उच्च संकल्प Respirometry माप के लिए अंतर centrifugation द्वारा कंकाल की मांसपेशी से बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Mitochondrial बायोइनरजेटिक्स और श्वसन क्षमता permeabilized कोशिकाओं या फाइबर में भी, लेकिन पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में न केवल अध्ययन किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, हम बरकरार कंकाल की मांसपेशी उच्च संकल्प respirometry मापन के लिए अंतर centrifugation का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

respirometry के लिए बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए, ऊतक homogenized है और माइटोकॉन्ड्रिया एक परंपरागत अंतर centrifugation विधि से अलग कर रहे हैं। अंतर centrifugation विधि अनुक्रमिक centrifugations पर ऊतक homogenates पहले Pallade द्वारा पेश किया गया था और सह कार्यकर्ताओं लगभग 70 साल पहले 1 के (बढ़ती गति की एक श्रृंखला में) आधारित है। ऊतक पहले कैंची का उपयोग कीमा बनाया हुआ है और एक ढीले ढाले मूसल के साथ एक गिलास homogenizer में यंत्रवत् homogenized है। बाद में homogenate कम गति और जिसके परिणामस्वरूप गोली कि अटूट ऊतक होते हैं, सेलुलर पर centrifugedमलबे और नाभिक खारिज कर दिया है। फिर, सतह पर तैरनेवाला उच्च गति पर कई बार centrifuged है और mitochondrial समृद्ध अंश एकत्र किया जाता है। अंतर centrifugation विधि के फायदे को अलग करने के माइटोकॉन्ड्रिया हैं कि: मैं) विधि तेज है और माइटोकांड्रिया (श्वसन प्रयोगों संभव के रूप में जल्दी के रूप में किया जाना चाहिए) 1-1.5 घंटे के भीतर अलग किया जा सकता है; ii) यह सस्ती है; और iii) यह बहुत ही कुशल है और माइटोकॉन्ड्रिया अंतर centrifugation द्वारा प्राप्त respirometry assays के लिए पर्याप्त शुद्ध कर रहे हैं। अंतर centrifugation विधि के नुकसान को अलग करने के माइटोकॉन्ड्रिया हैं कि मैं) माइटोकॉन्ड्रिया क्षतिग्रस्त और homogenization के दौरान uncoupled हो सकता है; ii) अन्य सेलुलर घटकों के साथ माइटोकांड्रिया (के प्रदूषण को आगे धोने के अतिरिक्त centrifugation कदम के साथ mitochondrial गोली) द्वारा हल किया जा सकता है; iii) अलग mitochondrial उप-जनसंख्या, जैसे, अंतर centrifugations चरणों के दौरान का चयन करने की संभावना है, एमआईटीकम घने साथ ochondria 7 बाहर रखा जा सकता है; और चतुर्थ) mitochondrial सेलुलर आसपास याद आ रही है और केवल सैद्धांतिक अधिकतम श्वसन मापा जा सकता है। Respirometry assays के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए एक अन्य विधि घनत्व ढाल centrifugation 2 है। इस तकनीक में, ऊतक निकालने सुक्रोज या (centrifugation ट्यूब के नीचे उच्च घनत्व के साथ) एक Percoll ढाल का एक समाधान पर स्तरित और एक निश्चित गति से centrifuged है, माइटोकॉन्ड्रिया के कारण के अनुसार अन्य सेलुलर घटकों से अलग किया जा करने के लिए उनके घनत्व। इस विधि अक्सर synaptosomes से बहुत कम संदूषण के साथ मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, चूहा जिगर घनत्व ढाल centrifugation द्वारा पृथक माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक अन्य सेलुलर organelles 3 के साथ दूषित कर रहे हैं। इस विधि की सीमाओं में से एक है कि centrifugation ट्यूब में सुक्रोज ढाल वर्तमान इतना टूटना हो सकता हैमेरे माइटोकांड्रिया (आसमाटिक सदमे)।

ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है; वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कारकों में अंतर centrifugation द्वारा बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए विचार कर रहे हैं। पहली आवश्यकता एक सौम्य तरीके से ऊतकों homogenize करने के लिए है। इस तरह के गुर्दे, मस्तिष्क और जिगर के रूप में मुलायम ऊतकों कोमल यांत्रिक homogenization के दौरान लागू बलों की आवश्यकता होती है। इस तरह के हृदय और कंकाल की मांसपेशी कि ज्यादा मजबूत यांत्रिक बलों की आवश्यकता के रूप में मुश्किल के ऊतकों के साथ विरोधाभासों। कीमा बनाया हुआ ऊतक आमतौर पर homogenization के ऊतकों को नरम करने के लिए पहले proteinase के साथ व्यवहार किया जाता है। Homogenization और centrifugation के दौरान सारे बफ़र्स बर्फ के ठंडे हो सकता है और cytosol 4, 5 के साथ संगत एक ईओण और आसमाटिक ताकत के साथ एक शारीरिक प्रासंगिक पीएच होनी चाहिए।

पृथक mitochondrial बायोइनरजेटिक्स का अध्ययन कर के लाभ में से एक यह है कि सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली permeabi होने की जरूरत नहीं हैऐसे digitonin या सैपोनिन 4, 6 के रूप में डिटर्जेंट, जो mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता समझौता हो सकता है के साथ lized। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का एक अन्य लाभ अन्य साइटोसोलिक कारक है, जो इस तरह के ऑक्सीजन की खपत के रूप में mitochondrial कार्यों के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं का अभाव है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया उपयोग करने का नुकसान centrifugation कदम के दौरान कुछ mitochondrial आबादी के संभावित चयन, homogenization के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान, और व्यवस्था पृथक माइटोकॉन्ड्रिया 7, 8 की एक अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए जैविक नमूने की उच्च मात्रा के लिए आवश्यकता है।

अलगाव प्रक्रिया के बाद, mitochondrial परिसरों की सांस की दरों मैं-, द्वितीय और चतुर्थ पर निर्भर (राज्यों 2, 3 और 4) उच्च संकल्प respirometry का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं। जटिल मैं चालित श्वसन, ग्लूटामेट के लिएऔर Malate adenosine diphosphate (ADP) द्वारा पीछा जोड़ रहे हैं। जटिल द्वितीय संचालित श्वसन के लिए, succinate ADP के द्वारा पीछा गयी है। जटिल चतुर्थ संचालित श्वसन, एस्कॉर्बेट और tetramethylphenylendiamine (TMPD) के लिए ADP 9, 10, 11, 12 के द्वारा पीछा जोड़ रहे हैं। राज्य 2 अकेले substrates की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है। राज्य 3 substrates और ADP की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है। राज्य 4 ADP कमी के बाद ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है। श्वसन नियंत्रण अनुपात (रेसकोर्स रोड) ऑक्सीजन की खपत एटीपी उत्पादन के युग्मन की एक सूची है और राज्य के 3 और 4 राज्य 13, 15 के बीच अनुपात के रूप में गणना की है।

सारांश में, हम अंतर centrifugation द्वारा कार्यात्मक और बरकरार कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया अलग और इन अलग mitochon का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनइस तरह के उच्च संकल्प respirometry के रूप में कार्य और bioenergetic अध्ययन के लिए Dria।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

quadriceps मांसपेशियों बायोप्सी एक anaesthetized सुअर, जिसमें से माइटोकॉन्ड्रिया अंतर centrifugation द्वारा अलग कर रहे हैं से लिया जाता है। सुअर एक और प्रयोग के लिए बाद में इस्तेमाल किया जाता है। अध्ययन देखभाल और प्रायोगिक पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार और गुआंगज़ौ बर्न, स्विट्जरलैंड के पशु की देखभाल समिति के अनुमोदन के साथ किया जाता है।

