Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Developmental Biology

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Summary

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

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Dege, C., Sturgeon, C. M. Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (129), e55196, doi:10.3791/55196 (2017).

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Abstract

Um dos objetivos principais para a medicina regenerativa é a geração e manutenção de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Até recentemente, os esforços para diferenciar hPSCs em linfócitos predominantemente geraram progenitores hematopoiéticos que faltam potencial HSC e em vez disso se assemelham a hematopoiese saco vitelino. Estes progenitores hematopoiéticos resultantes podem ter limitado utilitário para modelagem em vitro de doença de várias desordens hematopoiéticas adultos, particularmente aqueles das linhagens linfoides. No entanto, recentemente descrevemos métodos para gerar Eritro-Mielo-linfoide multilineage definitivos progenitores hematopoiéticos de hPSCs usando um protocolo de estágio específico dirigido diferenciação, que nós esboçamos aqui. Através de dissociação enzimática de hPSCs na membrana basal matriz-revestido plasticware, formam-se órgãos do embryoid (EBs). EBs são diferenciadas a mesoderme por recombinação BMP4, que posteriormente é especificado para o programa definitivo hematopoiético do inibidor de GSK3β, CHIR99021. Alternativamente, hematopoiese primitivo é especificado o inibidor PORCN, IWP2. Hematopoiese é impulsionado ainda mais através da adição de recombinação VEGF e citocinas hematopoiéticas solidária. Os progenitores hematopoiéticos resultantes gerados usando esse método tem o potencial para ser utilizado para a doença e a modelagem do desenvolvimento, em vitro.

Introduction

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são definidas como englobando tanto células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) e tem a capacidade única de não só passando por auto-renovação sob condições adequadas de crescimento, Mas também, a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células derivadas das três camadas germinativas: endoderme, mesoderme e ectoderme1. Devido a essas habilidades únicas, hPSCs segurar a grande promessa para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de terapias baseadas na célula2. Enquanto vários tipos de células têm sido diferenciados com êxito de hPSCs, um desafio significativo é a especificação em vitro de exclusivamente como adulto hPSC-derivado tronco células hematopoiéticas (linfócitos) e progenitores hematopoiéticos definitivos.

Um provável barreira para o desenvolvimento de linfócitos humanos de hPSCs é a presença de múltiplos programas hematopoiéticas dentro do embrião humano3. O primeiro programa que emerge, denominado "hematopoiese primitivo," origina-se dentro do tecido extraembryonic saco vitelino e melhor caracteriza-se por sua produção transiente de progenitores eritroblasto (EryP-CFC), macrófagos e megacariócitos. Notavelmente, este programa não dá origem a linfócitos, nem dá origem a progenitores linfoides T e B. No entanto, o saco vitelino transitoriamente originar restritos definitivas progenitores hematopoiéticos, tais como o progenitor mieloide-Eritro (EMP4,5,6,7,8) e o deficiente eritroide linfoide-aprontadas multipotent progenitor (LMPP9). No entanto, EMPs nem LMPPs são totalmente multipotentes, ou capaz de HSC-como enxertia em adultos destinatários. Em contraste, mais tarde, em desenvolvimento, o programa hematopoiético "definitivo" classicamente definido é especificado na região da aorta-gônada-mesonephros do embrião propriamente dito, dando origem a todas as linhagens hematopoéticas adultas, incluindo o HSC. A especificação dessas células hematopoiéticas definitivo intra embrionário ocorre em uma forma de entalhe-dependentes, através de uma transição endotelial-para-hematopoiéticas do hemogenic endotélio (ele)3,10,11 ,12,13,14. Além da capacidade de reconstituição, o potencial de multilineage e entalhe-dependência destas células podem ser usado para distinguir estes progenitores hematopoiéticos definitivos o EMP e o LMPP (revisto em referências3,13 ).

Compreender o mecanismo (s) que regem a especificação hematopoiética primitiva e definitiva de hPSCs é provável crítica à produção reprodutível de progenitores hematopoiéticos definitivas através de uma variedade de linhas hPSC. Até recentemente, hPSC protocolos de diferenciação que poderiam separar multipotentes progenitoras hematopoiéticas primitivas e definitivas não existia15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Muitas abordagens usando soro fetal bovino (FBS) e/ou do estroma co-cultura primeiro delineou o potencial hematopoiético do hPSC diferenciação, com misturas de primitivo e definitivo hematopoiéticas potencial15,16, 17,19,22,23,25. Além disso, muitos protocolos isento de soro hematopoiéticos têm descrito os requisitos de sinal para a especificação da mesoderme de hPSCs que abriga hematopoiéticas potencial18,20,21, 24. no entanto, como esses métodos ainda deram origem a misturas heterogêneas de ambos os programas, seu uso em aplicações clínicas e mecanismos de compreensão do desenvolvimento pode ser limitado.

Temos recentemente construído sobre esses estudos, tendo descrito os requisitos específicos do estágio sinal para União/NODAL e sinalização de WNT na especificação hematopoiética primitiva e definitiva de hPSC-derivado do mesoderma18,26 . Este último foi particularmente original, como seu uso de manipulação de sinal WNT estágio específico permite a especificação de exclusivamente primitivo ou de progenitores hematopoiéticos definitivo exclusivamente26. Durante a especificação de mesoderme, a inibição da sinalização de WNT canônico com o inibidor PORCN IWP2 resulta na especificação de CD43+ EryP-CFC e progenitores mieloides, sem potencial linfoide detectável. Em contraste, estimulação de sinalização WNT canônico com o inibidor de GSK3β, CHIR99021, durante a mesma fase de diferenciação resultou na completa ausência de CD43 detectável+ EryP-CFC, enquanto simultaneamente levando para o especificação de CD34+CD43 . Esta população possuía mieloide, HBG-expressando eritroide e potencial T-linfoide. Análises subsequentes identificaram isso como falta a expressão de seu potencial hematopoiética e CD18428e CD7327,28 era entalhe-dependente28. Além disso, a única célula análises clonais demonstraram que estas linhagens hematopoiéticas definitivas podem ser derivadas de células únicas multipotentes28. Tomados em conjunto, estes estudos indicam que estágio específico WNT sinalização manipulação pode especificar progenitores hematopoiéticos primitivos puros, ou progenitores hematopoiéticos definitivos multipotentes de entalhe-dependente.

