Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Homolog rekombinasyon yoluyla üretilen gen silme mutantları, gen fonksiyonu çalışmaları için altın standarttır. Silme yapılarının hızlı oluşturulması için OSCAR (Agrobacterium-Rekombinasyona hazır plasmidler'in Bir Adımlı Yapısı) yöntemi anlatılmıştır. Agrobacterium aracılı fungal transformasyon izlenir. Son olarak, fungal transformantlarda gen çıkarılmalarının PCR tabanlı onay yöntemi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Gereksinim genini geri kalanını değiştirmeden kesin bir şekilde çıkarmak, canlıdaki organizmada belirli bir genin işlevini belirlemek için ideal bir ürün sağlar. Bu protokolde, hassas ve hızlı silme plazmid konstrüksiyonu OSCAR yöntemi anlatılmıştır. OSCAR, ilgilenilen genin saflaştırılmış PCR ile güçlendirilmiş 5 've 3' yanları ve pA-Hyg OSCAR (işaretleyici vektör) ve pOSCAR (birleştirme grubu) olmak üzere tek bir rekombinaz reaksiyonunun gerçekleştirildiği klonlama sistemine dayanmaktadır. vektör). Doğru monte edilen silme vektörünün doğrulanması, kısıtlama sindirim haritalaması ve bunu takiben sıralama ile gerçekleştirilir. Agrobacterium tumefaciens daha sonra silme yapısının fungal sporlara (ATMT olarak anılacaktır) yönlendirilmesine aracılık etmek için kullanılır. Son olarak, silme yapısının homolog veya homolog olmayan rekombinasyon ile entegre edilip edilmediğini belirlemek için bir PCR testi tarif edilmiştir, bu, gen silinmesini veyaSırasıyla ektopik entegrasyon. Bu yaklaşım Verticillium dahliae'de ve Fusarium verticillioides'de diğer türler arasında çok sayıda genin silinmesi için başarıyla kullanılmaktadır .

Introduction

Genetik diseksiyon, bireylerin veya gen kombinasyonlarının fonksiyonel önemini belirlemek için güçlü bir metodolojidir. Spesifik genlerin rolünü anlamak için standart bir yaklaşım, başka herhangi bir gende değiştirilmemiş tek gen mutantlarının üretilmesidir. En güçlü ve en az potansiyel olarak karıştırıcı yaklaşım, başka bir gen fonksiyonuna zarar vermeden, ilgi alanının açık okuma çerçevesinin (GOI ORF) eksiksiz ve kesin bir şekilde silinmesidir.

Silme plasmidinin üretilmesi için standart ligasyon yaklaşımları çoklu adımları gerektirdiğinden, OSCAR 1 için rasyonel , in vitro daha hızlı bir yaklaşım üretmektir. Şekil 1 OSCAR yaklaşımındaki montaj sürecini göstermektedir. Burada açıklanan yöntem, bireysel gen silme vektörlerinin hızlı yapımını, tekli çok parçalı bir reaksiyonda, sonraki Agrobacterium tumefaciens aracılı transfo ile kombinasyon halinde birleştirmenin avantajına sahiptirRmation (ATMT). OSCAR çok hızlıdır ve maya 2'de Gibson grubunun kullanımı gibi diğer stratejilerle iyi bir karşılaştırma yapmaktadır. OSCAR yöntemi, birkaç Ascomycota mantar türü ile başarıyla kullanılmıştır. Bu türler şunları içerir: Fusarium verticillioides (yayımlanmamış), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 ve Dothistroma septosporum 9 ve Sarocladium zeae (yayınlanmamış) .

