使用人类流感病毒感染的斑马鱼模型到屏幕抗病毒药物和表征宿主免疫细胞反应

Immunology and Infection

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Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

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Abstract

Introduction

据世界卫生组织(WHO),流感病毒感染的成年人的5%-10%,每年儿童的20-30%,并导致300万-500万严重病例和全世界1到500,000人死亡。对流感疫苗接种每年仍然以防止疾病的最佳选择。像世卫组织全球行动计划的努力,以降低发病率和季节性流感暴发2相关的死亡率增加了季节性流感疫苗的使用,疫苗生产能力,以及研究和开发更有效的疫苗策略。抗病毒药物像神经氨酸酶抑制剂( 例如 ,扎那米韦和奥司他韦)是在一些国家可用以及缓解症状已被证明有效,当发病3,4,5的第一48小时内给药。尽管全球努力,季节性流感遏制欧tbreaks保持此时一个严峻的挑战,因为流感病毒抗原漂移往往超过适应病毒6的改变基因组中的电流的能力。疫苗策略靶向病毒的新菌株必须提前开发,有时由于在类型菌株,在一个流感季节最终占优势不可预见的变化呈现小于最佳效果。由于这些原因,有一个明确需要制定包含感染和死亡率降低替代治疗策略。通过实现更好的理解在主机病毒相互作用,有可能开发新的抗流感药物和辅助疗法7,8。

人宿主A型流感病毒(IAV)相互作用是复杂的。人类IAV感染的几种动物模型为了深入了解宿主病毒相互作用,大型的源码已经开发ING小鼠,豚鼠,棉鼠,仓鼠,雪貂,猕猴和9。同时提供具有增强宿主IAV动力学的理解的重要数据,每个模式生物拥有必须尝试将结果转化为人类医学时,应考虑显著的缺点。例如,小鼠,这是最广泛使用的模型,不容易与人流感分离株9感染时开发IAV诱导感染症状。这是因为小鼠缺乏对人流感的天然趋向性分离自小鼠上皮细胞表达α-2,3-唾液酸连接,而不是对人上皮细胞10表示的α-2,6唾液酸连接。存在于人类IAV的血凝素蛋白的分离从优结合并进入宿主细胞到通过受体介导的内吞作用9,11α-2,6唾液酸连接 12,13。因此,现在已被接受,在发育的小鼠模型的人流感,必须小心,以与流感的适当应变配对鼠标的适当应变,以达到疾病表型概括的人类疾病的各个方面。与此相反,在雪貂的上呼吸道上皮细胞具有类似于人类细胞14α-2,6唾液酸连接。感染雪貂共享许多在人类疾病中观察到的病理和临床特征,包括人类和禽流感病毒14的致病性和透射性,15。它们也是高度适合于疫苗功效试验。然而,对于人类流感鼬模型有几个缺点,主要与它们的大小和饲养成本,使统计上显的收购具有挑战性着数据。此外,雪貂以前已经显示在药代动力学,生物利用度和毒性,使测试功效很难区别。例如,雪貂表现出毒性M2离子通道抑制剂金刚烷胺16。因此,很显然,在选择的动物模型来研究有关人类IAV感染的问题,必须考虑其固有的优点和局限性,并在主机病毒相互作用是受调查的方面是非常重要的。

斑马鱼, 斑马鱼是动物模型,提供了独特的机会,研究微生物感染,宿主免疫反应,和潜在的药物治疗17,18,19,20,21,22,23,<SUP类=“外部参照”> 24,25,26,27,28。 α-2,6-连接的唾液酸在斑马鱼细胞的表面上存在表明其易感性IAV,其在感染的研究证明了,用IAV 19的荧光报道菌株在体内成像。在IAV感染斑马鱼,抗病毒ifnphi1MXA转录物的表达增加表明先天免疫应答已经刺激,并通过IAV感染斑马鱼,包括水肿和组织破坏显示的病理,是类似于在人类流感感染观察。此外,IAV抗病毒药神经氨酸酶抑制剂扎那米韦有限死亡率和在斑马鱼19减少病毒复制。