Aqui, nós esboçamos nossa estratégia de diferenciação que produz exclusivamente primitivos ou definitivas progenitores hematopoiéticos, através da manipulação de WNT canônico sinalização durante a padronização mesodérmicas e sua linhagem a jusante hematopoiética ensaios. Este protocolo é de grande valor para os investigadores que estão interessados na produção de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivos de hPSCs para aplicações de medicina regenerativa.

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Protocol

1. reagentes

  1. obter célula linhas; hESCs ou hiPSCs 1, rato embrionárias fibroblastos (MEFs) 29, OP9-DL4 estroma 30 , 31.
  2. preparação do reagente
    1. preparar uma solução a 0,1% w/v de gelatina em PBS. Esterilizar em autoclave e armazenar a 4 ° C depois de alíquotas.
      1. Preparar o plasticware gelatina-revestido. Casaco bem 6 pratos com 1,5 mL de solução de gelatina de 0,1%. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente. Imediatamente antes do uso, aspirar a solução restante gelatina.
    2. Preparar a mídia do MEF, tornando IMDM com 15% v/v FBS e 1 x antibióticos. Suplemento com 2 mM L-glutamina e 400 µM monothioglycerol (MTG) antes de usar e armazenar em 4 ° C.
    3. Preparar meios de cultura o hPSC como uma solução de DMEM/F12 com substituição de soro do 20% v/v nocaute (KOSR), 1 x não aminoácidos essenciais (timina), 1 x antibióticos, 55 µM β-Mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina e 10 ng/mL bFGF. Filtro de esterilização com um filtro de 2 µm e armazene no escuro a 4 ° C.
    4. Meios de lavagem Prepare o soro-livre como uma solução de DMEM/F12 com 5% v/v KOSR e 4mm HCl. filtro de esterilização com um filtro de 2 µm, alíquota e armazene-o no escuro a 4 ° C.
    5. Fazer um 1 mg/mL DNase eu solução dissolvendo DNase I para 3-4 h em água desionizada gelada e estéril no gelo. Filtro de esterilização com um filtro de 2 µm e armazenar alíquotas a -20 ° C.
    6. Preparar a solução de paragem com mídia de lavagem: adicionar 10% FBS e 10 µ g/mL DNase eu. A solução de paragem deve ser preparada imediatamente antes da utilização.
    7. Preparar a matriz da membrana basal (por exemplo, matrigel, referido como esteira aqui) solução mistura.
      Nota: Todas as etapas se preparando e usando a esteira mistura devem ser executadas no gelo ou no 4 ° C. Thaw congelado esteira no gelo a 4 ° C durante a noite. Diluir a esteira 1:1, adicionando 10 mL gelada IMDM e frio no gelo a 4 ° C durante a noite. Dilua a mistura esteira com um adicional 20 mL gelada IMDM e frio no gelo a 4 ° C durante a noite. Alíquota em tubos previamente refrigerados e loja a-20 ° C até o uso. Quando estiver pronto para uso, descongelar uma mistura esteira durante a noite a 4 ° C. Placas de cultura celular
      1. casaco o MAT.
        Nota: Todas as etapas da esteira placas de revestimento devem ser realizadas no gelo. Pre-frio placas 6-poços e 24-bem a-20 ° C durante pelo menos 1 h. Quando estiver pronto para placas de revestimento, colocá-los no gelo. Cubra cada poço com 4 MAT x-diluído, remover e re-utilizando qualquer solução em excesso. Deixe no gelo por 30-60 min e aspire o excesso MAT. Secar as esteira placas revestidas em uma 37 ° C 5% CO 2 incubadora para um mínimo de 3 h. uso até 72 horas após revestimento.
    8. Preparar a solução de 10% albumina de soro bovino (BSA), dissolvendo-se 10% w/v BSA em água gelada, água destilada, deionizada a 4 ° C, durante 3-4 h.. filtro para esterilizar com um filtro de 2 µm em uma garrafa de bloqueio de luz e loja em 4 ° C.
    9. Preparar a solução de ácido ascórbico. Dissolva lentamente uma solução de 5 mg/mL de ácido L-ascórbico em água gelada, água destilada, deionizada no gelo para 3-4 h. redemoinho ocasionalmente até dissolver. Filtro de esterilização com um filtro de 2 µm e armazenar alíquotas a -20 ° C.
    10. Preparar a mídia de diferenciação isento de soro (SFD) tornando-se uma solução de 75:25 de IMDM:Ham ' s F-12, em seguida, adicionar 0,5% BSA, 1x B27 e 0,5 x N2 suplementos. Loja em 4 ° C. adicionar 1 x L-glutamina, 50 µ g/mL de ácido ascórbico, 400 µM MTG e 150 µ g/mL holo-transferrina imediatamente antes de usar.
    11. Preparar meios de cultura de células-tronco isento de soro (por exemplo, StemPro, conhecido como SP34 aqui) pelo fabricante ' instruções s. Loja em 4 ° C. adicionar 1 x L-glutamina, 50 µ g/mL de ácido ascórbico, 400 µM MTG e 150 µ g/mL holo-transferrina imediatamente antes de usar.
    12. Preparar a solução de colagenase II de 0,2% por dissolução colagenase II para uma concentração final de 0,2% p/v em solução de 1:4 FBS:PBS de
    13. . Dissolver em banho de água a 37 ° C durante pelo menos 15 min. filtro para esterilizar a solução com um filtro de 2 µm e armazenar alíquotas a -20 ° C.
    14. Preparar o buffer de fluorescência ativado celular classificação (FACS) como uma solução de 5% FBS na IMDM imediatamente antes de usar.
    15. Preparar OP9 mídia como uma solução de α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-glutamina e 1 x antibióticos. Filtro de esterilização com um filtro de 2 µm e armazene a 4 ° C.
    16. Obter mídia baseada em metilcelulose (por exemplo, MethoCult, conhecido como MeC aqui) como quantidades pre-aliquotadas 3ml ou como um frasco de 100 mL. Se usando o 100ml MeC, à chegada, dividir em alíquotas de 2,5 mL em tubos cônicos de 14 mL.
      Nota: Todas as alíquotas devem ser armazenadas a-20 médio de MeC ° C. alíquotas devem ser descongeladas imediatamente antes de usar.

