경유 곰팡이에 의한 신속한 결실 생산

Genetics

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Summary

상 동성 재조합을 통해 생성 된 유전자 결실 돌연변이는 유전자 기능 연구의 황금 표준이다. 결실 구조물의 신속한 생성을위한 OSCAR (Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids의 One Step Construction) 방법이 기술되어있다. 아그로 박테 리움 매개 곰팡이 형질 전환이 이어진다. 마지막으로, 곰팡이 형질 전환 체에서 PCR을 이용한 유전자 결실 확인 방법을 제시한다.

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Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

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Abstract

게놈의 나머지 부분을 그대로두고 관심있는 유전자를 정확하게 삭제하면 살아있는 유기체에서 특정 유전자의 기능을 결정하는 이상적인 제품을 제공합니다. 이 프로토콜에서 정확하고 신속한 삭제 플라스미드 구성의 OSCAR 방법이 설명됩니다. OSCAR는 관심 유전자의 정제 PCR 증폭 5 '및 3'측면과 두 개의 플라스미드, pA-Hyg OSCAR (마커 벡터) 및 pOSCAR (조립체)를 포함하는 단일 재조합 효소 반응이 수행되는 클로닝 시스템에 의존한다 벡터). 올바르게 조립 된 결실 벡터의 확인은 제한 효소지도 작성과 시퀀싱에 의해 수행됩니다. Agrobacterium tumefaciens 는 곰팡이 포자 (ATMT)에 결실 구조의 도입을 매개하는데 사용된다. 마지막으로, PCR 분석은 상 동성 또는 비 상 동성 재조합에 의해 결실 된 결실 구조가 유전자 결실을 나타내는 지 또는이소성 통합. 이 접근법은 Verticillium dahliaeFusarium verticillioides 에서 수많은 종의 유전자를 삭제하는데 성공적으로 사용되었습니다.

Introduction

유전 적 해부는 개인 또는 유전자 조합의 기능적 중요성을 결정하는 강력한 방법입니다. 특정 유전자의 역할을 이해하기위한 표준 접근법은 다른 유전자에서 변경되지 않은 단일 유전자 돌연변이의 생산이다. 가장 강력하고 최소한의 혼란을주는 접근법은 다른 유전자 기능에 손상을주지 않으면 서 관심 유전자의 오픈 리딩 프레임 (GOI ORF) 유전자를 완전하고 정확하게 삭제하는 것입니다.

삭제 플라스미드 생성을위한 표준 라이 게이션 접근법은 여러 단계가 필요하기 때문에 OSCAR 1 에 대한 합리적인 방법은보다 신속한 시험 관내 접근법을 생산하는 것이 었습니다. 그림 1 은 OSCAR 방식의 어셈블리 프로세스를 보여줍니다. 여기에 설명 된 방법은 이후의 Agrobacterium tumefaciens 매개 transfo와 결합하여 단일 multipart 반응에서 개별 유전자 삭제 벡터의 빠른 건설을 결합의 장점이 있습니다(ATMT). OSCAR는 매우 신속하며 효모 2 에서 Gibson assembly 사용과 같은 다른 전략과 잘 비교됩니다. OSCAR 방법은 여러 종류의 진균류와 함께 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 종은 다음을 포함한다 : Fusarium verticillioides (미공개), Verticillium dahliae 3 , Setospaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 및 Dothistroma septosporum 9Sarocladium zeae (미공개) .

이 프로토콜은 프라이머 디자인, 플랭크 PCR 증폭, OSCAR BP 반응, 결실 구조 구조 확인, 변형을 포함한 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다이온으로 구성 하고, 결실 구조를 곰팡이 세포로 ATMT에 옮기고, 최종적으로 균류 결실 돌연변이를 돌연변이 적으로 결실 된 결실 구조물과 차별화시킨다.