Bu protokol, primer tasarımı, flank PCR amplifikasyonu, OSCAR BP reaksiyonu, silme yapısı yapısı onayı, transformat gibi yöntem için adım adım talimat sağlarİyonunu Agrobacterium'un yapısı ile, ardından da silme konstruktunun mantar hücrelerine ATMT'ye dayalı olarak aktarılmasını ve nihayet mantar delesyon mutantlarını ektopik olarak entegre edilmiş silme yapılarıyla olanlardan ayırt eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gen Flanlarının PCR Amplifikasyonu için Primer Tasarım

  1. Açık okuma çerçevesi (ORF) de dahil olmak üzere ilgili genin (GOI) genomik bölgesini ve diğer taraftan geni çevreleyen en az 2 kb'yi, FungiDB'den veya diğer genomik veri kaynağından gelen bir kelime işlem dosyasına indirin.
  2. Silme ve etiketi başlatma ve durdurma kodonları için amaçlanan ORF'yi vurgulayın.
  3. İndirilen sekans içinde bitişik ORF'leri belirleyin ve vurgulayın.
  4. 1 kb'lik asgari bir ürün üretmek için PCR primer çifti O1 ve O2'yi tasarlamak için GOI ORF'nin ve primer tasarım aracının 2 kb'lik 5 'ucunu kullanın (bkz. Malzeme Listesi). Bitişik ORF'leri etkilemeye dikkat edin.
    1. 2 kb 5 'kenarını "Sıra Giriş" penceresine yapıştırın. "Özel Parametreleri Göster" kutusunu tıklayın. Aşağıdaki özel tasarım parametrelerini girin: primer TM 58 (dak), 60 (opt) ve 62 (maks.); Astar GC 40 (dak), 50 (opt) ve 60 (maks.); Astar Boyu 22 (dak), 24 (opt) ve 26(Maks); Amplikon Boyutu 1250 (min), 1500 (opt) ve 2000 (maks.).
    2. ORF'ye en yakın ters primeri (O2) yerleştiren sonucu seçin. Testlerin bir ekran görüntüsünü çekin ve astar dizilerini kopyalayıp kelime işlem belgesine yapıştırın.
    3. O3 ve O4 primerleri oluşturmak için 3 'kenar için işlemi tekrarlayın, bu sefer hedef ORF'ye en yakın ileri primeri (O3) yerleştiren sonucu seçin.
  5. 1'den 4'e kadar olan primerlerin 5 'uçlarına uygun bağlantı yerleri ekleyin (bkz. Tablo 1 ).
  6. Ayrıca aşağıdaki bölüm 4'te silme doğrulaması için kullanılacak ORF'ye özgü primerler tasarlayın ve sipariş edin. Gerekirse ORF uzunluğu için ayarlanan Amplicon Boyut 500 (min), 750 (opt) ve 1000 (maks.) Değerlerini kullanmak dışında, parametreler adım 1.4.1'deki ile aynı olmalıdır. Son olarak, homolog rekombinantların doğrulanması için, kromozomun içindeki kanadın hemen dışında bulunan 5 'çıkış ve 3' çıkış primerleri üretin. Bu "dışarı" primerleri ile birlikte kullanılacaktır.Sırasıyla hygR (210) ve hygF (850) ( Şekil 2 ).
  7. Astar sipariş et.