在这份报告中,对于引发体系协议在斑马鱼胚胎IC IAV感染描述。使用扎那米韦临床相应剂量的作为证明的原则,对于抗病毒活性的化合物筛选斑马鱼这种IAV感染模型的效用是证明。此外,用于产生局部的,上皮IAV感染在斑马鱼的协议鱼鳔,被认为是在解剖学和功能上类似于哺乳动物的肺21,29,30,31之间一个器官,进行说明。使用这种局部IAV感染模型,中性粒细胞募集至感染部位可以跟踪,使调查中性粒细胞生物学在IAV感染和炎症中的作用。这些斑马鱼模型补充人类IAV感染的现有的动物模型,并且用于测试的小分子和由于增强了S的可能性免疫细胞应答特别有用tatistical功率,容量为中到高通量测定法,和能力来跟踪免疫细胞的行为和功能的光显微镜。

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Protocol

所有工作都应该使用生物安全2级(BSL2或)由美国疾病控制中心(CDC),并按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)制定的指令所描述的标准来执行。请有关官员商议,以确保安全和法规遵从。

1.斑马鱼保养与维护

  1. 斑马鱼产卵,并收集所需数量的胚胎实验。必要时,大规模繁殖罐,像那些由Adatto 等人描述 32,可用于收集大量的发育上演胚胎。
  2. 允许胚胎发展到在低密度深培养皿中所需的发育阶段(48小时受精后的全身IAV感染[第3或5天受精后的本地化,鱼鳔感染[第4])(<含6无菌鸡蛋水100胚胎/皿)在28°C0微克/毫升海盐( 例如 ,即时海洋)在蒸馏水。
    1. 用塑料吸管转移去除死胚胎和卵子变化,每天的水,以保证最佳的健康和发展。

2.材料和试剂的制备

  1. 制备4毫克/毫升的库存三卡因-S的蒸馏水和高压釜溶液(调节pH值至7.0-7.4)。保存在4℃。
  2. 用一个微量拉马长丝拉硼硅玻璃毛细管( 例如微管普勒使用以下设置:压力设定= 100,热量= 550,拉= [无值],速度= 130,时间= 110)。
    注意:在此之前修整所述针,从那里的针开始逐渐变细,以在针的末端的长度应约为12-15毫米。然而,这可能会有所不同,根据自己的偏好和应用。更长,更渐进的锥度可能因为刺破胚胎增加的能力和降低RI更佳针弯曲或断裂的SK。
  3. 消融2 g用微波在100毫升水蛋琼脂糖。使在其上排队并通过倾琼脂糖熔化成深培养皿中并使其固化注入胚胎板。
  4. 使扎那米韦的10毫克/毫升的库存在无核酸酶的水。分装,冷冻在-20℃。
  5. 利用微波使胚胎安装琼脂糖融化在50毫升水蛋0.5克琼脂糖。维持水浴在50℃下,直到准备成像期间使用。

3.全身感染IAV(48小时受精后)