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Protocol

1. 유전자 측면의 PCR 증폭을위한 프라이머 디자인

  1. 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 FungiDB 또는 기타 게놈 데이터 자원의 양 측면에있는 유전자 2K 이상을 포함하여 관심 유전자 (GOI)의 게놈 영역을 워드 프로세싱 파일로 다운로드합니다.
  2. 삭제하고자하는 ORF를 강조 표시하고 코돈을 시작 및 중지합니다.
  3. 다운로드 된 시퀀스 내에서 인접한 ORF를 식별하고 강조 표시하십시오.
  4. GOI ORF의 2 kb 5 '말단과 프라이머 디자인 도구 (Materials List 참조)를 사용하여 PCR 프라이머 쌍 O1과 O2를 설계하여 1 kb의 최소 크기의 생성물을 생성하십시오. 인접한 ORF에 영향을 미치지 않도록주의하십시오.
    1. 2 kb 5 '측면을 Sequence Entry 창에 붙여 넣습니다. "Show Custom Parameters"상자를 클릭하십시오. 다음 맞춤 설계 매개 변수를 입력하십시오 : primer TM 58 (min), 60 (opt) and 62 (max); 프라이머 GC 40 (min), 50 (opt) 및 60 (max); 프라이머 크기 22 (분), 24 (선택) 및 26(최대); Amplicon 크기 1250 (분), 1500 (선택) 및 2000 (최대).
    2. ORF에 가장 가까운 역방향 프라이머 (O2)를 배치하는 결과를 선택하십시오. assays의 스크린 샷을 캡처하고 프라이머 시퀀스를 복사하여 워드 프로세싱 문서에 붙여 넣습니다.
    3. 프라이머 O3와 O4를 생성하기 위해 3 '플랭크에 대해이 과정을 반복한다. 이번에는 타겟 ORF에 가장 가까운 포워드 프라이머 (O3)를 배치 한 결과를 선택한다.
  5. 프라이머 1 ~ 4의 5 '말단에 적절한 부착 사이트를 추가하십시오 ( 표 1 참조).
  6. 또한 아래 4 절에서 삭제 확인을 위해 ORF 특정 프라이머를 설계하고 주문하십시오. 필요한 경우 Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) 및 1000 (max)의 ORF 길이 조정을 제외한 매개 변수는 1.4.1 단계와 동일해야합니다. 마지막으로 상 동성 재조합 체를 확인하기 위해 염색체 내의 5 '및 3'바깥쪽에 프라이머를 생성한다. 이 "out"프라이머는hygR (210) 및 hygF (850)에 의해 억제되었다 ( 도 2 ).
  7. 프라이머 주문.