2. Diferenciação da mesoderme de hPSCs

  1. crescer o hPSC linhas de células em MEFs à confluência de 70-80%, em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2.
    Nota: Os hPSCs devem ter bordas afiadas, indiferenciadas.
  2. Preparar MAT-revestido plasticware 24 h antes da passagem do hPSCs.
    Nota: O número total de pratos de 6-Poços revestidos MAT varia consoante hPSC linhas. Normalmente, três pratos de 6-poços são suficientes por prato 6-poços de hPSCs confluentes em MEFs. Alimentador de
    1. realizar um julgamento-esgotamento com diferentes proporções de poços hPSCs:MAT confluente (1:4, 1:3, 1:2, etc.) antes da primeira diferenciação para determinar quantos pratos de 6-Poços revestidos MAT devem ser usados para diferenciações subsequentes.
      Nota: 24h após chapeamento para esteira, o hPSCs deve ser confluente de 80-90%, com grupos de célula de aproximadamente 10-20 células de tamanho.
  3. Aspire a mídia hPSC e adicione 1 mL de 37 ° C 0,25% Trypsin-EDTA para cada um bem por 1 min. aspirado e adicionar mídia de parada de 1 mL para cada poço. Com uma espátula de célula, raspe as células no prato. Adicione 1 mL de tampão de lavagem a cada poço.
    1. Com uma pipeta sorológica 2ml, Triture a 3 - 5 vezes para quebrar grandes aglomerações de células e transferir as células para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugue a hPSCs a 330 x g, durante 5 min.
  4. Ressuspender as células em um volume total de mídia hPSC equivalente a 2 mL por bem do plasticware MAT-revestido para ser usado. Adicionar 2 mL/poço de hPSCs para o plasticware e incubar durante uma noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2.
  5. 24h depois, Aspire a mídia e substitua a 37 ° C 0,05% Trypsin-EDTA de 1 min. Aspire o Trypsin-EDTA e adicionar 1 mL STOP mídia. Raspe as células vigorosamente com um raspador de célula. Adicione mídia de lavagem 1 mL para cada poço. Com uma pipeta sorológica 2ml, Triture as células 1 - 2 vezes e transfira para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar as células a 220 x g, durante 5 min.
    Nota: O comprimento do tempo do Trypsin-EDTA tratamento shouLD ser determinado pelo investigador para cada linha de hPSC. O tratamento de tripsina deve ser aplicado para o maior tempo possível sem causar dissociação de célula única. Esta etapa deve desanexar todos os hPSCs das placas revestidas a esteira, mas não resulta na dissociação de célula única. EBs resultante deve ser de 6 a 10 células, em média.
  6. Aspire os meios de comunicação. Usando uma pipeta sorológica 5ml, delicadamente Ressuspender as células em meios de lavagem de 20 mL. Centrifugar a 220 x g por 5 min.
  7. Ressuspender delicadamente o EBs na mídia dia 0 (tabela 1). Distribuir 2 mL de mídia de diferenciação contendo EBs em cada poço de um prato de cultura 6-poço baixo-aderentes célula usando uma pipeta sorológica 10ml. Coloque em uma incubadora 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (multi-gás).
    Nota: Dia 0 meios de comunicação: mídia SFD suplementada com 10 ng/mL BMP4 (tabela 1). Para cada duas placas de hPSCs, use um prato de cultura 6-poço baixo-aderentes célula.
  8. 24 horas mais tarde, adicionar 2 mL de mídia dia 1 (tabela 1). Incubar as células durante a noite em uma incubadora multi-gás.
    Nota: Dia 1 meios de comunicação: mídia SFD suplementada com 10 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL bFGF a cada poço (tabela 1).
  9. 18 h depois, suavemente colher o EBs com uma pipeta sorológica 5ml e girar a 100 x g por 5 min. Lave e combinar toda a cultura com 10 mL IMDM. Rotação a 100 x g por 5 min. Aspire a mídia.
    Nota: Os restos existirá nas culturas. Esta etapa de centrifugação a baixa velocidade (100 x g) irá remover os detritos.
  10. Suavemente resuspenda o EBs em mídia SFD suplementada com mídia dia 2 (tabela 1) e então dispense 2 mL por bem em placas de cultura de célula 6-poço baixo-aderente. Incubar em uma incubadora de multi-gás de 37 ° C por 30 h.
    Nota: Dia 2 meios de comunicação: 10 ng/mL BMP4, 5 ng/mL bFGF e agonista WNT apropriada e o antagonista (tabela 1).
    1. Adicionar 3 µM CHIR99021 para especificar progenitores hematopoiéticos definitivos. Como alternativa, adicionar 3 µM IWP2 e 1 ng/mL União para especificar progenitoras hematopoiéticas primitivas.
  11. Continuar a seção 3 para especificação de progenitoras hematopoiéticas.