2. OSCAR Yapılarının Üretimi

  1. Bir yüksek doğruluğa sahip Taq kullanarak, bir reaksiyonda primerler (100 uM) O1 ve O2 ve ikinci sırada O3 ve O4 primerleri kullanarak, her biri 5 've 3' kenarlar için iki reaksiyon gerçekleştirin. Reaksiyon karışımı aşağıdakileri içerir: 29.5 uL steril damıtılmış su (SDW), 5 uL 10x LA PCR tamponu, 8 uL 2.5 mM dNTP karışımı, 5 uL 25 mM MgCl2, 1 uL şablon (50 ng / μL), 0.5 uL hi- Fidelite Taq , 0.5 μL Primer O1 ve 5 'kenar için 0,5 μL Primer O2 (veya 3' kenar için 0.5 μL Primer O3 ve 0.5 μL Primer O4) Kullanım reaksiyon koşulları aşağıdaki gibidir: 94 ° C'de 1 dakika, daha sonra 30 çevrim 94 ° C 30 saniye, 60 ° C 30 saniye, 72 ° C 2 dakika sonra nihai adımlar 72 ° C'de 5 dakika ve daha sonra süresiz olarak 10 ° C'de tutulur.
  2. Çalıştırma% 0,8Ürün boyutunu ve göreceli konsantrasyonu belirlemek için standart bir minigel aparatında yaklaşık 125 Vh için agaroz 1x TAE (40 mM Tris asetat pH 8.3, 1 mM EDTA) jel elektroforezi. Post, üreticinin talimatlarına uygun olarak etilyumum lekeli jel boyayı verin. UV aydınlatıcı üzerinde görselleştirin.
  3. 5 've 3' kanatlı ürünler kabaca konsantrasyonda ise bunları birleştirin ve bir afinite kolonu kiti (veya PEG çökeltisi 90 μL kombine PCR ürünleri, 240 μL TE tampon pH 7.5, 160 μL% 30 polietilen glikol PEG8000 30 mM MgCl2 2 ) PCR ürünlerini üreticinin protokolüne göre birlikte saflaştırmak için. Eğer eşit konsantrasyonda değillerse, düşük konsantrasyonlu ürünlerin hepsini yüksek verim reaksiyonundan tahmini eşit miktarda ürünle birleştirin.
  4. Saf DNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.
  5. Aşağıdakileri karıştırarak BP tepkimesini gerçekleştirin: 1 ng / mL'lik 60 ng / ml'lik bir pOSCAR, 2 ngL'lik 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL 60 ng / μL kombine kenarlar, 1 uL klonaz. 25 ° C'de 16 saat inkübe edin. 0.5 uL proteinaz K ekleyerek reaksiyonu durdurun ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  6. Yüksek yeteneği dönüştürme E. Coli hücreleri. Hem piyasada bulunan yetkili hücreler hem de ev yapımı DH5α CaCl 2 yetkili hücreleri, imalatçının talimatlarına göre alıcılar olarak başarıyla kullanılmıştır. 100 μg / mL spektinomisin (Spek) içeren düşük sodyum (0.5 g / L NaCl) LB plakası.
  7. Yukarıda oluşturulan kolonilerin 10'unu DNA minipreps 10 uygulayarak doğru yapıyı belirleyin. Hin dIII ve Kpn I ile aşağıdaki gibi iki sindirim gerçekleştirin: pipet 5 mcL DNA, her bir enzimden 2 U, 20 mcL toplam hacim için SDW ile 2 mcL uygun 10x tampon. Bu, vektörden ( yaklaşık 7 kb) insert'i (yaklaşık 1.5 kb gen yanları ile 4.5 kb) serbest bırakır veÖngörülebilir bant boyutları verebilen kenarlar.
  8. Sıra 11 , uygun bir bantlama kalıbı gösteren klonları seçin.

3. Mantarlar Agrobacterium tumefaciens Aracı Dönüşüm (ATMT)

  1. Agrobacterium tumefaciens AGL1 soyunu OSCAR silme yapısı ile değiştirin 12 .
  2. GOI OSCAR silme plasmidini içeren AGL1 ile mantarları dönüştür. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları uygulayın:
    1. 2 x 10 6 spor / mL'de steril su ile mantar spor süspansiyonu hazırlayın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı üzerinde sporları ölçün. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne 500 μL yerleştirin. Bu ayar, 4 dönüşüm plakası içindir.
    2. 2-3 günlük eski LB-Spec 100 ortamından AGL1 ihtiva eden silme plazmidinin görünür bir tıkaç (halka çapının% 20'sini kaplaması gerekir) eklemek için mavi steril tek kullanımlık bir halka kullanın (bkz. MAterials Kompozisyon listesi) içeren plakaları karıştırın ve spor süspansiyonuna karıştırın. Bakteri hücreleri iyi dağılıncaya kadar ( yaklaşık 5 dakika orta hız) girdap.
    3. Birlikte yetiştirme ortamı içeren dört adet 6 cm'lik Petri kaplarının her birine yerleştirilen bir selüloz zar filtresinin merkezine konidya-Agro süspansiyonundan 100 uL pipetleyin.
    4. Süspansiyonu membran filtrenin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde steril cam boncuklar (yaklaşık 4) ile yayın. Alternatif olarak, süspansiyonu geleneksel bir yayma aracı kullanarak yayabilirsiniz. Zar filtresinin bir kaputta yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin, parafin filmle sarın. Birden fazla dönüştürme kurmak için 3.2.2 ve 3.2.3 adımlarını yineleyin.
    5. Plakayı, oda sıcaklığında 2 gün inkübe edin, ters çevirin.
    6. Membran filtreyi, higromisin B (Hyg) 150 ug / mL, 200 mM sefotaksim ve 100 ug / mL içeren 6 cm Aspergillus seçim ortamı 12 plakasına aktarınmoxalactam. Hig dirençli kolonileri izole etmeden önce oda sıcaklığında 5-7 gün inkübe edin.
    7. Steril kürdan ile, tahmin edilen transformantları, 150 μg / mL Hyg, 100 ug / mL kanamisin içeren 6 cm Potato Dextrose Agar (PDA) plakalarına aktarın.