注意:所有的研究人员应与上级和医生就在开始工作之前与IAV疫苗接种咨询。

  1. 手动dechorionate使用#5钳实验当天胚胎。小心取出,安乐死已经在200微克/毫升三卡因溶液的过程中受伤的胚胎。
  2. Ø准备˚FIAV显微注射
    注:株已被证明感染斑马鱼胚胎是流感A / PR / 8/34(H1N1)(APR8),甲型流感的X 31 A /爱知县/ 68(H3N2)(X-31),以及荧光记者流感病毒NS1-GFP 33。有关APR8和X-31和其他菌株的详细信息,可以在流感研究数据库中找到
    1. 传播IAV的NS1-GFP株鸡胚如前所述34,35。收集,分装和滴定含有IAV尿囊液,并储存在-80℃。预滴定APR8和X-31的病毒可以商业购买。
      1. 只是在感染前,迅速解冻的IAV等分在戴手套的手,然后迅速置于冰上减少滴度的损失。
    2. 病毒稀释
      1. 如果使用的是APR8或X-31病毒,稀释至3.3×10 6个蛋感染剂量50%(EID 50)/ ml,在无菌的,冰冷的PBS supplemented用0.25%酚红在层流罩(在可视化助剂)。同时建立包含无菌PBS,0.25%酚红控制。
      2. 如果使用NS1-GFP应变33,稀释至〜1.5×10 2噬菌斑形成单位(PFU)每NL在无菌的,冰冷的PBS含有0.25%酚红(在可视化助剂)在层流罩。同时建立含稀释就像在无菌PBS病毒与0.25%酚红未被感染的鸡蛋尿囊液控制。
      3. 维持IAV冰上待用。
    3. 吸取病毒解决方案为使用微加载提示,使用前显微注射针。插入注射针头插入注射装置( 例如 ,移动电话倡议-3-压喷射系统)的适当支架。
    4. 在观看立体显微镜下,轻轻一夹有棱,消毒#5镊子显微注射针头。
      注:这是recommenDED的显微注射针尖逐渐裁剪。
    5. 压低的压力喷射系统的脚踏板和注入显微镜浸油上的校准千分尺滑下降。测量液滴的直径。计算下降使用公式的体积,V = 4 /3πr3,其中V是体积在n1和r是在微米的半径。
      注意:如果放置直径太小,附加玻璃可以被裁剪或压力和时序设置可调节。如果下降直径太大,压力和时序设置可调节。
    6. 上的压力喷射器调节压力和时序设置和/或直至所需的注射体积达到(一般为1-3 NL)reclip针尖。 40和80毫秒之间的20和30 PSI和脉冲宽度设置之间的压力设置是典型的。调整回压,使其专柜毛细管压力,但不漏IAV(净零压力)。
  3. 对齐胚胎注射
    1. 在200微克/毫升三卡因麻醉dechorionated胚胎。
    2. 一旦运动停止,转移10-20胚胎至2%的琼脂糖平板(第2.3节中的方法制备)用塑料移液管。用塑料吸管以除去过量的液体。
    3. 轻轻对准胚胎与火抛光和密封的硼硅玻璃毛细管注射。使用立体显微镜,轻轻东方胚胎以便居维叶的管道或后部主静脉与所述注射针( 图1A)线。
  4. IAV显微注射
    1. 轻轻地插入注射针头插入居维叶管道或后主静脉。踩下脚踏注入IAV的所需体积进入胚胎( 图1A)的循环系统。胚胎如有必要,可注入的一个以上的时间。
      注意:注射小丸应该被扫成流通和DISTRIB整个身体的布式。如果注射体积收集在注射部位,从实验和安乐死移除胚胎。
    2. 重复注射在不同的胚胎具有特定病毒所选择的应变控制解决方案。对于APR8和X-31,使用3.2.2.1节描述的控制;为NS1-GFP,使用3.2.2.2节描述的控制。
  5. 胚胎转移到含有无菌恒温箱鸡蛋水和地方在33°C标记的培养皿。
    注:感染胚胎应在33℃下生长,以支持增强的病毒复制。另外,培养在33℃下更紧密地模仿人上呼吸道,这是在外部环境中的具有较低温度的紧密接触,并且在那里IAV感染发生的温度。胚胎可以适应于广泛的温度范围内34。

4.本地化,鱼鳔IAV感染的Tg(MPX:mCherry)

  1. IAV的制备显微注射
    1. 如第3.2节所述稀释NS1-GFP应变和控制注射液。
    2. 如在2.2节所述准备针。
    3. 对齐的Tg(MPX:mCherry)含有与以下异常3.3节所述膨胀鱼鳔35幼虫。以这样的方式使针可穿透鱼鳔和病毒可以存入鱼鳔的后部,如前所述36( 图2A)对齐幼虫。
  2. IAV显微注射
    1. 轻轻插入注射针头插入鱼鳔并朝向结构( 图2A)的后注入所需量( 例如 5 NL)。
      注:注射小丸应收集朝着后和鱼鳔的气泡应该bË向前移位。 GFP表达应该开始在3小时后注射待观察。
    2. 具体到病毒的选择,如3.4.2节中描述的应变控制解决方案,重复注射。
  3. 幼虫转移到含有无菌恒温箱鸡蛋和水发生在33°C的培养皿。

5.抗病毒治疗药物

注意:以下协议描述以前的Gabor 所示的扎那米韦治疗。 19。该协议可以被修改以筛选其它抗病毒药物,并具有进行修改,以筛选在96孔板,高通量格式多种化合物的潜力。

  1. 在3小时后感染,用含0,16.7,33.3纳克/毫升无菌扎那米韦鸡蛋水代替NS1-GFP-的鸡蛋水和控制感染的鱼。
    注意:这些浓度才能被选为试图复制FO达到的生理水平在人类患者中(100,200,或600毫克,四,每日两次或10mg吸入,每天两次)扎那米韦的llowing施用。在人类患者血清浓度范围为9.83至45.3纳克/毫升36。
  2. 在5天的过程中,改变蛋水每12小时,并用含有扎那米韦适量无菌蛋水替换。
  3. 追踪感染的课程。
    1. 在200微克/毫升三卡因麻醉斑马鱼。监测立体荧光显微镜,目视观察IAV感染和控制之间的鱼,而鱼浸泡在不同浓度的药物中的感染模式的差异GFP表达。
    2. 跟踪发病率和死亡率在5天的过程中。
      1. 有关与疾病的病理感染的动态,包括嗜睡的症状和水肿的证据,色素沉着的差异,眼和颅面畸形,以及前凸记录观察结果。疾病的病理通常在24-48小时后喷射成为控制感染鱼显而易见,这取决于病毒的注入量。采集图像后24小时注射。
      2. 5天感染后每隔24小时,记录死亡,病态和健康幼虫的数目。死亡是由缺乏明显的心跳的定义。根据需要绘制的数据。例如,绘图数据作为堆积条形图,用健康,病态,或死鱼百分比在y轴和治疗组在x轴上。 19
        注:死亡可能由Kaplan-Meier生存估计值进行评分。根据应用,也可适当开发用于评分鱼发病的各种途径,包括可能量化基于所观察到的上述病理特征的程度的发病率的评分矩阵。
      3. 与统计学家咨询,以申请相应的统计分析。

6。中性粒细胞迁移

注:下面的协议描述用于跟踪中性粒细胞迁移到鱼鳔以下本地化,上皮IAV感染的方法。描述的方法可以被修改,以测试遗传和化学处理的效果。使用这种技术,将有可能在IAV感染期间表征底层嗜中性粒细胞的行为的机制。

  1. 安装斑马鱼成像
    1. 麻醉幼虫在200微克/毫升三卡因进行成像。
    2. 鸡蛋中的水(〜50-100微升)的一小滴已经感染了NS1-GFP到24的好啦幼虫,玻璃底板传送单个的Tg(MPX mCherry)。与其他IAV感染和控制鱼重复。
    3. 慢慢的1%琼脂糖胚胎的安装介质添加到每口井(2.5节),注意不要引入大泡。
      1. 这样它被安装在其一侧轻轻调整幼虫的位置。古迪和亨利37描述如何使使用被安装成与长丝硼硅玻璃毛细管和代替强力胶水粘上昆虫针在本申请中运作良好探针。
    4. 一旦琼脂糖变硬,轻轻地用含有200微克/毫升三卡因鸡蛋水填满个别井。
    5. 用共聚焦显微镜,拍摄AZ系列堆栈使用20倍的目标明和荧光图像的集中在鱼鳔。
      1. 使得它们捕获所有明显可观察到的绿色和红色荧光设置上限和下限。
      2. 在2.0微秒/像素的拍摄图像与那些≤4微米的步骤。增加时间每像素和还原步骤之间的距离( 例如 ,0.5 - 1.0微米)增加图像的分辨率和质量。
      3. 产生通过合并的层的二维图像。
      4. 比较MPX-mCherry阳性嗜中性粒细胞目前我的数ñIAV感染和控制注入​​斑马鱼的鱼鳔。