3. especificação de CD34 + progenitores hematopoiéticos

  1. após 30 h, isolar o EBs com uma pipeta sorológica 2ml no dia 3 de diferenciação. Transfira para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar a 330 x g por 5 min. suavemente Resuspenda e lavar com 10 mL de IMDM. Centrifugar as células novamente a 330 x g, durante 5 min.
  2. Resuspenda o EBs na mídia dia 3 (tabela 2) e dispense 2ml em cada poço de baixa-aderente 6-poços chapas. Incubar as células em uma incubadora de multi-gás de 37 ° C por 72 h.
    Nota: Dia 3 meios de comunicação: SP34, suplementado com 15 ng/mL VEGF e bFGF 5 ng/mL (tabela 2). Adicione mais mídia por bem se o pH dos meios de comunicação colhidos no dia 3 de diferenciação foi significativamente alterado (ou seja, mídia de amarelo-laranja). Como alternativa, use menos EBs por alvéolo no dia 0.
  3. Após 72 h de incubação, adicionar 2 mL de mídia dia 6 (tabela 2) para cada poço. Incubar em uma incubadora de multi-gás de 37 ° C para um adicional h. 48
    Nota: Dia 6 meios de comunicação: mídia SP34 suplementada com 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL, IL-6, IL-11 de 10 ng/mL e 50 ng/mL, IGF-1 (tabela 2). Se mais mídia foi adicionada na etapa 3.1, em seguida, adicione a quantidade equivalente de mídia no passo 3.2 para que as concentrações de citocinas final permanecem os mesmos.
  4. Isolar o EBs CHIR99021-tratado no dia 8 de diferenciação. Prossiga para a secção 4.
  5. IWP2-EBs tratados são colhidas no dia 8 de diferenciação em um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar 330 x g por 5 min. Ressuspender delicadamente na mídia dia 8 (tabela 2). Incube durante 24 h em uma 37 ° C 5% CO 2 incubadora em baixos pratos aderentes. Prossiga para a secção 4.
    Nota: Dia 8 meios de comunicação: mídia SP34 suplementada com 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL, IL-6, IL-11 de 5 ng/mL, 25 ng/mL, IGF-1, TPO de 30 ng/mL, 10 ng/mL Flt3-L e 30 ng/mL IL-3 (tabela 2).

4. Enzimático dissociação de EBs e isolamento de progenitoras hematopoiéticas

tubo
  1. isolar o EBs com uma pipeta sorológica para um Erlenmeyer de 50 mL. Centrifugar a 330 x g por 5 min. aspirado de fora o sobrenadante.
  2. Adicionar 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA para a EBs. Vórtice para 5 s. Incubar em banho-maria 37 ° C por 8 min. Adicione 5 mL da solução de paragem. Centrifugar a 330 x g por 5 min. aspirado de fora o sobrenadante.
  3. Resuspenda o EBs em 5 mL de colagenase II. Vórtice para 5 s e incubar em banho maria a 37 ° C. Depois de 60 min, vórtice para 5 s e adicionar 5 mL de solução de paragem. Girar a 330 x g por 5 min. aspirado de fora o sobrenadante.
  4. Em 1 mL de tampão de FACS, Ressuspender as células. Passe as células através de um filtro de célula de 40 µm. Isso remove qualquer touceiras de célula indissociadas.
  5. Conta as células. Alíquota 1 x 10 6 células para um tubo cónico de 14 mL. Gire as células a 330 x g, durante 5 min. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 10 6 células/mL no buffer de FACS. Alíquota e piscina 10% das células em cada condição de fluxo cytometric cor controles. Incube as celulas em anticorpos por 30 min no gelo, no escuro.
    Nota: Ver sugeriu combinações fluoróforo na Tabela de materiais.
    1. Para IWP2-tratada células, uso de anticorpos anti-CD34 e anti-CD43.
    2. Células para CHIR99021-Tratado, uso de anticorpos anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 e anti-CD184.
  6. Enxaguar as células duas vezes usando FACS buffer. Girar a 330 x g por 5 min. Ressuspender as células em uma concentração final de 5 x 10 6 células/mL.
  7. Analyze ou isolado de células por citometria de fluxo. Para o primitivos progenitores hematopoiéticos, analise a expressão de CD34 e CD43 ( Figura 2A). Para definitivos progenitores hematopoiéticos, isolar o HE (CD34 + CD43 CD73 CD184 ) pela FACS ( Figura 2B). Coletar as células em tubos contendo refrigerados FACS buffer.
  8. Para avaliar o potencial hematopoiético definitivo de isolados, continuar a seção 5 para a transição endotelial-para-hematopoiéticas, ou seção 7 para ensaio T-linfoide. Para os primitivos ensaios CFC hematopoiéticos, continuar a secção 6.