4. PCR ile silme mutant tanımlanması

  1. Termoliz ile transformantlardan PCR için DNA çıkarın 13 .
    1. Dönüşümcüler, adım 3.2.7'den itibaren PDA üzerinde koloniler oluşturduktan sonra, koloni içindeki küçük miktarda (2 mm x 2 mm) miselyum veya maya hücrelerini lizis çözeltisinin 100 μL'sine (50 mM sodyum fosfat, pH) aktarmak için steril bir kürdan kullanın. 7.4, 1 mM EDTA,% 5 gliserol) ilave edildi.
    2. Karışımı 85-90 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin. Adım 4.2'de kullanılıncaya kadar, genomik DNA içeren ham özütü -20 ° C'de saklayın.
  2. Dönüştürücü başına 4 PCR reaksiyonu gerçekleştirin;Seçilebilen markör (bu durumda higromisin fosfotransferaz) ve bir tane de GOI ORF için, 5 've 3' yanlarının sırasıyla homolog yeniden birleştirilmesi.
    NOT: Genellikle bu reaksiyonlar için düşük maliyetli, ucuz Taq kullanırız. Tepkime koşulları yukarıdaki 2.1 adımında tarif edildiği gibidir ve SDW 20 uL, 10x Taq tampon 2.5 uL, dNTPS (10 mM) 0.5 uL, ev yapımı Taq 14 , 0.5 uL, Primer A (100 uM) 0.5 uL, Primer B (100 uM) ) 0.5 uL, Şablon 0.5 uL. Daha düşük konsantrasyonda primer stokları (10 uM) eşit derecede kullanılabilir.
  3. PCR ürünlerinin agaroz jelini ( örn. % 0.8) çalıştırın. Silme mutantları, bir ORF ürününü değil, Hyg bandını üretir. Ektopik bütünleştiriciler iki bandı gösterecek. Vahşi tip sadece ORF bandı üretecektir.
  4. Silinme mutantlarını (ve ektopik transformant veya kontroller için ikisi) gelecekte kullanmak üzere kalıcı olarak saklayın.
    NOT:% 15 gliserol,Suşlarımızı -80 ° C'de uzun vadeli yırtıyorduk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tek bir reaksiyonda OSCAR yöntemi, seçilebilir işaretleyici kaseti çevreleyen silinilecek hedef genin yanlarını içeren bir plazmid üretir. OSCAR kullanarak silme yapılarının üretilmesi çok etkilidir. Bununla birlikte, sistem, bazı parçacıkları içermeyen kısmi yapılar (iki gen kenarı ve seçilebilir işaretleyici) üretebilir. Genellikle, E. coli transformantlarının çoğunluğu doğru OSCAR yapısını içerir. Örneğin, Şekil 2 , Verticillium dahliae geni VDAG_06812 için OSCAR silme yapısını göstermektedir. Bu durumda VDAG_06812'nin kanatları Hin dIII veya KpnI bölgelerine sahip değildir ve bu nedenle 4,247 bp'lik bir plazmid girişi serbest bırakılmalıdır. Şekil 3 , anormal yapıyı temsil eden şerit 5 ve 11 hariç, doğru plasmid yapısının Hin dIII- Kpn I kısıtlama enziminin çift sindirim teyidini göstermektedirts. Şekil 4 , Southern blot ile iki farklı gen delesyonunun nihai teyidini göstermektedir. Şekil 5 , Southern blot'a alternatif olarak kesin bir PCR yaklaşımını göstermektedir.