1. कंकाल की मांसपेशी homogenization और Mitochondrial अलगाव

  1. आबकारी 5-10 एक anaesthetized सुअर से छ quadriceps मांसपेशियों नमूना। वर्तमान परख में, सुअर का कंकाल की मांसपेशी का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल भी अन्य प्रजातियों से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, चूहे, चूहे, मानव, आदि।)।
    नोट: यह कदम सर्जरी में विशेषज्ञता के साथ एक चिकित्सा विशेषज्ञ द्वारा किया जाता है।
    1. इंट्रामस्क्युलर ketamine (20 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (2 मिलीग्राम / किग्रा), के साथ शांत सूअरों से पहले एनेस्थीसिया अंतर के साथ प्रेरित हैशिरापरक midazolam (0.5 मिलीग्राम / किग्रा, प्लस atropine 0.02 मिलीग्राम / किग्रा)। निरंतर नसों में सर्जरी के दौरान Propofol की सुई लेनी (4-8 मिग्रा / किग्रा ज प्रति) और fentanyl (30 माइक्रोग्राम / किलो ज प्रति) के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  2. इसके तत्काल बाद एक बीकर ठंडा mitochondrial अलगाव बफर के 20 एमएल (तालिका 1) युक्त ऊतक का नमूना विसर्जित कर दिया।
    नोट: बफ़र homogenization के दौरान इस्तेमाल किया और centrifugations बर्फ के ठंडे हो सकता है और cytosol के साथ संगत एक ईओण और आसमाटिक ताकत के साथ एक शारीरिक प्रासंगिक पीएच होनी चाहिए।
  3. एक विश्लेषणात्मक tared संतुलन पर बीकर में ऊतक का नमूना वजन। अलगाव बफर के 20 एमएल युक्त बीकर के साथ संतुलन धड़ा।
  4. एक बर्फ बाल्टी पर बीकर रखें।
    नोट: बर्फ बाल्टी के तापमान पर homogenization प्रक्रिया के लिए अगले कदम के सभी प्रदर्शन और बर्फ बाल्टी पर सभी बफ़र्स रखने के लिए।
  5. बीकर में कंकाल की मांसपेशी कीमा ठीक sciss का उपयोग कर 3-4 मिनट के लिए 1-2 मिमी छोटे टुकड़ों में (बर्फ पर रखने के लिए)ओआरएस।
  6. बर्फ के ठंडे अलगाव बफर (20 एमएल प्रत्येक धोने कदम) के साथ दो बार बीकर में कीमा बनाया हुआ ऊतक कुल्ला।
  7. ऊतक वजन (छ) 5 मिलीग्राम प्रोटीज / जी ऊतक युक्त प्रति अलगाव बफर के 10 खंडों में ऊतक निलंबित।
  8. चुंबकीय दोषी पर एक बर्फ स्नान में बीकर प्लेस और 10 मिनट के लिए हलचल।
  9. ऊतक वजन (छ) 0.2% (वजन / मात्रा) defatted गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पूरक प्रति अलगाव बफर के अतिरिक्त 10 संस्करणों के साथ बीकर में निलंबन पतला।
  10. अलगाव बफर 0.2% BSA के साथ पूरक के सभी छानना और बीकर में ऊतक बर्फ के ठंडे अलगाव बफर 0.2% बीएसए (20 एमएल प्रत्येक धोने कदम) के साथ पूरक के साथ दो बार कुल्ला।
  11. ऊतक वजन (छ) defatted बीएसए के साथ 0.2% के साथ पूरक प्रति अलगाव बफर के 10 खंडों में ऊतक Resuspend।
  12. एक अर्द्ध स्वचालित कांच homogenizer (बर्फ पर रखा) एक ढीले ढाले मूसल (10 स्ट्रोक) के साथ के साथ ऊतक homogenize।
    नोट: Homogenizएक ही तरीके से ऊतक हमेशा (स्ट्रोक की संख्या में एक ही है, जैसे, 10 स्ट्रोक) ई। स्ट्रोक के एक उच्च संख्या को नुकसान पहुंचा और माइटोकॉन्ड्रिया uncouple सकता है। अधिमानतः, एक स्वचालित homogenizer का उपयोग ऊतक homogenize। स्वयं (और आत्मगत) कांच homogenizers में homogenized ऊतकों के नमूनों पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के विभिन्न गुणों का उत्पादन कर सकता है।
  13. अपकेंद्रित्र में 10,000 एक्स जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर homogenized ऊतक।
    नोट: सभी centrifugation कदम निश्चित कोण रोटार के साथ सेंट्रीफ्यूज में प्रदर्शन कर रहे हैं।
  14. एक सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बीएसए पूरक ठंडा अलगाव माध्यम में गोली (10 एमएल / जी ऊतक) resuspend।
  15. अपकेंद्रित्र पर 350 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन।
  16. सतह पर तैरनेवाला एक सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग रिजर्व और गोली (सेलुलर मलबे) त्यागें।
  17. एक बीकर (बर्फ पर रखा) धुंध की दो परतों के माध्यम से में सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर (17 धागे / 2 सेमी) सेल Debr दूर करने के लिएहै।
  18. अपकेंद्रित्र में 7000 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छान निलंबन।
  19. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 7000 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अलगाव बफर (5 एमएल / जी ऊतक) के साथ 0.2% (वजन / मात्रा) बीएसए और सेंट्रीफ्यूज निलंबन पूरक में कच्चे mitochondrial गोली resuspend।
  20. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धोने बफर (तालिका 1) में कच्चे mitochondrial गोली resuspend। अपकेंद्रित्र में 7000 x जी 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन फिर से।
  21. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धोने बफर में कच्चे तेल की mitochondrial गोली resuspend और निलंबन 7000 में एक्स 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से अपकेंद्रित्र जी।
  22. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धोने बफर के 1.0 एमएल में कच्चे mitochondrial गोली resuspend।
  23. mitochondrial निलंबन के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और बर्फ पर केंद्रित mitochondrial निलंबन रहते हैं।
    नोट: प्रोटीन एकाग्रता किसी भी मानक पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है।
  24. ठीक पहलेassays respirometry करने के लिए, 0.4 मिलीग्राम / एमएल mitochondrial प्रोटीन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए श्वसन बफर में mitochondrial निलंबन resuspend।