2. OSCAR 구축물 제작

  1. Hi-fidelity Taq을 사용하여 한 반응에서 프라이머 (100 μM) O1과 O2를 사용하고 두 번째 반응에서는 프라이머 O3와 O4를 사용하여 5 '와 3'측면 각각에 대해 두 개의 반응을 수행하십시오. 반응 혼합물은 29.5 μL 멸균 증류수 (SDW), 5 μL 10X LA PCR 버퍼, 8 μL 2.5 MM dNTP 믹스, 5 μL 25 MM MgCl 2 , 1 μL 템플릿 (50 NG / μL), 0.5 μL 하이 - 충실도 Taq , 0.5 μL Primer O1 및 5 '측면 (0.5 μL Primer O3 및 0.5 μL 3'측면에 대한 Primer O4)에 대한 0.5 μL Primer O2 사용 조건은 다음과 같습니다 : 94 ° C에서 1 분, 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 60 ℃, 2 분 동안 72 ℃에서, 마지막 단계는 72 ℃에서 5 분간 그리고 나서 10 ℃에서 무기한 유지.
  2. 0.8 % 뛰기제품 크기 및 상대 농도를 결정하기 위해 표준 미니 겔 장치에서 약 125Vh 동안 아가로 오스 1x TAE (40mM 트리스 아세테이트 pH 8.3, 1mM EDTA) 겔 전기 영동을 수행 하였다. 게시물은 제조 업체의 지침에 따라 비 ethidium 얼룩으로 젤을 얼룩. UV 조명기로 시각화하십시오.
  3. 5 '와 3'측면 제품이 대략 균등 농도 인 경우, 이들을 조합하고 친 화성 칼럼 키트 (또는 PEG 침전물 90 μL 결합 PCR 제품, 240 μL TE 완충액 pH 7.5, 160 μL 30 % 폴리에틸렌 글리콜 PEG8000 30 mM MgCl 2 ) PCR 산물을 제조자의 프로토콜에 따라 동시 정제한다. 이들이 동등한 농도가 아닌 경우, 저농도 생성물 모두를 고 수율 반응으로부터 산출 된 동등한 양의 산물과 결합시킨다.
  4. 분광 광도계를 사용하여 정제 된 DNA 농도를 측정하십시오.
  5. 다음을 혼합하여 BP 반응을 수행하십시오 : 1 μL의 60 ng / μL pOSCAR, 2 μL의 60 ng /μL pA-Hyg-OSCAR, 1 nL / 60 ng / μL 조합 측면, 1 μL의 clonase. 25 ° C에서 16 시간 동안 품어 낸다. 0.5 μL proteinase K를 첨가하고 37 ℃에서 10 분 동안 항온 처리하여 반응을 종결시킨다.
  6. 높은 역량을 개편 E. 대장균 . 상업적으로 이용 가능한 적격 세포와 집에서 만든 DH5α CaCl2 적격 세포 모두를 제조자의 지시에 따라 수령자로서 성공적으로 사용 하였다. 100 μg / mL spectinomycin (스펙)을 포함하는 낮은 나트륨 (0.5 g / L NaCl) LB 플레이트.
  7. 위에 생성 된 식민지의 DNA minipreps 10 을 수행하여 올바른 구조를 식별합니다. 다음과 같이 Hin dIII와 Kpn I로 이중 분해를 수행하십시오. 피펫 5 μL DNA, 2 U의 각 효소, 2 μL 적절한 10x 완충액 (SDW 포함)으로 20 μL 총 부피. 이것은 벡터 ( 7kb)로부터 인서트 (1.5kb 유전자 옆구리를 갖는 대략 4.5kb)를 방출하고예측 가능한 밴드 크기를 줄 수있는 측면.
  8. 서열 11 은 적절한 줄무늬 패턴을 나타내는 클론을 선택한다.

3. 진균의 Agrobacterium tumefaciens 매개 변형 (ATMT)

  1. OSCAR 결실 구조로 Agrobacterium tumefaciens AGL1 균주를 형질 전환 12 .
  2. GOI OSCAR 결실 플라스미드를 함유하는 AGL1로 곰팡이를 형질 전환시킨다. 이렇게하려면 다음 단계를 수행하십시오.
    1. 2 x 10 6 포자 / mL의 멸균 수로 곰팡이 포자 현탁액을 준비하십시오. hemocytometer 또는 자동 셀 카운터에서 포자를 정량. 1.5 ML microcentrifuge 튜브 에이 500 μL를 놓으십시오. 이 셋업은 4 개의 변형 플레이트 용입니다.
    2. 2 일 2-3 일 오래된 LB - 사양 100 매체에서 AGL1을 포함하는 삭제 플라스미드의 쉽게 보이는 gob (루프 직경의 약 20 %를 커버한다)을 추가하려면 푸른 살균 일회용 루프를 사용하십시오 (Materials List for composition) 플레이트를 포함하고 포자 현탁액에 혼합합니다. 박테리아 세포가 잘 분산 될 때까지 와동 ( 5 분 중간 속도).
    3. 분양 배지가 들어있는 4 개의 6cm 페트리 접시에 셀룰로오스 멤브레인 필터의 중심에 분주 - 아크로 서스펜션 100μL를 피펫으로 넣는다.
    4. 멤브레인 필터의 전체 표면을 덮기 위해 멸균 유리 비드 (약 4)로 현탁액을 퍼지십시오. 또는 기존 스프레더 도구를 사용하여 서스펜션을 펼칩니다. 멤브레인 필터를 약 10 분 동안 두건에서 건조시키고 파라핀 필름으로 감 쌉니다. 3.2.2 및 3.2.3 단계를 반복하여 여러 변형을 설정합니다.
    5. 접시를 상온에서 2 일 동안 품어 둔다.
    6. 하이 그로 마이신 B (Hyg) 150 μg / ML, 200 MM cefotaxime 및 100 μg / ML을 포함하는 6 cm Aspergillus 선택 매체 12 접시에 멤브레인 필터를 전송뜸 락탐. Hyg 내성 콜로니를 분리하기 전에 5-7 일 동안 상온에서 인큐베이션하십시오.
    7. 멸균 이쑤시개로 150 μg / mL Hyg, 100 μg / mL kanamycin이 들어있는 6 cm Potato Dextrose Agar (PDA) 플레이트에 추정 형질 전환 체를 옮깁니다.