şekil 2
Şekil 1: OSCAR silme inşaat reaksiyonu. OSCAR silme yapım süreci, 5 've 3' gen yanlarının ayrı PCR amplifikasyonunu, ardından kombine arıtılmış yan ürünler ve ikili ve seçim markörü plazmidleri ile bir BP klonaz reaksiyonunu içerir. B1r, B2r, B3, B4, Plr, P2r, P3, P4, Rl, R2, L3 ve L4 lambda rekombinasyon bölgelerini temsil eder. Referans izniyle yeniden yazdırın 1 .

şekil 2
Şekil 2: OSCAR silme yapısı, Em> Verticillium dahliae geni VDAG_06812. Doğru silme yapı yapısını doğrulamak için kısıtlama enzimi tanıma ve primer tavlama bölgeleri pozisyonları gösterilmiştir. Referans izniyle yeniden yazdırın 1 .

Şekil 3
Şekil 3: VDAG_06812'nin Kpn I ve Hin dIII ile silme yapı yapısının kısıtlanması sindirim onayı . Plazmid çift sindirildi ve% 0.8 agaroz jel üzerinde jel elektroforezi ile analiz edildi. Doğru yapı, yaklaşık olarak 6.9 kb ve 4.2 kb'lik iki bant üretir ve bunlar ikili vektör omurgasını ve sırasıyla hedef gen flanklarına kaynaşmış HygR markeri temsil eder. Referans izniyle yeniden yazdırın 1 .

Ontent "fo: keep-together.within-sayfa =" 1 "> Şekil 4
Şekil 4: Southern blot hibridizasyonu OSCAR silme yapılarını kullanarak V. dahliae'de VDAG_02161 ve VDAG_09930'un silinmesini onaylamaktadır. Genomik DNA'lar BclI ile sindirildi. Daha sonra, VDAG_02161 ve VDAG_09930 ORF sondaları ile aynı anda tarandı. Hibridizasyon bantları sırasıyla VDAG_02161 ve VDAG_09930 vahşi tipli allelleri için 2,757 bp ve 1,426 bp'dir. Örnekler şöyledir: şerit 1: vahşi tipli VdLs.17 suşu; Şerit 2: silme mutant suşu 02161.1; Şerit 3: silme mutant suşu 02161.3; Şerit 4: ektopik transformant tür Ect 02161.2; Şerit 5: silme mutant suşu 09930.3; Şeritli 6: silme mutant suşu 09930.10; Şerit 7: ektopik transformant suşu Ect 09930.4. Şuradan izin alınarak yeniden yazdır Referans 1 .


Şekil 5: PCR ile silme mutant onayı. Gen için silesyon ve ektopik Fusarium verticillioides transformantlarının analizi FVEG_13253. Şerit 1 üst ve alt, işaret; Şeritler 2-6 en iyi jel transformant PCR 5'-out parça amplifikasyon; Şeritler 7-11 en iyi jel ORF amplifikasyonu; Şeritler 2-6 alt jel Hyg gen amplifikasyonu; Şeritler 7-11 alt jel 3 'dışında fragman yükseltme. Numuneler 11/31 (şerit 2 ve 7), 11/32 (şerit 3 ve 8), 11/33 (şerit 4 ve 9) ve ektopik transformanlar 11/34 (şerit 5 ve 10) ve 11 / 35 (koridor 6 ve 11).

astar boya kullanım Sıra
Primer O1- (attB2r) 5'kenarlığın amplifikasyonu,Ön astar 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA
Primer O2- (attBlr) 5'kenarlı, ters primer amplifikasyon 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT
Primer O3- (attB4) 3'lü kanadın, primerin ileri amplifikasyonu 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT
Primer O4- (attB3) 3'lü kanadın amplifikasyonu, ters primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT

Tablo 1: Gen spesifik primer dizilerine eklenen spesifik OSCAR primer 5 'uzantıları.

astar boya kullanım Sıra
OSC-F 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT
OSC-R OSCAR ters sıralama primeri, diziler 5 'kenarlı anti-duyu ipliği 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT
HygR (210) Tersine sıralama primeri, 5 'kanadın anti-duyu iplikçik dizileri 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA
HygF (850) İleri dizileme primeri, diziler 3 'kenarlı duyu ipliği 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG
Yeni Hyg İşaretçi İlerlemesi Higromisin direncini bir kontrol olarak yükseltmek için (aşağıdaki New Hyg Marker Reverse primeri ile birlikte) 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA
Yeni Hyg İşaretçisi Ters Çevir Higromisin direncini bir kontrol olarak yükseltmek için (yukarıdaki New Hyg Marker Forward primeri ile birlikte)) 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG

Tablo 2: OSCAR silme yapılarının analizi için primerler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir Adım Agrobacterium Yapısı -Rekombinasyona hazır plazmid (OSCAR), gittikçe artan sayıda Ascomycota mantarları ile başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, Basidiomycota'ya ve diğer fungal filumlardan (seçilebilir markör genleri sürükleyen uygun promotörler ile birlikte) olan türlere, Agrobacterium aracılı transformasyon ve homolog rekombinasyonun mümkün olduğunu varsayarak kolayca uygulanabilir olmalıdır. Anti-mantar bileşiğinin seçeneklerini çeşitlendirmek ve çift ve daha yüksek dereceli mutantların üretimine izin vermek için ek işaret vektörleri üretildi. Bunlara G418 direnci, nourseothricin ve son zamanlarda herbisitler glufosinate amonyum ve klorimuron etil 4 dahildir.

Yöntem burada sunulan görüntülerin öncelikle türetildiği Verticillium dahliae ile birlikte oluşturulmuştur 1 . Daha yakın zamanlarda OSCAR silme işlemi için kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır.Mikotoksigenik mantar Fusarium verticillioides'deki genlerin toplamı. 60'dan fazla silme yapısı yapılmış ve 30'dan fazla gen için mutantlar silinmiştir (yayınlanmamıştır).

Mevcut yinelemede süreç el altında bir dizi onaylanmış silme mutantı olması yaklaşık 4-6 hafta gerektirir. Aşağıda ana OSCAR adımlarının kısa bir listesi ve bunları gerçekleştirmek için gereken yaklaşık süre verilmiştir: 1) Genom verilerine (5 gün) dayalı OSCAR primerlerinin tasarımı ve tedarik edilmesi, 2) kenarda çoğalma ve klonlama, (2 gün), 3) (1 hafta), 4) ATMT (4 gün) için Agrobacterium'a plasmid sokulması , 5) Fusarium verticillioides'de ATMT ile transformantların üretimi ve büyümesi (2 hafta, büyümeye bağlı olduğu unutulmamalıdır Termoliz ve PCR ile transformant genotiplerinin belirlenmesi (2 gün), 6) tekli sporeleme, genotip teyidi ve depolanması (1-2 hafta).

15 aracılığıyla edinilebilir. PA-Bar-OSCAR ve pA-Sur-OSCAR gibi diğer OSCAR markör plazmidleri yazarlar 5'den edinilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

Yazarlar, Fusarium verticillioiodes'de OSCAR mutantları üretmek için yaptıkları çalışmalar için aşağıdaki lisans ve lise öğrencilerine teşekkür ederler : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashle Crepsac, Jeff Delong, Christie Burre, Christie Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le ve Angel Pham.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxime TCI America C2224
Kanamycin 11815032
Moxalactam Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48, (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7, (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103, (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9, (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65, (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10, (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
  10. Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8, (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51, (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Springer International Publishing. 361-384 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics