticos definitiva26. Durante la especificación del mesodermo, la inhibición de la señalización de WNT canónico con el inhibidor PORCN IWP2 resultados en la especificación de CD43+ EryP-CFC y progenitores mieloides, con ningún potencial linfoide detectable. En contraste, estimulación de canónica WNT de señalización con el inhibidor de la GSK3β, CHIR99021, durante la misma etapa de diferenciación dio lugar a la ausencia completa de CD43 detectable+ EryP-CFC, mientras que al mismo tiempo conduce a la Especificación de CD34+CD43 . Esta población poseía mieloide, HBG-expresando eritroides y linfoides T potencial. Posteriores análisis identificaron esto como falta de la expresión de su potencial hematopoyético, CD7327,28 y CD18428fue dependiente de la muesca28. Además, sola célula clonales análisis demostraron que estos linajes hematopoyéticos definitivos se pudieran derivar de las células multipotentes28. Tomados juntos, estos estudios indican que etapa específica WNT signaling manipulación puede especificar puros primitivos progenitores hematopoyéticos o multipotentes dependiente de la muesca definitiva de progenitores hematopoyéticos.

Aquí describiremos nuestra estrategia de diferenciación que los rendimientos de progenitores hematopoyéticos exclusivamente primitivo o definitivos, través de la manipulación de la canónica WNT de señalización durante mesodérmico modelando y su linaje hematopoyético posterior ensayos. Este protocolo es de gran valor para los investigadores que están interesados en la producción de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivas de hPSCs para aplicaciones de la medicina regenerativa.

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Protocol

1. reactivos

  1. obtener células líneas; hESCs o hiPSCs 1, ratón fibroblastos embrionarios (MEFs) 29, OP9-DL4 estroma 30 , 31.
  2. preparación del reactivo
    1. preparar una solución al 0.1% p/v de gelatina en PBS. Esterilizar en autoclave y almacenar a 4 ° C después de tomar.
      1. Preparar los recipientes de plástico recubierta de gelatina. Capa 6 bien platos con 1,5 mL de solución al 0.1% gelatina. Incubar por 15 min a temperatura ambiente. Inmediatamente antes del uso, aspirar solución de gelatina restante.
    2. Preparar los medios de comunicación MEF haciendo IMDM con 15% v/v FBS y antibióticos 1 x. Complementar con 2 mM L-glutamina y 400 μm monothioglycerol (MTG) antes de usar y almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar los medios de cultivo hPSC como solución de DMEM/F12 con el reemplazo de 20% v/v nocaut en suero (KOSR), 1 x aminoácidos no esenciales (AANE), antibióticos de x 1, 55 μm β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina y 10 ng/mL bFGF. Filtro para esterilizar con un filtro de 2 μm y almacenar en la oscuridad a 4 ° C.
    4. Medios de lavado Prepare el suero libre como una solución de DMEM/F12 con 5% v/v KOSR y 4 mM HCl. filtro para esterilizar con un filtro de 2 μm, alícuota y almacenar en la oscuridad a 4 ° C.
    5. Hacer un 1 mg/mL DNasa I solución disolviendo la ADNasa para 3-4 h en agua desionizada estéril, helada en hielo. Filtro para esterilizar con un filtro de 2 μm y almacenar en alícuotas a -20 ° C.
    6. Preparar la solución con los medios de lavado: agregar 10% FBS y 10 μg/mL de DNasa I. La solución debe prepararse inmediatamente antes del uso.