5. Endotelial-para-hematopoiéticas transição

  1. Spin o CD34 isolado + CD43 CD73 CD184 células a 330 x g, durante 5 min. Ressuspender as células em mídia em 200.000 cels/mL ( Tabela 2). Distribua as células em 50 alíquotas µ l em uma placa de cultura de células 96 poços baixo-aderente. Incubar as células durante a noite em uma incubadora 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi-gás.
    Nota: Ele mídia: mídia SP34 suplementada com 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, IL-6, IL-11, 25 ng/mL, IGF-1, TPO de 30 ng/mL, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3 de 5 ng/mL de 10 ng/mL, 10 ng/mL BMP4, SHH de 20 ng/mL, 10 µ g/mL da angiotensina II e potássio de Losartan 100 µM a 2 x 10 5 células/mL (tabela 2).
  2. Preparar as 24-bem MAT-placas revestidas (consulte a etapa 1.2.7.1), conforme necessário.
  3. As células agregará em grupos de 6 a 10 células durante a noite. Para cada volume de 50 µ l de células reaggregated, transferi suavemente as células para o centro de uma placa de esteira-revestido 24-bem na manhã seguinte. Gentilmente colocar placa na incubadora de multi-gás 37 ° C para 4-6 h, até que as células estão anexadas.
  4. Adicione 1 mL da nova mídia a cada poço, depois que as células estão conectadas. Incubar as células numa incubadora 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gás até as células hematopoiéticas são visíveis (geralmente 5-7 dias; Figura 2D). Visualize abaixo dos 100 ampliação de X usando um microscópio de luz.
  5. Colhe os progenitores hematopoiéticos definitivos removendo suavemente a mídia do células. Passe essa mídia através de um filtro de célula 40 µm e recolher. Para as células aderentes no poço, adicionar 0,5 mL 0,25% Trypsin-EDTA para células e incubar a 37 ° C por 5 min. Adicionar solução de paragem de 0,5 mL para cada poço. Passe por células através o mesmo 40 µm filtro de célula para todos os aderentes do pool e células não-aderentes juntos. Girar a 330 x g, durante 5 min.
    1. Para avaliar o potencial de CFC dessa cultura de massa, proceder-se à secção 6.
  6. Lavar as células duas vezes no buffer de FACS. Girar a 330 x g, durante 5 min.
  7. Ressuspender as células em buffer FACS 5 x 10 6 células/ml. Manchar as células com anticorpos anti-CD45 e anti-CD34 por 30 min no gelo no escuro (sugeriu fluorophores estão na Tabela de materiais).
  8. Lavar as células duas vezes no buffer de FACS. Girar a 330 x g, durante 5 min.
  9. Isolar o CD34 + CD45 + células por FACS ( Figura 2E). Classificar as células em buffer de FACS refrigerado.
  10. Avaliar o CD34 definitivo + CD45 + progenitores hematopoiéticos como necessário (ensaio de CFC na seção 6, potencial linfoide na secção 7 ou outro ensaio iniciada pelo investigador).

6. CFC ensaio

  1. descongelar alíquotas do MeC para cada amostra utilizada para o ensaio de CFC.
  2. Adicionar as células para ser analisadas (etapas 4.5, 4.7, 5.5 ou 5,9) no MeC. Vórtice cuidadosamente e deixe as culturas MeC defendem a 5-10 min até que as bolhas de ar se dissipar, conforme o fabricante ' instruções s. Usando um 16 ½ calibre a agulha de uma seringa de 3 mL, remova cuidadosamente 2 mL do MeC.
    Nota: Chapeamento típico densidades variam de 1.000-20.000 células/mL, dependendo da frequência de progenitor antecipado.
  3. Cuidadosamente, distribuir 1 mL de mistura de célula MeC em cada um dos dois pratos de cultura de tecido de 35 mm. Distribua uniformemente o MeC nos pratos 35mm suavemente tocando e girando o prato. Cada um dos pratos acima Coloque em um prato de cultura de tecidos de 15cm cheio de água. Incubar a 37 ° C 5% CO 2 incubadora.
  4. Visualizar as culturas MeC usando um microscópio de luz usando a ampliação de 40 X. Quantificar os diversos CFC obtidos. Analise os ensaios CFC primitivo 8-10 dias após o chapeamento ( Figura 2). Analise os ensaios CFC definitivo 14 dias depois do chapeamento. As morfologias da colônia do ensaio de CFC representante podem ser vistas na Figura 2F.

7. Ensaio de células T para estabelecer definitiva Hematopoietic potencial

  1. cresce a OP9-DL4 células até confluente em uma cultura de tecidos de 100mm prato 30 , 31 , 32.
    1. thaw a OP9-DL4 células 72-96 h antes do chapeamento os ensaios de célula T. Ressuspender as células OP9-DL4 10ml OP9 mídia e dispense em uma placa de 10 cm. Crescer numa incubadora 37 ° C 5% CO 2 até 70-90% de Confluencia.
    2. Para colher as células OP9-DL4 de um prato de 100 mm, remova a mídia e adicionar 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA 5 min. parar a atividade de tripsina com 5 mL de mídia OP9. Girar as células a 330 x g, durante 5 min. Ressuspender as células em 1 mL OP9 mídia e contar as células.
      Nota: Uma placa de 10cm de OP9-DL4 confluentes renderá aproximadamente 10 x 10 6 células OP9-DL4.
    3. 48 h antes do ensaio de células T, células de placa de 2 x 10 6 em 12 mL OP9 mídia em um prato de 24 poços (0,5 mL/poço). Crescer numa incubadora 37 ° C 5% CO 2.
  2. Adicionar 1 bem de células OP9-DL4 na mídia OP9 suplementada com 2.000-10.000 células para ser analisada (como obtidos em etapas 4.5, 4.7, 5.5 ou 5,9): SCF (primeiros 6 dias apenas) de 30 ng/mL, 5 ng/mL IL-7 e 5 ng/mL FLT3-L. Incubar a 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. Nenhuma alteração de mídia ocorre neste passo.
  3. Cada 4 - 5 dias, passage os progenitores de células T em fresco OP9-DL4 células do estroma em um prato de 6-poços. Triture as células com uma pipeta de 1 mL e passar por um filtro de 40 µm para remover grupos. Girar a 330 x g por 5 min. aspirado fora da mídia. Ressuspender as células em 2 mL de fresco OP9 mídia suplementada com 5 ng/mL IL-7 e 5 ng/mL Flt3-L e lugar fresco células OP9-DL4.
    Nota: 48 h antes da passagem, placa 2 x 10 6 células OP9-DL4 frescas 12 mL OP9 mídia e distribuir 2 mL/bem em pratos bem 6.
  4. Depois de pelo menos 21 dias de co-cultura, Triture as células vigorosamente e passe através de um filtro de 40 µm para remover os resíduos de célula. Girar a 330 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante.
  5. Lavar as células duas vezes em buffer a frio FACS. Girar a 330 x g, durante 5 min.
  6. Ressuspender as células em buffer FACS 5 x 10 6 células/ml. Mancha de células com anticorpos anti-CD45, CD56-anti, anti-CD4 e anti-CD8 por 30 min no gelo no escuro (fluoróforo sugerido combinações estão na Tabela de materiais). Aplicar uma mancha de célula viva/morta (DAPI, etc.) para remover os resíduos da análise.
  7. Lavar as células duas vezes no buffer de FACS. Girar a 330 x g, durante 5 min.
  8. Analisar as células usando um citômetro de fluxo para avaliar a presença de progenitores de linfócitos T ( Figura 3).