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Representative Results

这里,提供了示出如何全身IAV感染在斑马鱼可用于测试药物功效( 图1A)的数据。在48小时后的受精胚胎经由居维叶的导管与APR8( 图1C,1F)中,X-31( 图1D,1G),或NS1-GFP( 图1 H-1I)注入以引发病毒感染。在48小时后的受精胚胎另一个队列注射,作为病毒感染( 图1B,1E)控制。通过48小时后感染,斑马鱼注射IAV展出心包水肿( 图1C,1D),并停循环( 图1F),与存在于整个心包( 图1G)红细胞的证据。用NS1-GFP,早观察3小时后感染荧光显微镜的GFP的初始表达。在这一点上,斑马鱼暴露于33.3纳克/毫升剂量的神经氨酸酶抑制剂扎那米韦。该剂量大约相当于给予人类患者的200毫克的剂量。不暴露于扎那米韦( 图1H,1H“)控制感染的鱼表现出水肿及全身GFP表达的功能。暴露于扎那米韦NS1-GFP感染的幼虫减少大体病理和GFP荧光( 图1I,1I')进行观察。在GFP中的减少是最显着的幼虫的机构,而在卵黄囊中观察到非常少的变化。与扎那米韦治疗的鱼都呈现出发病较少,通过改进游泳运动证明,并在心脏减少水肿的水平,提高生存率。这些发现补充更全面的研究19表明,该模型用于药物筛选的价值。

本地化斑马鱼的鱼鳔感染模型31已经被改编为IAV INFEction。 NS1-GFP病毒注射到5天受精后的Tg(MPX:mCherry)的鱼鳔幼虫以启动局部,上皮感染( 图2A)。将PBS注射到鱼鳔作为对照来证明中性粒细胞募集的朝向IAV感染的细胞的特异性。 mCherry-标记嗜中性粒细胞进入鳔招募了跟踪。在20小时后感染,嗜中性粒细胞进入鱼相对IAV感染的鱼鳔对于PBS注射的对照组相当迁移( 图2B,2B',2C,2C')进行了观察。这些数据表明,IAV可以招募嗜中性粒细胞的鱼鳔,就像募集中性粒细胞人体肺部。

图1
图1:抗病毒的药物治疗减轻IAV感染的斑马鱼的严重程度。 (A (B - I)大体病理和注入居维叶管道与IAV斑马鱼胚胎的绿色荧光。 (BG)鱼感染IAV并在48小时后感染检查病毒感染和疾病的征兆。 (B - D)控制或IAV感染的鱼单焦平面收集(侧置,左前,背顶,放大4倍,比例尺= 500微米)。 (B)的控制鱼用PBS注射并显示正常的形态。 (C - D)胚胎感染APR8(C)X-31(D)普遍表现出心包水肿(实心箭头)。胚胎也有坏死组织,(C)中明显的。 ( )控制鱼被注射PBS,并显示没有病理证据(比例尺= 250微米)。感染APR8(F)显示胚胎停循环(缺口箭头,比例尺= 250微米)。 (G)胚胎注射使用X-31流感同时显示心包水肿(箭头)和红细胞汇集整个心包(箭头缺口,比例尺= 100微米)。 (H,I)显示在IAV感染的斑马鱼(比例尺= 200微米)的抗病毒药物的作用代表性的图像。 (H)的明场和(H')表示与NS1-GFP(没有抗病毒药物治疗)注入的胚胎的荧光图像。注意水肿和GFP表达特别是在共同主静脉区域。 (I,I')治疗一种抗病毒药物减少侵染离子,就证明减少病理,包括减少水肿,并降低GFP表达本体的白色虚线轮廓内,特别是在血管,这是指示降低病毒负荷。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:中性粒细胞招募到本地化IAV感染部位。 )示意图展示发起局部感染IAV在5天受精后充气斑马鱼的鱼鳔所需要的注射方法。 (B,C),中性粒细胞募集到以下NS1-GFP感染鱼鳔。 Z堆栈图像(4微米的步骤)由共聚焦显微镜(放大20倍)收集。图片持平tened分为两个维度(侧置,左前,背顶部)。 的Tg(MPX:mCherry)斑马鱼(5天受精后)与(B,B')尿囊液用PBS和0.25%酚红或(C,C稀释')NS1-GFP注射(7.2×10 2 PFU /胚胎)的尿囊液和PBS中稀释0.25%酚红。在16小时后感染,中性粒细胞是存在于IAV感染的鱼鳔(C,C':绿色荧光显示局部感染; C':红细胞有嗜中性粒细胞,白色箭头标识代表中性粒细胞)。 (B,B')表示IAV感染的GFP表达的证据,也没有招募嗜中性粒细胞的鱼鳔在用PBS中的尿囊液中喷射出的幼虫观察。 PLEASE点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

为了最大限度地使用小动物到人类宿主 - 病原体相互作用的模型获得的利益,框架研究问题,并在测试假说,关于模型系统的固有优势利用是很重要的。作为人类IAV感染模型,斑马鱼有几个优势,包括高繁殖力,光学清晰度,顺从于药物筛选,以及该标签的免疫细胞嗜中性粒细胞一样的转基因株系的可用性。斑马鱼已经发展成为日益强大的替代鼠标模型系统的炎症和先天免疫方面的研究。因为他们缺乏在第4-6周发展的功能适应性免疫应答,安装斑马鱼先天免疫反应,以防止损伤和感染37。期间在发展的早期期间,有可能分离并研究从单独的先天免疫反应所产生的抗病毒反应的机制。氏,其中标签中性粒细胞红色荧光蛋白作品已经通过转基因斑马鱼线一样的Tg(MPX mCherry)的开发提供便利。

对于IAV感染斑马鱼模型类似于人类疾病最近被描述19。据证实,斑马鱼具有在其细胞提供IAV病毒的嗜性结合,附加和进入细胞α-2,6-连接的唾液酸残基。在这个手稿和的Gabor 等。 19,它已经显示,IAV两种不同株(A / PR / 8/34 [H1N1]和X-31的A /爱知/ 68 [H3N2]),以及其导致GFP的重组NS1-GFP应变翻译在感染的细胞中,当注入幼虫斑马鱼的循环系统可以感染,复制和原因的死亡率。病毒注射是这种感染的方法至关重要,因为通过浸曝光IAV不能可靠地工作。感染的鱼应该是转移红到33℃培养箱,以确保病毒复制。值得注意的是,人类的呼吸道,其中流感感染发生,通常是33℃,是重要的。温育在28℃,这对于斑马鱼孵化更典型的温度,不能产生一个可靠的感染。此外,重要的是,以测试在实验中使用,由于变性,影响在斑马鱼感染性和疾病进展之前从制造商或批次IAV接收每批生产。当感染剂量正确滴定,感染IAV的这些菌株绝大多数斑马鱼应表现出水肿为代表的毛病的表型,早24小时感染后,即逐步恶化,通过48小时后感染颅面畸形,前凸由72小时后感染,约50%应屈服于感染5天感染后。组织病理学在48小时后感染应包括鳃的证据,头肾和肝坏死,以及在心包流体的指示。在建立这些发现为IAV感染在斑马鱼的可预测的结果,这是可能的画面候补的抗流感药物化合物的候选者。考虑到这一点,验证的原则协议筛选基础上的Gabor 等人发现原来的抗病毒药物 19证明。使用神经氨酸酶抑制剂扎那米韦,在被预测以模仿在人体血液中观察到的水平,发病的延迟发作,并通过对病毒复制/扩展表观效果降低死亡率,如通过NS1-GFP荧光确定的剂量,进行了观察。斑马鱼模型IAV非常适合中到高通量小分子屏幕。因为感染只能仅发生通过人工注射到经由居维叶或后主静脉的导管流通时,屏幕的尺寸是由技术员ESTAB数的限制利升的感染及其在执行技术熟练。尽管如此,有可能注入每小时每技术员至少200斑马鱼的胚胎。而成功地展示在斑马鱼感染模型为扎那米韦的抗病毒活性,必须承认,在所有的动物模型,包括斑马鱼,药物筛选必须小心控制38。药物被吸收和代谢的方式不同于动物到动物,并且是难以预料的。然而,作为筛选新的抗流感药物的方法,这种斑马鱼IAV感染模型提供了一个令人兴奋的机会,以调查成千上万的小分子与同源器官对人体和高度保守的综合生理学的动物。