    7. Preparar la matriz de la membrana del sótano (p. ej., matrigel, conocido como estera de aquí en adelante) solución mezcla.
      Nota: Los pasos todos preparando y utilizando la mezcla MAT deben realizarse en hielo o a 4 ° C. deshielo congelada MAT en hielo a 4 º C durante la noche. Diluir MAT 1:1 mediante la adición de 10 mL IMDM helada y el frío en hielo a 4 º C durante la noche. Diluir la mezcla de MAT con un adicional 20 mL IMDM helada y el frío en hielo a 4 º C durante la noche. Alicuotar en tubos previamente enfriados y almacenar a-20 ° C hasta su uso. Cuando esté listo para su uso, descongelar MAT mezcla toda la noche a 4 ° C. Placas
      1. capa de la placa celular.
        Nota: Todas las medidas de placas MAT capa deben realizarse en hielo. Enfriar las placas de 6 pozos y pozo 24 a-20 ° C durante al menos 1 h. Cuando esté listo para las placas de capa, coloque en el hielo. Capa de cada pocillo con 4 MAT x diluido, remover y volver a utilizar cualquier exceso de solución. Dejar en hielo durante 30-60 min y aspirar exceso MAT. Secar las placas recubiertas MAT en una incubadora de 37 ° C 5% CO 2 para un mínimo de 3 h. uso dentro de las 72 h de la capa de.
    8. Preparar la solución de 10% albúmina de suero bovino (BSA) disolviendo 10% w/v BSA en agua helado, agua destilado, desionizado a 4 ° C durante 3-4 h. filtro para esterilizar con un filtro de 2 μm en un botella de bloqueo de la luz y almacenar a 4 ° C.
    9. Preparar la solución de ácido ascórbico. Disolver lentamente una solución de 5 mg/mL de ácido L-ascórbico en agua helado, agua destilado, desionizado en hielo para 3-4 h. remolino de vez en cuando hasta que se disuelva. Filtro para esterilizar con un filtro de 2 μm y almacenar en alícuotas a -20 ° C.
    10. Preparar los medios libres de suero diferenciación (SFD) por lo que una solución de 75:25 de IMDM:Ham ' s F-12, añada 0,5% BSA, 1 x B27 y suplementos de x N2 0,5. Almacenar a 4 ° C. Agregar 1 x L-glutamina, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 400 μm MTG y 150 μg/mL holo-transferrina inmediatamente antes de usar.
    11. Preparar medios de cultivo libre de suero la célula de vástago (e.g., StemPro, conocido como SP34 adelante) por el fabricante ' instrucciones. Almacenar a 4 ° C. Agregar 1 x L-glutamina, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 400 μm MTG y 150 μg/mL holo-transferrina inmediatamente antes de usar.
    12. Prepare la solución de colagenasa II 0,2% por disolución II de colagenasa a una concentración final de 0,2% p/v en solución de 1:4 de FBS:PBS. Disolver en baño de agua de 37 ° C durante al menos 15 min filtro para esterilizar la solución con un filtro de 2 μm y almacenar en alícuotas a -20 ° C.
    13. Preparar el buffer de fluorescencia activada célula clasificación (FACS) como una solución de 5% FBS en IMDM inmediatamente antes de usar.
    14. OP9 preparar los medios de comunicación como una solución de α-MEM, 20% SFB, 2 mM L-glutamina y antibióticos 1 x. Filtro para esterilizar con un filtro de 2 μm y almacenar a 4 ° C.
    15. Obtener medios a base de metilcelulosa (p. ej., MethoCult, denominado MeC adelante) como cantidades de pre-alícuotas de 3 mL o un frasco de 100 mL. Si se utiliza 100 mL MeC, a su llegada, se dividen en alícuotas de 2,5 mL en tubos cónicos de 14 mL.
      Nota: Todas alícuotas deben almacenarse a-20 ° C. MeC de medias partes alícuotas se deben descongelar inmediatamente antes de uso.