2. उच्च संकल्प Respirometry

  1. श्वसन बफर (तालिका 1) 16 एक उच्च संकल्प Oxygraph कक्ष में पिपेट 2.1 एमएल और बफर हलचल लगातार की एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत तक 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय सरगर्मी बार चैम्बर (700 आरपीएम) में मौजूद का उपयोग कर polarographic ऑक्सीजन सेंसर प्राप्त की है।
    नोट: प्रत्येक कक्ष के भीतर Oxygraph Polarographic ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने और प्रत्येक कक्ष के भीतर ऑक्सीजन की खपत (प्रवाह) की गणना। ऑक्सीजन एकाग्रता और ऑक्सीजन की खपत दर (प्रवाह) डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय ऑनलाइन प्रदर्शित कर रहे हैं एक कंप्यूटर में। इसके अलावा, आदेश सटीक और विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, वाद्य ऑक्सीजन पृष्ठभूमि सुधार होना चाहिएनिर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया।
    नोट: श्वसन बफर के सही 2.1 एमएल stoppers बंद करने के बाद 2.0 एमएल के एक अंतिम चैम्बर मात्रा की जांच के लिए चैम्बर में जोड़ा जाता है।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 17 polarographic ऑक्सीजन सेंसर की एक हवा अंशांकन प्रदर्शन करना।
    नोट: हवा अंशांकन के दौरान, एक गैस चरण वर्तमान के साथ, मीडिया ऑक्सीजन एकाग्रता 15-20 मिनट के आदेश पर संतुलित करना होगा। तापमान, बैरोमीटर का दबाव, मीडिया और ऑक्सीजन एकाग्रता की घुलनशीलता के आधार पर गणना की जा सकती है।
  3. हवा अंशांकन के बाद, Oxygraph कक्ष से श्वसन मध्यम aspirate और Oxygraph के एक कक्ष के लिए कदम 1.24 से अलग mitochondrial निलंबन (0.4 मिलीग्राम / एमएल mitochondrial प्रोटीन) का 2.1 एमएल जोड़ने।
    नोट: श्वसन बफर की मात्रा साधन की स्थापना की और निर्माता पर निर्भर करता है। उच्च संकल्प respirometry के लिए, श्वसन बू का 2.1 एमएलffer stoppers बंद करने के बाद 2.0 एमएल के एक अंतिम चैम्बर मात्रा की जांच के लिए चैम्बर में जोड़ा जाता है।
  4. डाट की प्रविष्टि द्वारा Oxygraph चैम्बर बंद।
  5. mitochondrial निलंबन हिलाओ लगातार 3-5 मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी बार चैम्बर (700 आरपीएम) में मौजूद 37 डिग्री सेल्सियस पर और बेस लाइन पर रिकॉर्ड सेलुलर श्वसन उपयोग कर जब तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
    नोट: ऑक्सीजन एकाग्रता और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण 17 के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय ऑनलाइन प्रदर्शित कर रहे हैं एक कंप्यूटर में।
  6. बाद में, निम्न मानक प्रोटोकॉल का उपयोग stoppers के टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से mitochondrial श्वसन के लिए substrates और अवरोधकों इंजेक्षन।