除了作为用于全身感染模型中,斑马鱼也可以作为局部感染模型时IAV注入鱼鳔19 21,29,30,31的功能类似物。当正确滴定,被感染了NS1-GFP应变5天受精后斑马鱼应在1天感染后表现出周围的鳔的上皮点状荧光的证据。使用这种局部感染策略,响应于感染中性粒细胞的行为能够被跟踪。如同人类的中性粒细胞,中性粒细胞斑马鱼是先天免疫主要细胞调解员,在慢性炎症24在急性反应,组织损伤和感染和打关键作用运作。人们越来越认识到,在中性粒细胞流感感染的免疫反应中发挥至关重要的作用。实际上,显而易见的是嗜中性粒细胞的功能介导的免疫应答“双刃剑”。 WHI勒到必要控制流感感染的抗病毒反应必不可少的,嗜中性粒细胞也有助于在肺,可以破坏宿主组织和增加死亡率39,40,41,42,43的风险过度炎性环境。有相当大的节约斑马鱼和人基因组之间基因同线性的,以及与此直向,也有在嗜中性粒细胞生物学显著功能保守。斑马鱼的中性粒细胞承受许多相似之处人类嗜中性粒细胞,包括一个多态型核,初级和次级颗粒的存在下,和功能性髓过氧化物酶和NADPH氧化酶22。此外,斑马鱼嗜中性粒细胞可以吞噬细菌和中性粒细胞释放细胞外陷阱(英语教师)44。几个转基因斑马鱼线已ðeveloped以帮助识别和剖析中性粒细胞生物学27,45,46,47的功能。这种感染协议是柔性的,并且可以进行修改,以测试使用这些替代工具多种嗜中性粒细胞的功能。这种局部斑马鱼IAV感染模型使相关的宿主免疫应答要解决的问题,特别是那些由嗜中性粒细胞介导的。

已在哺乳动物模型的物种进行的研究取得了涉及IAV感染^ h有价值的信息,40,48,49,50,51,52,53,54,55,但很少实时实验AVE被执行时,限制在宿主脊椎动物先天免疫应答的组成部分之间的复杂的相互作用的理解。在过去的十年,使用斑马鱼的动物模型系统中已取得的有关资料宿主-病原体相互作用21,47,56,57的分水岭,并且还提供了用于药物开发的工具的重要信息。分子生物学技术和显微成像技术的结合已允许更好地了解先天免疫反应以及如何在体内 17,18,27表现。斑马鱼的发现可以用IAV 19被感染,而斑马鱼股哺乳动物系统,包括人类免疫重要的相似之处,已经敞开了大门研究一个重要的人类病毒病原体。所描述的协议适用于其他应用程序,并有产生有关,可能对人体健康深远的影响临床主机 - 病毒相互作用的关键发现的潜力。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

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References

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