2. Diferenciación del mesodermo de hPSCs

  1. crecer la hPSC líneas de celulares en MEFs a 70-80% de confluencia, en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2.
    Nota: El hPSCs debe tener bordes afilados, indiferenciados.
  2. Recipientes de plástico recubierto de alfombra preparar 24 h antes de pases el hPSCs.
    Nota: El número total de platos 6-pozo recubierto de alfombra varía hPSC líneas. Normalmente, tres platos de 6 bien bastan por plato 6-bien de hPSCs confluentes en MEFs. Alimentador-agotamiento de la
    1. realizar un ensayo con diversos cocientes del confluente hPSCs:MAT pozos (1:4, 1:3, 1:2, etc.) antes de la primera diferenciación para determinar cuántos MAT-cubierta 6-bien platos deben usarse para posteriores diferenciaciones.
      Nota: 24 h después de la galjanoplastia en la estera, el hPSCs debe ser 80-90% confluente, con agregados de células de aproximadamente 10-20 células tamaño.
  3. Aspirar los medios hPSC y añadir 1 mL a 37 ° C 0.25% tripsina-EDTA a cada bien durante 1 minuto aspirado y añadir los medios de parada de 1 mL a cada pozo. Con un raspador celular, raspar las células de la placa. Añadir 1 mL de tampón de lavado a cada pocillo.
    1. Con una pipeta serológica de 2 mL, triturate 3 - 5 veces a romper grumos grandes de células y transferir las células a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar hPSCs 330 x g por 5 min
  4. Resuspender las células en un volumen total de hPSC media equivalente a 2 mL por pozo de los recipientes de plástico recubierto de alfombra para ser utilizado. Añadir 2 mL/pozo de hPSCs a los recipientes de plástico e incubar durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2.
  5. 24 h más tarde, aspirar los medios de comunicación y reemplazar con 37 ° C 0.05% tripsina-EDTA durante 1 minuto aspirar el tripsina-EDTA y añadir los medios de parada de 1 mL. Raspar las células vigorosamente con un raspador celular. Añadir medios de lavado de 1 mL a cada pozo. Con una pipeta serológica de 2 mL, triturate las células 1 - 2 veces y transferir a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar las células a 220 x g por 5 min
    Nota: La duración del tratamiento de tripsina-EDTA shouLD se determinó por el investigador para cada línea de hPSC. El tratamiento de tripsina debe aplicarse para el mayor tiempo posible sin causar disociación unicelular. Este paso debe separar todos los hPSCs de las placas recubiertas de alfombra, pero no sola célula disociación. EBs resultante debe ser de 6-10 células, en promedio.
  6. Aspire los medios de comunicación. Utilizando una pipeta serológica de 5 mL, resuspender suavemente las células en medios de lavado de 20 mL. Centrifugar a 220 x g por 5 min
  7. Resuspender suavemente la EBs en los medios día 0 (tabla 1). Pipetear 2 mL de medio de diferenciación con EBs en cada pocillo de una placa de cultivo celular 6-bien adherente de baja utilizando una pipeta serológica de 10 mL. Lugar en una 5% CO 2 5% O 2 (multi-gas) incubadora de 37 ° C.
    Nota: Los medios día 0: media SFD suplementado con 10 ng/mL BMP4 (tabla 1). Para cada dos placas de hPSCs, utilice una placa de cultivo de 6 bien adherente de baja celular.
  8. 24 h más tarde, agregar 2 mL día 1 los medios de comunicación (tabla 1). Incube las células durante la noche en una incubadora del multi-gas.
    Nota: Los medios día 1: medios SFD suplementados con 10 ng/mL BMP4 y 10 bFGF ng/mL a cada pozo (tabla 1).
  9. 18 h después, suavemente el EBs con una pipeta serológica de 5 mL y vuelta a 100 x g por 5 min lavado la cosecha y toda la cultura se combinan con 10 mL IMDM. Vuelta a 100 x g por 5 min aspirar los medios de comunicación.
    Nota: Existirán residuos en los cultivos. Este paso de centrifugación a baja velocidad (100 x g) removerá los escombros.
  10. Resuspender suavemente la EBs en medios SFD con día 2 medios (tabla 1) y luego la dosificación 2 mL por pozo en placas de cultivo celular 6-bien poco adherente. Incubar en una incubadora de gas múltiples de 37 ° C para 30 h.
    Nota: Los medios día 2: 10 ng/mL BMP4 y 5 ng/mL bFGF y el agonista WNT apropiado o antagonista (tabla 1).
    1. Añadir 3 μm CHIR99021 especificar definitivo de progenitores hematopoyéticos. Alternativamente, añadir μm 3 IWP2 y 1 ng/mL Activin A especificar primitivos progenitores hematopoyéticos.
  11. Continuar a la sección 3 para la especificación de progenitoras hematopoyéticas.

3. Especificación de CD34 + progenitores hematopoyéticos

  1. después de 30 h, aislar el EBs con una pipeta serológica de 2 mL en el día 3 de diferenciación. Transferir a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 330 x g por 5 minutos suavemente suspender y lavar con 10 mL de IMDM. Centrifugar las células a 330 x g por 5 min
  2. Suspender el EBs en día 3 medios (tabla 2) y dispensar 2 mL en cada pocillo de placas de 6 pozos baja adherente. Incubar las células en una incubadora de gas múltiples de 37 ° C por 72 h.
    Nota: Los medios día 3: SP34, suplementado con 15 ng/mL VEGF y bFGF de 5 ng/mL (tabla 2). Añadir más medios de comunicación por el bien si el pH de los medios de comunicación cosechadas en el día 3 de diferenciación ha cambiado de forma significativa (es decir, media de color amarillo-naranja). Como alternativa, utilizar menos EBs por pozo en el día 0.
  3. Después de 72 h de incubación, añadir 2 mL de medio día 6 (tabla 2) a cada pocillo. Incubar en una incubadora de gas múltiples de 37 ° C para un adicional 48 h.
    Nota: Los medios de día 6: medios SP34 complementados con 15 ng/mL VEGF, bFGF ng/mL 5, SCF de 200 ng/mL, 4 UI EPO, 20 ng/mL de IL-6, 10 ng/mL IL-11 y 50 ng/mL de IGF-1 (tabla 2). Si los medios de comunicación más se agregó en el paso 3.1, luego agregar la cantidad equivalente de los medios de comunicación en el paso 3.2 para que las concentraciones de citoquinas final siguen siendo los mismos.
  4. Aislar el EBs CHIR99021 tratados en el día 8 de diferenciación. Proceder a la sección 4.
  5. IWP2-EBs tratados son cosechadas en el día 8 de diferenciación en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 330 x g por 5 min resuspender suavemente en medios del día 8 (tabla 2). Incubar durante 24 h en una incubadora de 37 ° C 5% CO 2 bajo platos adherentes. Proceder a la sección 4.
    Nota: Los medios día 8: SP34 de medios complementados con 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL de IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL de IGF-1, TPO de 30 ng/mL, 10 ng/mL Flt3-L y 30 ng/mL IL-3 (tabla 2).

4. Disociación de EBs y aislamiento de progenitoras hematopoyéticas

tubo
  1. aislar el EBs con una pipeta serológica en un cónico de 50 mL. Centrifugar a 330 x g por 5 min aspirado apagado el sobrenadante.
  2. Añadir 2 mL de 0.25% tripsina-EDTA a la EBs. Vortex por 5 s. Incubar en un baño de agua de 37 ° C durante 8 minutos añadir 5 mL de solución de parada. Centrifugar a 330 x g por 5 min aspirado apagado el sobrenadante.
  3. Resuspender el EBs en 5 mL de colagenasa II. Vortex por 5 s e incubar en un baño de agua de 37 ° C. Después de 60 min, vortex durante 5 s y añadir 5 mL de solución de parada. Vuelta a 330 x g por 5 min aspirado apagado el sobrenadante.
  4. En 1 mL de tampón FACS, resuspender las células. Pasar las células a través de un tamiz de 40 μm celular. Esto elimina cualquier célula undissociated grupos.
  5. Contar las células. Alícuota 1 x 10 6 células en un tubo cónico de 14 mL. Vuelta a las células a 330 x g por 5 min resuspender las células a una concentración de 5 x 10 6 células/mL en tampón FACS. Alícuota y piscina un 10% de las células en cada Estado para citometría de flujo color controles. Incube las células anticuerpos por 30 min en hielo, en la oscuridad.
    Nota: Ver combinaciones de fluoróforo en Tabla de materiales.
    1. Tratado de IWP2 las células, utilizan anticuerpos anti-CD34 y anti-CD43.
    2. Células tratadas de CHIR99021, uso de anticuerpos anti-CD34, anti-CD43, anti CD73 y anti-CD184.
  6. Enjuague las células dos veces con tampón FACS. Vuelta a 330 x g por 5 min resuspender las células a una concentración final de 5 x 10 6 células/mL.
  7. Analizar o aislar las células mediante citometría de flujo. Para primitivos progenitores hematopoyéticos, analizar la expresión de CD34 y CD43 ( figura 2A). De progenitores hematopoyéticos definitivas, aislar el HE (CD34 + CD43 CD73 CD184 ) por FACS ( figura 2B). Recoger las células en tubos con tampón FACS fría.
  8. Para evaluar el potencial hematopoyético definitivo de aislado, continúe con sección 5 para la transición endotelial hematopoyético o sección 7 para ensayo T-linfoide. Para ensayos de CFC hematopoyéticos primitivos, continuar sección 6.

5. Endotelial-hematopoyético transición

  1. vuelta el CD34 aislado + CD43 CD73 CD184 células a 330 x g por 5 min resuspender las células en él medios de 200.000 células/ml ( Tabla 2). Distribución de las células en 50 alícuotas de μL en una placa de cultivo celular de 96 pozos poco adherente. Incube las células durante la noche en una incubadora 2 de 5% O 2 multi-gas de 37 ° C 5% CO.
    Nota: Que los medios de comunicación: SP34 medios suplementados con 5 ng/mL VEGF, bFGF ng/mL 5, 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL de IL-6, IL-11, 25 ng/mL de IGF-1, TPO de 30 ng/mL, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3 de 5 ng/mL, 10 ng/mL BMP4, SHH de 20 ng/mL, 10 μg/mL de angiotensina II y potasio de Losartan de 100 μm a 2 x 10 5 células/mL (tabla 2).
  2. Preparar las 24-pozo recubierto de alfombra de placas (ver paso 1.2.7.1), según sea necesario.
  3. Las células se agregan en grupos de 6-10 células durante la noche. Para cada 50 volumen μl de células reaggregated, transferir suavemente las células en el centro de una placa de 24 pocillos recubierto de alfombra en la mañana próxima. Coloque suavemente la placa en incubadora de multi-gas de 37 ° C durante 4-6 h, hasta que las células se unen.
  4. Agregue 1 mL de fresco los medios de comunicación a cada pocillo, después se unen las células. Incubar las células en una incubadora 2 de 5% O 2 multi-gas de 37 ° C 5% CO hasta que las células hematopoyéticas son accesibles (típicamente 5-7 días; Figura 2D). Visualizar en 100 aumentos utilizando un microscopio de luz.
  5. Cosecha los progenitores hematopoyéticos definitivos retirando suavemente los medios de las células. Pase este medio a través de un tamiz de célula 40 μm y recoger. A las células adherentes en el pozo, Añadir 0,5 mL 0.25% tripsina-EDTA a las células e incubar a 37 ° C por 5 minutos Agregar solución de 0.5 mL a cada pozo. Pasar juntos por células a través de la misma 40 μm tamiz de celular a todo adherente y no adherente. Vuelta a 330 x g por 5 min
    1. Para evaluar el potencial de la CFC de esta cultura a granel, proceder a la sección 6.
  6. Lavan las células dos veces en tampón FACS. Vuelta a 330 x g por 5 min
  7. Resuspender las células en tampón FACS en 5 x 10 6 células/mL. Las células con anticuerpos anti-CD45 y anti-CD34 por 30 min en hielo en la oscuridad de la mancha (sugerido fluoróforos se encuentran en la Tabla de materiales).
  8. Lavan las células dos veces en tampón FACS. Vuelta a 330 x g por 5 min
  9. Aislar el CD34 + CD45 de las células + por FACS ( Figura 2E). Clasificar las células en frío tampón FACS.
  10. Evaluar el CD34 definitivo + CD45 + de progenitores hematopoyéticos como necesaria (ensayo de CFC en sección 6, potencial linfoide en la sección 7 o un ensayo Iniciado por el investigador).

6. Ensayo de CFC

  1. descongelar las alícuotas de MeC para cada muestra utilizada para el análisis de la CFC.
  2. Añadir las células para ser ensayadas (medidas 4.5, 4.7, 5.5 y 5.9) en MeC. Vórtice completamente y dejar que las culturas MeC representan 5-10 min hasta que se disipen las burbujas de aire, según el fabricante ' instrucciones. Usando un 16 ½ calibre aguja en una jeringa de 3 mL, retire cuidadosamente 2 mL de la MeC.
    Nota: Placas típicas densidades entre 1.000-20.000 células/mL, dependiendo de la frecuencia esperada del progenitor.
  3. Cuidadosamente, dispensar 1 mL de mezcla de célula del MeC en cada uno de los dos platos de cultivo de tejidos de 35 mm. Distribuir uniformemente el MeC en los platos de 35 mm suavemente golpeando ligeramente y girando el plato. Cada uno de los platos anteriores colocar en un plato de cultivo de tejidos de 15 cm llenado de agua. Incubar en una incubadora de 37 ° C de 5% CO 2.
  4. Visualizar las culturas MeC utilizando un microscopio óptico de 40 aumentos. Cuantificar los diferentes CFC obtenidos. Analizar los ensayos primitivos CFC 8-10 días después de la galjanoplastia ( figura 2). Analizar los ensayos de CFC definitiva 14 días después de la galjanoplastia. Morfología de Colonia de ensayo de CFC representante puede verse en la figura 2F.

7. Análisis de la célula de T para establecer definitiva hematopoyética potencial

  1. crece OP9-DL4 células hasta confluentes en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm 30 , 31 , 32.
    1. deshielo OP9-DL4 células 72-96 h antes de los ensayos de la célula de T de la galjanoplastia. Resuspender las células OP9-DL4 en 10 mL OP9 medios y distribuir en una placa de 10 cm. Crecer en una incubadora de 37 ° C de 5% CO 2 hasta confluentes de 70-90%.
    2. Para cosechar las células OP9-DL4 de un plato de 100 mm, retire los medios de comunicación y añadir 5 mL 0.25% tripsina-EDTA por 5 min parar la actividad de la tripsina con 5 mL OP9 medios. Vuelta a las células a 330 x g por 5 min resuspender las células en 1 mL OP9 medios y contar las células de.
      Nota: Una placa de 10 cm de células confluentes de OP9-DL4 producirá aproximadamente 10 x 10 6 células OP9-DL4.
    3. 48 h antes del ensayo de la célula de T, placa de 2 x 10 6 células en 12 mL OP9 medios en un plato 24-well (0,5 mL/pocillo). Crecer en una incubadora de 37 ° C de 5% CO 2.
  2. Añadir 2.000-10.000 células a ensayar (como obtenido en pasos 4.5, 4.7, 5.5 y 5.9) 1 bien de células OP9-DL4 OP9 medios suplementados con: SCF (primeros 6 días sólo) de 30 ng/mL, 5 ng/mL IL-7 y 5 ng/mL FLT3-L. incubar a 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. No hay cambios de los medios de comunicación se producen en este paso.
  3. Cada 4 - 5 días, de paso los progenitores de la célula de T en células stromal OP9-DL4 en un plato bien 6. Triturate las células con una pipeta de 1 mL y pasar por un filtro μm 40 para eliminar grumos. Vuelta a 330 x g por 5 min aspirado fuera de los medios de comunicación. Resuspender las células en 2 mL de fresca media OP9 suplementado con 5 ng/mL IL-7 y 5 ng/mL Flt3-L y el lugar en células OP9-DL4.
    Nota: 48 h antes de pases, placa de 2 x 10 6 células OP9-DL4 en 12 mL OP9 medios y distribuir 2 mL/pozo en pozos de 6 platos.
  4. Después de al menos 21 días de cocultivo, triturate vigorosamente las células y pasan a través de un filtro de 40 μm para eliminar restos celulares. Vuelta a 330 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante.
  5. Lavan las células dos veces en tampón FACS frío. Vuelta a 330 x g por 5 min
  6. Resuspender las células en tampón FACS en 5 x 10 6 células/mL. Tinción de las células con anticuerpos anti-CD45, CD56 anti, anti-CD4 y anti-CD8 por 30 min en hielo en la oscuridad (fluoróforo sugiere combinaciones se encuentran en la Tabla de materiales). Aplicar una mancha live/dead cell (DAPI, etc.) para eliminar la suciedad del análisis.
  7. Lavan las células dos veces en tampón FACS. Vuelta a 330 x g por 5 min
  8. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo para evaluar la presencia de progenitores de linfocitos T ( figura 3).

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Representative Results

Un esquema que representa la inducción de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivas de hPSCs se ilustra en la figura 1. Mesodermo patrones por canónica WNT de señalización se produce durante 2-3 días de diferenciación, seguido por la especificación de progenitoras hematopoyéticas.

Análisis cytometric del flujo representativas y formadoras de ensayos de metilcelulosa de culturas de diferenciación Hematopoyética deriva hPSC se muestran en la figura 2. Cultivos tratados con IWP2 diferenciación producirá un CD34 distintas+CD43 y CD34bajo /CD43+ población, mientras que los cultivos tratados con CHIR diferenciación tendrá < 1% CD43 células+ día 8 de diferenciación (figura 2AB)26. Progenitores hematopoyéticos primitivos derivados bajo condiciones IWP2 aisladas en el día 9 dará lugar a eritroide predominante primitivo (EryP-CFC) y progenitores mieloides en los ensayos de metilcelulosa, mientras que las culturas tratan de CHIR será en gran parte desprovisto de CFC potencial en esta fase (figura 2F). En cambio, la CD34+CD43 la población derivada del tratamiento de CHIR99021 es una población heterogénea, que contiene los progenitores endoteliales, así como CD34+CD43CD73CD184 () Figura 2B), que cuando aislados por FACS, inicialmente se forma una monocapa de células endoteliales como (Figura 2D, panel de la izquierda), que luego sufre una transición endotelial a las hematopoyéticas, dando por resultado redondo, refractile no adherente células hematopoyéticas (Figura 2D, panel derecho). Estas células hematopoyéticas pueden evaluarse mediante citometría de flujo para la expresión de CD34 y CD45 (Figura 2E). Progenitores hematopoyéticos aisladas de los ensayos EHT se pueden utilizar en ensayos de metilcelulosa y dan lugar a unidades formadoras de colonias de gran explosión-como eritroides (BFU-E), unidades formadoras de colonias eritroides pequeñas (UFC-E) y progenitores mieloides (CFU-M; Figura 2F).

Figura 3 muestra el análisis de citometría de flujo representativo de las pruebas de linfocitos T potenciales de CD34 derivados de CHIR99021+CD43CD73CD184 de progenitores hematopoyéticos (Figura 3A) y IWP2 CD34 (figura 3B)+CD43 de progenitores hematopoyéticos, tras 21 días de cocultivo OP9-DL4. La presencia de un CD45+CD56CD4+CD8+ población de progenitores derivados de CHIR es indicativo de potencial hematopoyético definitivo dentro de la entrada CD34+ población. CD34+ y CD43+ progenitores aislados de diferenciaciones derivadas de IWP2 no den lugar a los linfocitos T en este ensayo, bajo estas condiciones de diferenciación18,26.