3. परिसर मैं निर्भर श्वसन

  1. एक Oxygraph अलग mitochondrial निलंबन (0.4 मिलीग्राम / एमएल) प्रक्रिया कदम 2.1-2.5 में वर्णित और निम्न युक्त कक्ष तैयारएक स्थिर संकेत के लिए प्रतीक्षा करें।
  2. Oxygraph अलग mitochondrial निलंबन (0.4 मिलीग्राम / एमएल) चैम्बर डाट की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से और युक्त कक्ष में 0.8 मीटर Malate के 12.5 μL (5 मिमी अंतिम एकाग्रता) और 2 एम ग्लूटामेट के 10 μL (10 मिमी अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षन 3-5 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
    नोट: निम्न चरणों में सभी इंजेक्शन सीरिंज का उपयोग कर stoppers के टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाहों के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं।
  3. चैम्बर डाट की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से 0.05 एम ADP (0.25 मिमी) Oxygraph के चेंबर में से 10 μL इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक mitochondrial श्वसन रिकार्ड, तो कम हो जाती है और स्थिर (3-5 मिनट)।
    नोट: ADP इसके बाद श्वसन के पठार इंगित करता है कि ADP एकाग्रता उच्च और saturating था। श्वसन के दौरान इस्तेमाल किया माइटोकॉन्ड्रिया की मात्रा पर निर्भर करता है, ADP एकाग्रता titrated किया जाना चाहिएएक स्थिर राज्य 3 ऑक्सीजन की खपत (अधिक से अधिक श्वसन) के लिए। mitochondrial निलंबन के लिए ADP के अतिरिक्त ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई है और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत प्रेरित में वृद्धि होगी (राज्य 3 श्वसन) होगा। बाद ADP सेवन किया जाता है, ऑक्सीजन प्रवाह संकेत (राज्य 4 श्वसन) में कमी होगी।

4. परिसर द्वितीय निर्भर श्वसन

  1. पृथक mitochondrial निलंबन (0.4 मिलीग्राम / एमएल) प्रक्रिया कदम 2.1-2.5 में वर्णित है और एक स्थिर संकेत के लिए प्रतीक्षा के बाद से युक्त एक Oxygraph कक्ष तैयार।
  2. एक सिरिंज का उपयोग चैम्बर डाट की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से Oxygraph कक्ष में 0.2 मिमी rotenone (0.2 माइक्रोन) के 'चेतावनी' के 2 μL इंजेक्षन और जब तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है 3-5 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड है।
    नोट: Rotenone एक खतरनाक जहर है और मानव स्वास्थ्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।
  3. Oxygraph चर्चा में 1 एम succinate (10 मिमी) के 20 μL इंजेक्षनएम्बर और एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत जब तक 3-5 मिनट के लिए रिकॉर्ड mitochondrial श्वसन हासिल की है।
  4. चैम्बर डाट की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से 0.05 एम ADP (0.25 मिमी) Oxygraph के चेंबर में से 10 μL इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड, स्थिर, तो कम हो जाती है और स्थिर (3-5 मिनट)।
    नोट: mitochondrial निलंबन के लिए ADP के अतिरिक्त ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई है और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत प्रेरित में वृद्धि होगी (राज्य 3 श्वसन) होगा। बाद ADP सेवन किया जाता है, ऑक्सीजन प्रवाह संकेत (राज्य 4 श्वसन) में कमी होगी।

5. परिसर चतुर्थ निर्भर श्वसन

  1. एक Oxygraph (0.4 मिलीग्राम / एमएल) प्रक्रिया कदम प्रोटोकॉल का 2.5 करने के लिए 2.1 और एक स्थिर संकेत के लिए प्रतीक्षा में वर्णित निम्नलिखित पृथक mitochondrial निलंबन युक्त कक्ष तैयार।
  2. फिर 0.8 मिमी एस्कॉर्बेट के 2.5 μL (1 मिमी) इंजेक्षन। इसके तत्काल बाद 0.2 से 2.5 μL इंजेक्षनएम TMPD (0.25 मिमी) और 0.05 एम ADP (0.25 मिमी) Oxygraph कक्ष और रिकॉर्ड सेलुलर श्वसन ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक में की 10 μL और स्थिर (3-5 मिनट)।
  3. अंत में 1 एम सोडियम azide (5 मिमी) 'चेतावनी' Oxygraph के चेंबर में से 10 μL इंजेक्षन और ऑक्सीजन प्रवाह संकेत कम हो जाती है जब तक सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड और स्थिर।
    नोट: सोडियम azide एक खतरनाक जहर है और मानव स्वास्थ्य पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।

6. साइटोक्रोम ग टेस्ट

  1. एक Oxygraph (0.4 मिलीग्राम / एमएल) प्रक्रिया कदम प्रोटोकॉल का 2.5 करने के लिए 2.1 और एक स्थिर संकेत के लिए प्रतीक्षा में वर्णित निम्नलिखित पृथक mitochondrial निलंबन युक्त कक्ष तैयार।
  2. Oxygraph अलग mitochondrial निलंबन (0.4 मिलीग्राम / एमएल) चैम्बर डाट की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से युक्त कक्ष में 0.8 मीटर Malate के 12.5 μL (5 मिमी अंतिम एकाग्रता) और 2 एम ग्लूटामेट के 10 μL (10 मिमी अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षनऔर 3-5 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।
  3. चैम्बर डाट और रिकॉर्ड mitochondrial श्वसन ऑक्सीजन प्रवाह संकेत बढ़ जाती है जब तक की टाइटेनियम इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से 0.5 एम ADP (2.5 मिमी) Oxygraph के चेंबर में से 10 μL इंजेक्षन, तो कम हो जाती है और स्थिर (3-5 मिनट)।
  4. अंत में, 4 मिमी साइटोक्रोम ग (10 माइक्रोन) के Oxygraph कक्ष में 5 μL इंजेक्षन और 5 मिनट के लिए सेलुलर श्वसन रिकॉर्ड तक एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह संकेत हासिल की है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

परिसर मैं निर्भर श्वसन

पृथक mitochondrial जटिल मैं निर्भर श्वसन दर (राज्यों 2, 3 और 4) उच्च संकल्प respirometry (चित्रा 1, एक प्रतिनिधि आरेख) का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं। Mitochondrial परिसर मैं substrates, ग्लूटामेट और Malate, ADP के अलावा द्वारा पीछा जोड़ रहे हैं। राज्य 2 अकेले substrates की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है। राज्य 3 substrates और ADP की उपस्थिति में ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है। राज्य 4 ADP कमी के बाद ऑक्सीजन की खपत को दर्शाता है। रेसकोर्स रोड एटीपी उत्पादन के लिए ऑक्सीजन की खपत के युग्मन की एक सूची है और जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है राज्य 3 और 4 राज्य के बीच अनुपात के रूप में गणना की जाती है ADP, mitochondrial श्वसन दर बढ़ जाती है तुरंत (राज्य 3 श्वसन) के अलावा पर, और उसके बाद कम हो जाती स्तर बहुत एस के लिए (राज्य 4 श्वसन)राज्य 2. की है कि imilar यह एक उच्च रेसकोर्स रोड को इंगित करता है और कहा कि mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। चित्रा 2 एक कम राज्य 3 श्वसन दर और रेसकोर्स रोड की माप के एक प्रतिनिधि आरेख, एक उच्च राज्य 4 श्वसन दर, अनुचित और असफल mitochondrial अलगाव का संकेत के साथ है। राज्य 4 पर एक उच्च श्वसन दर mitochondrial प्रोटॉन leakiness 15 का सूचक है।

आकृति 1
चित्रा 1: सफल mitochondrial अलगाव: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। उच्च संकल्प respirometry से Tracings ग्लूटामेट और substrates के रूप में Malate (जटिल मैं निर्भर श्वसन) का उपयोग। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजनरल एकाग्रता समय के साथ कम हो जाती है के रूप में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: असफल mitochondrial अलगाव: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव प्रक्रिया अनुचित mitochondrial अलगाव का संकेत दौरान संरक्षित नहीं है। उच्च संकल्प respirometry से Tracings ग्लूटामेट और substrates के रूप में Malate (जटिल मैं निर्भर श्वसन) का उपयोग। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन एकाग्रता समय के साथ कम हो जाती है के रूप में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया availab का उपयोगLe ऑक्सीजन। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

परिसर द्वितीय निर्भर श्वसन

पृथक mitochondrial जटिल द्वितीय निर्भर श्वसन दर (राज्यों 2, 3 और 4) उच्च संकल्प respirometry (चित्रा 3, एक प्रतिनिधि आरेख) का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं। इस परख के लिए, mitochondrial परिसर मैं rotenone के अलावा द्वारा हिचकते है, और फिर succinate (जटिल द्वितीय सब्सट्रेट) ADP के द्वारा पीछा गयी है। चित्रा 3 से पता चलता है कि ADP के अलावा पर, mitochondrial श्वसन बढ़ जाती है तुरंत, और फिर बहुत ही राज्य 2 के समान स्तर, अच्छी तरह से मिलकर माइटोकॉन्ड्रिया का संकेत करने के लिए और कम हो जाती है किmitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। इस विशिष्ट प्रयोग के लिए गणना रेसकोर्स रोड मूल्य 4.23, जो उपलब्ध साहित्य 10, 11, 23) में दिखाया गया मूल्यों के साथ बंद समझौते में है। चित्रा 4 एक कम राज्य 3 श्वसन दर और रेसकोर्स रोड की माप के एक प्रतिनिधि आरेख, एक उच्च राज्य 4 श्वसन अनुचित अलगाव का संकेत दर के साथ है।

चित्र तीन
चित्रा 3: सफल mitochondrial अलगाव: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। सब्सट्रेट (जटिल द्वितीय निर्भर श्वसन) के रूप में succinate का उपयोग उच्च संकल्प respirometry से Tracings। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है (के ढलानऑक्सीजन एकाग्रता)। ऑक्सीजन एकाग्रता समय के साथ कम हो जाती है के रूप में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: असफल mitochondrial अलगाव: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव प्रक्रिया अनुचित अलगाव का संकेत दौरान संरक्षित नहीं है। सब्सट्रेट (जटिल द्वितीय निर्भर श्वसन) के रूप में succinate का उपयोग उच्च संकल्प respirometry से Tracings। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन एकाग्रता पृथक mitoc के रूप में समय के साथ कम हो जाती हैhondria उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

परिसर चतुर्थ निर्भर श्वसन

पृथक mitochondrial जटिल चतुर्थ निर्भर श्वसन दर (राज्यों 2, 3) उच्च संकल्प respirometry (चित्रा 5, एक प्रतिनिधि आरेख) का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं। इस परख एस्कॉर्बेट पर / TMPD और ADP जोड़ रहे हैं, सोडियम azide के द्वारा पीछा जटिल चतुर्थ को बाधित करने के लिए।

पहले और सोडियम azide के अलावा के बाद ऑक्सीजन की खपत के बीच का अंतर वास्तविक जटिल चतुर्थ श्वसन के रूप में व्याख्या की है। चित्रा 5 measur के एक प्रतिनिधि चित्र हैएक उच्च जटिल चतुर्थ निर्भर राज्य 3 श्वसन का संकेत mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है कि दर के ement। इसके विपरीत, चित्रा 6 एक कम राज्य 3 अनुचित अलगाव का संकेत के माप का एक प्रतिनिधि चित्र है।