4. PCR에 의한 결실 돌연변이 확인

  1. 열 분해로 형질 전환 체로부터 PCR 용 DNA를 추출한다.
    1. 형질 전환 체가 3.2.7 단계에서 PDA에 콜로니를 형성하면 멸균 된 이쑤시게를 사용하여 소량 (2mm x 2mm)의 균사체 또는 효모 세포를 식민지에서 100μL의 용해 용액 (50mM 인산 나트륨, pH 7.4, 1mM EDTA, 5 % 글리세롤)을 첨가 하였다.
    2. 85-90 ° C에서 20-30 분 동안 혼합물을 품는다. 단계 4.2에서 사용까지 -20 ° C에서 게놈 DNA를 포함하는 조잡한 추출물을 저장하십시오.
  2. 형질 전환 체 당 4 개의 PCR 반응 수행선택 가능한 마커 (이 경우 하이 그로 마이신 포스 포 트랜스퍼 라제) 및 GOI ORF에 대해 각각 5 '및 3'측면의 상 동성 재조합을 검출한다.
    참고 : 우리는 일반적으로 이러한 반응에 대해 저렴한 충실도의 Taq 를 사용합니다. 반응 조건은 상기 2.1 단계에서 설명한 바와 같으며 SDW 20 μL, 10x Taq buffer 2.5 μL, dNTPS (10 mM) 0.5 μL, 수제 Taq 14 , 0.5 μL, Primer A (100 μM) 0.5 μL, Primer B ) 0.5 μL, 템플릿 0.5 μL. 농도가 더 낮은 프라이머 스톡 (10 μM)도 똑같이 사용할 수 있습니다.
  3. PCR 제품의 아가 로즈 젤 ( 예 : 0.8 %)을 실행하십시오. 삭제 돌연변이 체는 Hyg 밴드를 생성하지만 ORF 생성물은 생성하지 않습니다. 이소 트로픽 적분기는 두 가지 밴드 모두를 보여줄 것입니다. 와일드 타입은 ORF 밴드 만 생성합니다.
  4. 차후의 사용을 위해 결실 돌연변이 체 (및 대조를위한 이소성 형질 전환 체 또는 2 개)를 영구 보존한다.
    참고 : 15 % 글리세롤은-80 ° C에서 장기적으로 우리의 변종을 찢어 냈습니다.

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Representative Results

단일 반응에서 OSCAR 방법은 선별 마커 카세트를 둘러싼 삭제 대상 유전자의 플랭크를 포함하는 플라스미드를 생성한다. OSCAR을 사용하여 삭제 구문을 생성하는 것은 매우 효율적입니다. 그러나 시스템은 세 가지 단편 (두 개의 유전자 측면과 선별 마커)이 아닌 일부를 포함하는 부분 구조를 생성 할 수 있습니다. 일반적으로 대부분의 대장균 형질 전환 체는 정확한 OSCAR 구조를 포함하고있다. 예를 들어, 그림 2Verticillium dahliae 유전자 VDAG_06812에 대한 OSCAR 결실 구조를 묘사합니다. 이 경우 VDAG_06812의 측면에는 HindIII 또는 KpnI 부위가 없으므로 4,247 bp의 플라스미드 삽입물이 방출되어야합니다. 그림 3 은 비정상적인 구조를 나타내는 레인 5와 11을 제외한 정확한 플라스미드 구조의 HindIII- Kpn I 제한 효소 이중 분해 확인을 보여준다ts. 그림 4 는 Southern blot에 의한 두 가지 다른 유전자 결실의 최종 확인을 보여줍니다. 그림 5 는 Southern blot에 대한 대안으로 결정적인 PCR 접근법을 보여줍니다.

그림 2
그림 1 : OSCAR 삭제 건설 반응. OSCAR 결실 건설 과정은 5 '및 3'유전자 측면의 별도 PCR 증폭, 결합 된 정제 측면 제품 및 이원 및 선택 마커 플라스미드와의 BP 클로나 아제 반응을 포함한다. B1r, B2r, B3, B4, P1r, P2r, P3, P4, R1, R2, L3 및 L4는 λ 재조합 위치를 나타낸다. 참고 문헌 1의 허가를 받아 다시 인쇄하십시오.

그림 2
그림 2 : OSCAR 삭제 구문 em> Verticillium dahliae 유전자 VDAG_06812. 올바른 deletion construct 구조를 확인하기위한 restriction enzyme recognition 및 primer annealing site의 위치를 ​​보여줍니다. 참고 문헌 1의 허가를 받아 다시 인쇄하십시오.

그림 3
그림 3 : Kpn I 및 Hin dIII로 VDAG_06812의 삭제 구조 구조의 제한 소화 확인 . 플라스미드를 이중 분해하고 0.8 % 아가 로스 겔에서 겔 전기 영동으로 분석 하였다. 올바른 구조는 약 6.9 kb와 4.2 kb의 두 개의 밴드를 생성하는데, 이진 벡터 백본과 표적 유전자 측면에 융합 된 HygR 마커를 각각 나타낸다. 참고 문헌 1의 허가를 받아 다시 인쇄하십시오.

ontent "fo : keep-together.within-page ="1 "> 그림 4
도 4 : OSCAR 결실 구조물을 사용하여 V. 달리아의 VDAG_02161 및 VDAG_09930의 결실을 확인하는 서던 블롯 하이브리드 화. 게놈 DNA를 BclI로 분해 하였다. 그 후 VDAG_02161 및 VDAG_09930 ORF 프로브와 동시에 프로브 하였다. 하이브리드 화 밴드는 VDAG_02161 및 VDAG_09930의 야생형 대립 형질에 대해 각각 2,757 bp 및 1,426 bp입니다. 샘플은 다음과 같다 : 레인 1 : 야생형 균주 VdLs.17; 레인 2 : 결실 돌연변이 균주 02161.1; 레인 3 : 결실 돌연변이 균주 02161.3; 레인 4 : 이소성 형질 전환 균주 Ect 02161.2; 레인 5 : 결실 돌연변이 균주 09930.3; 레인 6 : 결실 돌연변이 균주 09930.10; 레인 7 : 이소성 형질 전환 균주 Ect 09930.4. 허가를 받아 재 인쇄하십시오. 참조 1 .


그림 5 : PCR에 의한 결실 돌연변이 확인. 유전자 FVEG_13253에 대한 결실 및 이소성 후사 리움 verticillioides 형질 전환 체의 분석 레인 1 상단 및 하단, 마커; 레인 2-6 상부 겔 형질 전환 체 PCR 5 '단편 증폭; 레인 7-11 상부 겔 ORF 증폭; 레인 2-6 하단 겔 Hyg 유전자 증폭; 레인 7-11 하단 겔 3 '조각 증폭. 샘플은 결실 균주 11/31 (레인 2 및 7), 11/32 (레인 3 및 8), 11/33 (레인 4 및 9) 및 이소성 형질 전환 체 11/34 (레인 5 및 10) 및 11 / 35 (레인 6 및 11).

뇌관 용도 순서
프라이머 O1- (attB2r) 5 '측면의 증폭,프라이머 전방 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA
프라이머 O2- (attB1r) 5 '측면, 프라이머 역전사 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT
프라이머 O3- (attB4) 3 '측면 증폭, 프라이머 전방 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT
프라이머 O4- (attB3) 3 '측면의 증폭, 프라이머 역전 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT

표 1 : 유전자 특이 적 프라이머 서열에 특정 OSCAR 프라이머 5 '확장이 추가됨.

뇌관 용도 순서
OSC-F 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT
OSC-R OSCAR 역 시퀀싱 프라이머, 5 '측면의 안티센스 가닥 배열 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT
HygR (210) 역 시퀀싱 프라이머, 5 '측면의 안티센스 가닥 배열 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA
HygF (850) 순방향 시퀀싱 프라이머, 3 '측면의 서열 센스 가닥 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG
새로운 Hyg Marker Forward 하이 그로 마이신 내성 유전자를 대조군 (아래의 New Hyg Marker Reverse primer와 함께)으로 증폭시키기 위해, 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA
새로운 Hyg Marker Reverse 하이 그로 마이신 내성 유전자를 대조군으로서 증폭하기 위해 (위의 새로운 Hyg 마커 포워드 프라이머와 함께)) 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG

표 2 : OSCAR 결실 구조 분석 용 프라이머.

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Discussion

Agrobacterium의 한 단계 건설 - 재조합 준비 - 플라스미드 (OSCAR)는 지속적으로 증가하는 자낭 균 (Ascomycota) 균류에 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 Basidiomycota 및 Agrobacterium 매개 형질 전환 및 상동 재조합이 가능하다고 가정하고 다른 진균 성 phyla의 종 (선택 마커 유전자를 유도하는 적절한 프로모터와 함께)에도 쉽게 적용 할 수 있어야한다. 항 곰팡이 화합물의 선택을 다양 화하고 이중 및 고차 돌연변이 체의 생성을 허용하기 위해 추가 마커 벡터가 생성되었습니다. 여기에는 G418, nourseothricin 및 최근에 제초제 인 glufosinate 암모늄과 chlorimuron ethyl 4 에 대한 내성이 포함됩니다.

이 방법은 여기에 제시된 이미지가 주로 파생 된 Verticillium dahliae 와 함께 사용하기 위해 만들어졌습니다. 최근에는 OSCAR가 삭제를 위해 광범위하게 사용되었습니다mycotoxigenic 균류 Fusarium verticillioides 에서 유전자의 60 개가 넘는 결실 구조가 만들어졌으며 30 개 이상의 유전자에 대한 결실 돌연변이가 생성 (미공개)되었습니다.

현재의 반복 과정에서 확인 된 결실 돌연변이 체를 확보하는 데 약 4-6 주가 소요됩니다. 다음은 주요 OSCAR 단계와이를 수행하는 데 필요한 대략적인 시간을 요약 한 것입니다. 1) 게놈 데이터 (5 일), 측면 증폭 및 복제, (2 일)에 기반한 OSCAR 프라이머의 설계 및 조달, 3) (4 주), 5) Fusarium verticillioides 에서 ATMT에 의한 형질 전환 체의 생산 및 성장 (2 주, 이것은 성장 속도에 의존 함을 주목한다. 형질 전환 유전자형 (2 일)의 열 분해 및 PCR 결정, 6) 단일 포자, 유전자형 확인 및 저장 (1-2 주).

15 를 통해 입수 할 수 있습니다. pA-Bar-OSCAR 및 pA-Sur-OSCAR와 같은 다른 OSCAR 마커 플라스미드는 저자 5 로부터 입수 할 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

저자는 Fusarium verticillioiodes 에서 OSCAR 돌연변이 생성을위한 학부 및 고등학생에게 Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli ​​Crepsac, Jeff Delong, 크리스 킹, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (빅토리아) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , 크리스 벤슨, 루니 스토크 스, 한나 이텔, 제인 헐스, 자시 모하메드, 제임스 로긴스, 켈리 러셀, 그레 니 샤 존스, 크리스틴 셰퍼, 마리암 함머디, 에이브 윌슨, 카트리나 바스 모어, 토니 하퍼, 카린 맥기, 모흐메 모민, Thi Ngoc Le와 Angel Pham.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxime TCI America C2224
Kanamycin 11815032
Moxalactam Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR

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References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48, (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7, (7), (2011).
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