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Representative Results

Um esquema representando a indução de progenitores hematopoiéticos primitivos e definitivos de hPSCs é ilustrado na Figura 1. Mesoderme padronização por WNT canônico sinalização ocorre durante os dias 2-3 de diferenciação, seguido de especificação progenitoras hematopoiéticas.

Representativa do fluxo cytometric análise e formadoras de ensaios de metilcelulose de culturas hPSC-derivado de diferenciação hematopoiéticas são mostrados na Figura 2. Culturas de diferenciação tratadas IWP2 renderá um distinto CD34+CD43 e CD34baixa /CD43+ população, enquanto culturas diferenciação tratadas CHIR terá < 1% CD43+ células no dia 8 de diferenciação (Fig. 2AB)26. Primitivos progenitores hematopoiéticos derivadas sob condições de IWP2 isoladas em dia 9 dará origem a eritroide predominantemente primitivo (EryP-CFC) e progenitores mieloides em ensaios a metilcelulose, enquanto culturas tratadas CHIR será em grande parte desprovida de CFC potencial nesta fase (Figura 2F). Em vez disso, o CD34+CD43 população , derivada do tratamento de CHIR99021 é uma população heterogênea, contendo progenitoras endoteliais, bem como CD34+CD43CD73CD184 ele ( Figura 2B), que, quando isolado por FACS, inicialmente irá formar uma monocamada de células endoteliais, como (Figura 2D, painel esquerdo), que então sofre uma transição endotelial-para-hematopoiéticas, resultando na rodada, refractile não-aderente células hematopoiéticas (Figura 2D, painel direito). Estas células hematopoiéticas podem ser avaliadas por citometria de fluxo para a expressão de CD34 e CD45 (Figura 2E). Progenitoras hematopoiéticas isoladas de ensaios os EHT podem ser usadas em ensaios de metilcelulose e dar origem a grande explosão, como eritroide as unidades formadoras de Colônia (BFU-E), pequeno eritroide as unidades formadoras de Colônia (CFU-E) e progenitores mieloides (CFU-M; Figura 2F).

A Figura 3 retrata análises de cytometric fluxo representativo dos ensaios linfócitos T potenciais de CHIR99021-derivado CD34+CD43CD73CD184 progenitores hematopoiéticos (Figura 3A) e IWP2-derivado CD34 (Figura 3B)+CD43 progenitores hematopoiéticos, após 21 dias de OP9-DL4 co-cultura. A presença de um CD45+CD56CD4+CD8+ população em progenitores CHIR-derivado é indicativa de potencial hematopoiética definitivo dentro da entrada CD34+ população. CD34+ e CD43+ progenitores isolados de IWP2-derivado diferenciações não dar origem a linfócitos T neste ensaio, sob essas condições de diferenciação18,26.

Figure 1
Figura 1: diagrama esquemático do protocolo para a especificação de progenitores hematopoiéticos definitivos e primitivos. Representação das principais etapas experimentais e cronogramas da diferenciação da EBs de progenitores hematopoiéticos definitivos e primitivos. EBs são geradas no dia 0 do hPSCs na esteira-revestido plasticware. EBs são cultivadas em meios SFD contendo BMP4 numa incubadora multi-gás. No dia 1 de diferenciação, as culturas são alimentadas com meios suplementados com BMP4 e bFGF. No dia 2, uma mudança de mídia ocorre com manipulação de WNT através da adição de CHIR99021 (CHIR) para definitivos progenitores hematopoiéticos e IWP2 de progenitores hematopoiéticos primitivos. No dia 3, a mídia é alterada para SP34, suplementado com VEGF e bFGF. No dia 6, as culturas são alimentadas com meios suplementados com citocinas hematopoiéticas. No dia 8 da especificação hematopoiética primitiva, a mídia é alterada e as células são movidas para uma 5% CO2 incubadora durante 24 h, seguida-se o ensaio de (HPC) de células progenitoras hematopoiéticas. No dia 8 de especificação hematopoiética definitiva, CD34+CD43CD73CD184 células são isoladas por FACS e ensaio definitivo hemogenic potencial endotelial, ou T-linfoide potencial (não representado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise de culturas de diferenciação e geração de progenitores hematopoiéticos primitivos. (A) representativo fluxo cytometric análises progenitores hematopoiéticos primitivos de EBs IWP2-tratada no dia 8. (B) análises de cytometric fluxo representativo do EBs CHIR99021-tratado no dia 8. Endotélio Hemogenic (ele) pode ser identificado e isolado como um CD34+CD43CD73CD184 população . (C) potencial formadoras de progenitores hematopoiéticos do dia 9 de IWP2 - e CHIR99021 - (CHIR) tratados culturas de diferenciação. n = 3, barras de erro representam SD da média, asteriscos indicam significância estatística, utilizando o teste t de student * * * p < 0,0001. (D) fotografias representativas dos isolado ele células depois de 4 dias (à esquerda) ou 7 dias + (direita) do crescimento na esteira-revestido plasticware. Original magnificação, 100x. Barras de escala = 100 µm. (E) representante citometria de fluxo de expressão de CD34 e CD45 de progenitores hematopoiéticos definitivos após 9 dias de cultura. (F) fotografia representativa mostrando a morfologia de EryP-CFC (à esquerda), CFU-M (médio), BFU-E e CFU-E (à direita). Ampliação original, 40 X. Barras de escala = 100 µm. setas indicam nomeado colônias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise do potencial hematopoiética definitivo. Análises de representante fluxo cytometric do linfócito T potencial de CD34 CHIR-derivado+CD43CD73CD184 progenitoras hematopoiéticas (A) ou derivado de IWP2 (B) CD34+CD43 progenitores hematopoiéticos, 28 dias depois da co-cultura com células OP9-DL4. O potencial de linfócitos-T de uma amostra é considerado positivo se houver mais de 100 CD45+ eventos detectados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

idade = "sempre" > SFD Media Dia 0 Dia 1 2º dia definitivo Dia 2 primitivo BMP4 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL bFGF - 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL União A - - - 1 ng/mL CHIR99021 - - 3 ΜM - IWP2 - - - 3 ΜM

Tabela 1: SFD-baseado dos meios para dias 0 - 2.