Figure 1
Figura 1: esquema del protocolo para la especificación de progenitores hematopoyéticos definitivos y primitivas de. Representación de las principales medidas experimentales y los plazos de la diferenciación de EBs a definitivos y primitivos progenitores hematopoyéticos. EBs se generan en el día 0 de hPSCs en recipientes de plástico recubierto de alfombra. EBs se cultivan en medios SFD que contienen BMP4 en una incubadora de varios gases. El día 1 de diferenciación, culturas están hartos de medios complementados con BMP4 y bFGF. El día 2, se produce un cambio de los medios de comunicación con la manipulación de WNT a través de la adición de CHIR99021 (CHIR) definitiva de progenitores hematopoyéticos y IWP2 para primitivos progenitores hematopoyéticos. El día 3, los medios de comunicación se modifica por SP34, complementado con VEGF y bFGF. En día 6, las culturas están hartos de medios complementados con citoquinas hematopoyéticas. El día 8 de la especificación hematopoyética primitiva, los medios de comunicación se cambiaron y las células se mueven a una incubadora 5% CO2 durante 24 h, seguido por el análisis de (HPC) de la célula progenitora hematopoyética. El día 8 de especificación hematopoyética definitiva, CD34+CD43CD73CD184 células son aisladas por FACS y ensayarse para potencial endotelial hemogenic definitiva o potencial T-linfoide (no representado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de las culturas de diferenciación y generación de progenitores hematopoyéticos primitivo. (A) análisis de citometría flujo representativo de primitivos progenitores hematopoyéticos de EBs tratados IWP2 en día 8. (B) análisis de citometría flujo representativo de EBs tratados CHIR99021 en día 8. Hemogenic endotelio (él) puede ser identificado y aislado como un CD34+CD43CD73CD184 población. (C) potencial de formación de colonias de progenitores hematopoyéticos del día 9 de IWP2 - y CHIR99021 - (CHIR) tratados culturas de diferenciación. n = 3, barras de error representan la SD de la media, los asteriscos indican significación estadística, utilizando la prueba t de student *** p < 0.0001. (D) fotografías representativas de aislado él células después de 4 días (izquierdas) o 7 + (derecha) del crecimiento en recipientes de plástico recubierto de alfombra. Aumento original, 100 X. Barras de escala = 100 μm. (E) representante citometría de la expresión de CD34 y CD45 de progenitores hematopoyéticos definitivos después de 9 días de cultivo. (F) fotografía representativa que muestra morfología de EryP-CFC (izquierda), CFU-M (medio), BFU-E y CFU-E (derecha). Aumento original 40 X. Barras de escala = 100 μm. las flechas indican el nombre de colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de potencial hematopoyético definitivo. Análisis de citometría de flujo representativo potencial de linfocitos T de CD34 derivados de CHIR+CD43CD73CD184 de progenitores hematopoyéticos (A) o CD34 (B) derivados de IWP2+CD43 de progenitores hematopoyéticos, 28 días después de co-cultivo con células OP9-DL4. El potencial de linfocitos T de una muestra se considera positivo si hay más de 100 CD45+ eventos detectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

edad = "always" > Medios SFD Día 0 Día 1 Día 2 definitivo Día 2 primitivo BMP4 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL bFGF – 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL Activina A – – – 1 ng/mL CHIR99021 – – 3 ΜM – IWP2 – – – 3 ΜM

Tabla 1: SFD-medios de comunicación días 0 - 2.

Los medios de comunicación SP34 Día 3 Día 6 Día 8 ÉL
VEGF 15 ng/mL 15 ng/mL 5 ng/mL
bFGF 5 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL
SCF 200 ng/mL 100 ng/mL 100 ng/mL
EPO 4 UI IU 2 IU 2
IL-6 20 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-11 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL
IGF-1 50 ng/mL 25 ng/mL 25 ng/mL
TPO 30 ng/mL 30 ng/mL
FLT - 3L 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-3 30 ng/mL 30 ng/mL
BMP4 10 ng/mL
SHH 20 ng/mL
Angiotensina II 10 μg/mL
Potasio de losartan 100 ΜM

Tabla 2: medios SP34 para 3 días - 8 y.

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Discussion

Este protocolo describe un método rápido, libre de suero, tejido conectador-libre para la diferenciación de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivos. Mesodérmico especificación de progenitores hematopoyéticos ya sea primitivo o definitivas puede lograrse confiablemente usando nuestro protocolo, que únicamente inhibidores de molécula pequeña de la señalización de WNT canónico. Activación de WNT etapa específica por el inhibidor de GSK3β CHIR9902133 da lugar a mesodermo hematopoyético definitivo, mientras que la inhibición de WNT por el inhibidor de PORCN IWP234 especifica mesodermo hematopoyética primitiva26. De nota, este método no robusta da lugar a una población de HSC-como engraftable (no se muestra). Sin embargo, los progenitores hematopoyéticos definitivos generados con este enfoque son susceptibles de engraftment inducido por transgenes potenciales35, destacando sus potenciales aplicaciones en el futuro traslacionales.

Un determinante crucial de diferenciación exitosa hPSC es el tamaño inicial de la EBs que se forman a partir de hPSCs. Idealmente, el EBs debe estar alrededor de 6-10 células de tamaño. Las culturas de diferenciación aberrantemente pueden especificar una mezcla de estos dos programas si la EBs son demasiado grandes, posiblemente debido a la activación de señal inadecuada en el EB. Culturas de diferenciación deben ser inspeccionadas visualmente para el tamaño óptimo de EB en las primeras 24 h de la diferenciación. Alternativamente, si el hPSCs son completamente disociados a las células, las hPSCs en cambio someterse a anoikis célula muerte36, resultando en pobre diferenciación Hematopoyética.

Una diferenciación acertada dará lugar a progenitores hematopoyéticos exclusivamente primitivos cuando IWP2 es utilizado durante la especificación mesodérmico en días 2 y 3 del presente Protocolo de diferenciación. El día 8 de la diferenciación, la cultura deriva de IWP2 debe conformada por distintas CD34+CD43, CD34mediados de/bajoCD43+y CD34CD43+ las poblaciones (figura 2A). El CD34mediados de/bajoCD43+ población da lugar a la primitiva eritroides y mieloides progenitoras; mientras que el CD34CD43+ población principalmente da lugar a progenitores eritroides con limitado potencial mieloide18. El potencial hematopoyético primitivo se puede confirmar por el análisis de metilcelulosa para la presencia de EryP-CFC (sección 6), que predominantemente voluntad expresa la globina embrionaria HBE en comparación con fetal HBG26, 28,37. Del mismo modo, la presencia de CD43+ de progenitores hematopoyéticos en esta etapa se pueden utilizar confiablemente para indicar la presencia de progenitores hematopoyéticos primitiva18,23,26. Cabe señalar que la expresión de CD43 no es exclusivo de progenitores del programa hematopoyéticas primitivas18,23,26y no puede usarse como la única métrica para evaluar a primitivas hematopoyéticas potencial, como el immunophenotype y muesca-dependencia de los humanos EMP sigue siendo desacostumbrado (revisado en3).

Cuando CHIR99021 se utiliza en modelar mesodérmico durante los días 2 y 3 de la diferenciación, una población de progenitores hematopoyéticos exclusivamente definitivas será especificada. El día 8 del Protocolo de diferenciación, derivado de CHIR99021 culturas deben conformadas por un distintivo CD34+CD43 población, con poca o ninguna expresión de CD4326. El CD34+ población de CD43 es una población heterogénea de células endoteliales con hematopoyético, venoso y arterial potencial que puede ser demarcada basado en expresión CD73 y CD184, con las células de que carecen la expresión de ambos 27,28. Cuando es aislado tras someterse a una muesca-dependiente endothelial hematopoyético definitivo de la transición (sección 5)28 producirá CD34+CD45+ de progenitores hematopoyéticos que darán lugar a BFU-E y células mieloides en metilcelulosa, pero no EryP-CFC26,28 (figura 2). Además, colonias BFU-E pueden ser aisladas y evaluadas para el análisis de la globina, que predominantemente voluntad expresa la globina fetal HBG en comparación con embrionarias HBE (no mostrado)26,28, 37. en contraste, el potencial linfoide puede evaluarse directamente de aislado HE, como la transición endotelial hematopoyéticos dependientes de la muesca se produce en el estroma de OP9-DL418,26,28. El definitivo que especificado por este método contiene progenitores Eritro-mielo-linfoide en un clónico nivel28, que la distingue funcionalmente de nuestra comprensión actual de EMP o LMPP progenitores3. Como tal, la presencia de T-linfoide y HBG-expresando eritroides potencial, junto con la ausencia de potencial de EryP-CFC, puede utilizarse para indicar confiablemente la especificación hematopoyética definitiva de hPSCs. De nota, únicamente evaluar para progenitores que pueden dar lugar a HBG-expresando eritroblastos no puede determinar con precisión el potencial definitivo, como, similar a la descrita anteriormente, el EMP humana y sus requisitos de la señal, no ha sido caracterizado hasta la fecha (revisada en la referencia3).

Esta estrategia de diferenciación simple es muy potente ya que permite la generación de exclusivamente primitivo o exclusivamente definitivas progenitores hematopoyéticos, que permite modelar estudios comparativos de los dos programas de iPSCs derivados del paciente de la enfermedad o modificados por el gen hPSCs. Del mismo modo, los procesos de desarrollo humanos pueden ser interrogados, como descubrir qué fiosológicos señal adicional se requiere para conferir capacidad de autorenovación y por lo tanto, HSC como potencial, de los progenitores hematopoyéticos definitivos.

En Resumen, manipulación de WNT durante mesodérmico modelando en hPSCs especifica CD43 primitivo+ o CD34 definitivo+CD45+ de progenitores hematopoyéticos, que pueden ser aislados y utilizados para el estudio de la hematopoyesis hPSC-derivados.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido apoyado por el Departamento de medicina interna, División de Hematología, Washington University School of Medicine. CD fue apoyado por T32HL007088 de la National Heart, Lung and Blood Institute. CMS fue apoyado por una sociedad americana de Hematología Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

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References

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