SP34 Media Dia 3 Dia 6 Dia 8 ELE
VEGF 15 ng/mL 15 ng/mL - 5 ng/mL
bFGF 5 ng/mL 5 ng/mL - 5 ng/mL
SCF - 200 ng/mL 100 ng/mL 100 ng/mL
EPO - 4 UI 2 UI 2 UI
IL-6 - 20 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-11 - 10 ng/mL 5 ng/mL 5 ng/mL
IGF-1 - 50 ng/mL 25 ng/mL 25 ng/mL
TPO - - 30 ng/mL 30 ng/mL
FLT - 3L - - 10 ng/mL 10 ng/mL
IL-3 - - 30 ng/mL 30 ng/mL
BMP4 - - - 10 ng/mL
SHH - - - 20 ng/mL
Angiotensina II - - - 10 µ g/mL
Losartan potássio - - - 100 ΜM

Tabela 2: SP34-baseado dos meios para 3 dias - 8 e ele.

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Discussion

Este protocolo descreve um método de rápida, livre de soro, estroma-livre para a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivos. Mesodérmicas especificação de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivas pode ser confiantemente alcançada usando nosso protocolo, que explora com exclusividade a inibidores de pequenas moléculas de sinalização de WNT canônico. Activação do WNT estágio específico com o inibidor de GSK3β CHIR9902133 dá origem a mesoderme hematopoiética definitivo, Considerando que inibição WNT pelo inibidor PORCN IWP234 especifica primitivas hematopoiéticas mesoderme26. Digno de nota, esse método não robustamente dá origem a uma população de HSC-como engraftable (não mostrada). No entanto, os progenitores hematopoiéticos definitivos gerados com esta abordagem são aptos para enxertia induzida pelo transgene potencial35, destacando suas potenciais aplicações no futuro translacionais.

Um determinante crucial para sucesso hPSC diferenciação é o tamanho inicial da EBs que são formados a partir de hPSCs. Idealmente, a EBs deve ser em torno de 6-10 pilhas de tamanho. As culturas de diferenciação aberrantly podem especificar uma mistura de ambos os programas se o EBs são demasiado grandes, possivelmente devido a ativação do sinal impróprio dentro do EB. Culturas de diferenciação devem ser inspecionadas visualmente para o tamanho ideal do EB dentro as primeiras 24 horas de diferenciação. Alternativamente, se o hPSCs são completamente dissociadas de células únicas, os hPSCs em vez disso se submeter anoikis célula morte36, resultando em pobre diferenciação hematopoiética.

Uma diferenciação bem-sucedida irá suscitar exclusivamente primitivos progenitores hematopoiéticos quando IWP2 é usado durante a especificação mesodérmica no dias 2 e 3 do presente protocolo de diferenciação. No dia 8 de diferenciação, a cultura IWP2-derivado deve ser compreendida por distintas CD34+CD43, CD34meados/baixaCD43+,e CD34CD43+ populações (Figura 2A). O CD34meados/baixaCD43+ população dá origem a primitiva eritroide e progenitores mieloides; enquanto o CD34CD43+ população principalmente dá origem a progenitores eritroide com potencial mieloide limitada18. O potencial hematopoiético primitivo pode ser confirmado pelo ensaio de metilcelulose para a presença de EryP-CFC (secção 6), que será predominantemente express a globina embrionária HBE em comparação com fetal HBG26, 28,37. Da mesma forma, a presença de CD43+ progenitores hematopoiéticos nesta fase podem confiantemente ser usados para indicar a presença de progenitores hematopoiéticos primitivos18,23,26. Note que a expressão CD43 não é exclusivo de progenitores de primitivas hematopoiéticas programa18,23,26e não pode ser usado como a única métrica para avaliar primitivo hematopoiético potenciais, como o imunofenótipo e entalhe-dependência do ser humano EMP permanece descaracterizada (revisto em3).

Quando CHIR99021 é usado durante a padronização mesodérmica durante os dias 2 e 3 de diferenciação, uma população de exclusivamente definitivos progenitores hematopoiéticos será especificada. No dia 8 do protocolo de diferenciação, culturas CHIR99021-derivado devem ser compostas por um distintivo CD34+CD43 população, com pouca ou nenhuma expressão de CD4326. O CD34+CD43 população é uma população heterogênea de células endoteliais com hematopoiética, venosa e arterial potencial que pode ser demarcada com base na expressão CD73 e CD184, com células falta a expressão de ambos os 27,28. Quando definitiva, ele é isolado depois de ser submetido a um entalhe-dependente endotelial-para-hematopoiéticas (secção 5)28 de transição renderá CD34+CD45+ progenitores hematopoiéticos que darão origem a BFU-E e células mieloides em metilcelulose, mas não EryP-CFC26,28 (Figura 2). Além disso, colônias BFU-E podem ser isoladas e avaliadas para análise de globina, predominantemente que irá expressar a globina fetal HBG em comparação com embrionárias HBE (não mostrado)26,28, 37. em contraste, o potencial linfoide pode ser avaliado diretamente do isolado que, como a transição endotelial-para-hematopoiéticas do entalhe-dependente ocorre o OP9-DL4 estroma18,26,28. O definitivo que ele especificado com esse método contém Eritro-Mielo-linfoide progenitores em um clonal nível28, que funcionalmente distingue-lo de nossa compreensão atual do EMP ou LMPP progenitores3. Como tal, a presença de T-linfoides e HBG-expressar eritroide potencial, juntamente com a ausência de potencial de EryP-CFC, pode ser usado para indicar confiantemente a especificação hematopoiética definitiva de hPSCs. Digno de nota, avaliando exclusivamente para progenitores que podem dar origem a HBG-expressando eritroblastos não pode determinar com precisão o potencial definitivo, como, semelhante ao descrito acima, o EMP humana e suas exigências de sinal, não foi caracteriza-se até à data (revisto em referência3).

Esta estratégia de diferenciação simples é muito poderosa, pois permite a geração de exclusivamente primitivo ou exclusivamente definitivos progenitores hematopoiéticos, permitindo estudos comparativos dos dois programas de iPSCs paciente-derivado de modelagem de doença ou modificados gene hPSCs. Da mesma forma, os processos de desenvolvimento humanos podem ser interrogados, como descobrir que pathway(s) sinal adicionais é necessários para conferir a capacidade de auto-renovação e, portanto, HSC-como potencial de progenitores hematopoiéticos definitivos.

Em resumo, manipulação de WNT durante mesodérmica padronização em hPSCs especifica CD43 primitivo+ ou definitivo CD34+CD45+ progenitores hematopoiéticos, o qual podem ser isoladas e usados para estudar a hematopoiese hPSC-derivado.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo departamento de medicina interna, divisão de Hematologia, Washington University School of Medicine. CD foi apoiada pelo T32HL007088 de nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue. CMS foi apoiado por uma sociedade americana de hematologia estudioso Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) Corning 10-016
Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated Gemini Bioproducts 100-500
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30396.03
L-glutamine, 200 mM solution Life Technologies 25030-081
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15070-063
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200056
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300054
Gelatin, porcine skin, Type A Sigma-Aldrich G1890
Alpha-MEM Life Technologies 12000-022
DMEM-F12 Corning 10-092-CV
Knock-out serum replacement Life Technologies 10828028 "KOSR"
Non-essential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140050
b-mercaptoethanol, 55 mM solution Life Technologies 21985023
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Fraction V, Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1605
Ham's F12 Corning 10-080
N2 supplement Life Technologies 17502048
B27 supplement, no vitamin A Life Technologies 12587010
Stempro-34 (SP34) Life Technologies 10639011 "SP34"
Growth factor reduced Matrigel Corning 354230 "MAT"
L-absorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human serum transferrin Sigma-Aldrich 10652202001
Monothioglycerol (MTG) Sigma-Aldrich M6145
Collagenase B Roche 11088831001
Collagenase II Life Technologies 17101015
DNaseI Calbiochem 260913
Phosphate Buffered Saline (PBS) Life Technologies 14190144
bFGF R&D Systems 233-FB
BMP4 R&D Systems 314-BP
Activin A R&D Systems 338-AC
VEGF R&D Systems 293-VE
SCF R&D Systems 255-SC
IGF-1 R&D Systems 291-G1
IL-3 R&D Systems 203-IL
IL-6 R&D Systems 206-IL
IL-7 R&D Systems 207-IL
IL-11 R&D Systems 218-1L
TPO R&D Systems 288-TP
EPO Peprotech 100-64
Flt-3 ligand (FLT3-L) R&D Systems 308-FK
CHIR99021 Tocris 4423
IWP2 Tocris 3533
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525
Losartan Potassium Tocris 3798
CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 BD Biosciences 560650 Dilution 1:100; T cell assay
CD8 PE Clone RPA-T8 BD Biosciences 561950 Dilution 1:10; T cell assay
CD34 APC Clone 8G12 BD Biosciences 340441 Dilution 1:100; EHT assay
CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 BD Biosciences 348801 Dilution 1:100; Hemogenic endothelium
CD43 FITC Clone 1G10 BD Biosciences 555475 Dilution 1:10; Hemogenic endothelium
CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 BD Biosciences 557833 Dilution 1:50; T cell assay
CD45 eFluor450 Clone 2D1 BD Biosciences 642284 Dilution 1:50; EHT assay
CD56 APC Clone B159 BD Biosciences 555518 Dilution 1:20; T cell assay
CD73 PE Clone AD2 BD Biosciences 550257 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
CD184 APC Clone 12G5 BD Biosciences 555976 Dilution 1:50; Hemogenic endothelium
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BD Biosciences 564907 Dilution 1:10,000; T cell assay
OP9 DL4 cells Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156
MethoCult H4034 Stemcell Technologies 4034 "MeC"
Milli-Q water purification system EMD Millipore
5% CO2 incubator Set at 37 C
Multigas incubator Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2
6 well tissue culture plate Corning 353046
24 well tissue culture plate Corning 353226
6 well low-adherence tissue culture plate Corning 3471
24 well low-adherence tissue culture plate Corning 3473
35 mm tissue culture dishes Corning 353001
Blunt-end needle, 16 gauge Corning 305198
3 cc syringes Corning 309657
5 mL polypropylene test tube Corning 352063
5 mL polystyrene test tube Corning 352058
15 mL polypropylene conical Corning 430791
50 mL polypropylene conical Corning 430921
2 mL serological pipette Corning 357507
5 mL serological pipette Corning 4487
10 mL serological pipette Corning 4488
25 mL serological pipette Corning 4489
Cell scrapers Corning 353085
2.0 mL cryovials Corning 430488
5 mL test tube with 40 µM cell strainer Corning 352235
40 µM cell strainer Corning 352340
Cell culture centrifuge
Biosafety hood
FACS AriaII or equivalent
LSRii or equivalent
FlowJo software TreeStar
Water bath Set at 37 C
0.22 µM filtration system Corning
Autoclave
4 C refrigerator
-20 C Freezer
-80 C Freezer

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References

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