चित्रा 5
चित्रा 5: सफल mitochondrial अलगाव: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। एस्कॉर्बेट / TMPD सब्सट्रेट (जटिल चतुर्थ निर्भर श्वसन) के रूप में उपयोग करते हुए उच्च संकल्प respirometry से Tracings। परिसर चतुर्थ श्वसन (राज्य 3) पहले और सोडियम azide के अलावा के बाद ऑक्सीजन की खपत घटाकर से व्याख्या की है। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन एकाग्रता पृथक mitocho के रूप में समय के साथ कम हो जाती हैउपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग ndria। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: असफल mitochondrial अलगाव: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव प्रक्रिया अनुचित अलगाव का संकेत दौरान संरक्षित नहीं है। एस्कॉर्बेट / TMPD सब्सट्रेट (जटिल चतुर्थ निर्भर श्वसन) के रूप में उपयोग करते हुए उच्च संकल्प respirometry से Tracings। परिसर चतुर्थ श्वसन (राज्य 3) पहले और सोडियम azide के अलावा के बाद ऑक्सीजन की खपत घटाकर से व्याख्या की है। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन concentration समय के साथ कम हो जाती है के रूप में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन साइटोक्रोम ग का उपयोग कर

mitochondrial तैयारी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, साइटोक्रोम ग परीक्षण ग्लूटामेट और Malate, ADP और साइटोक्रोम ग के बाद के अलावा के बाद mitochondrial बाहरी झिल्ली अखंडता, mitochondrial श्वसन की माप द्वारा निर्धारित करने के लिए किया जाता है (ADP में प्रेरित जटिल द्वितीय निर्भर राज्य 3 श्वसन साइटोक्रोम ग की उपस्थिति)। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 7, साइटोक्रोम ग वृद्धि नहीं करता जटिल मैं निर्भर राज्य 3 पुन पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की spiration है, यह दर्शाता है कि वहाँ mitochondrial बाहरी झिल्ली से साइटोक्रोम ग का कोई नुकसान नहीं हुआ था और mitochondrial अखंडता संरक्षित है कि।

चित्रा 6
चित्रा 7: साइटोक्रोम सी अलग mitochondrial की श्वसन वृद्धि नहीं करता: mitochondrial अखंडता अच्छी तरह से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान संरक्षित है। ग्लूटामेट / सब्सट्रेट के रूप में Malate (जटिल मैं निर्भर श्वसन) का उपयोग उच्च संकल्प respirometry से Tracings। ब्लू लाइन ऑक्सीजन एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। लाल रेखा ऑक्सीजन का प्रवाह (ऑक्सीजन एकाग्रता की ढलान) का प्रतिनिधित्व करता है। ऑक्सीजन एकाग्रता समय के साथ कम हो जाती है के रूप में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया उपलब्ध ऑक्सीजन का उपयोग करें। ऑक्सीजन की खपत pmol / (एसएक्स मिलीग्राम mitochondrial प्रोटीन) के रूप में व्यक्त किया जाता है।M / फ़ाइलें / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Mitochondrial अलगाव बफर
रासायनिक एकाग्रता
KCl 100 मिमी
MgSO 4 10 मिमी
morpholinopropane sulphonic एसिड (MOPS) 50 मिमी
ethylenedinitrilotetraacetic एसिड (EGTA) 1.0 मिमी
एटीपी 1.1 मिमी
7.4 पीएच
Mitochondrial धोने बफर
रासायनिक एकाग्रता
KCl 100 मिमी
MOPS 50 मिमी
EGTA 0.5 मिमी
7.4 पीएच
Mitochondrial श्वसन बफर 16
रासायनिक एकाग्रता
सुक्रोज 110 मिमी
EGTA 0.5 मिमी
2 MgCl 3.0 मिमी
KCl 80 मिमी
कश्मीर lactobionate 60 मिमी
के.एच. 2 4 पीओ 10 मिमी
बैल की तरह 20 मिमी
Hepes 20 मिमी
बीएसए 1.0 ग्राम / एल
पीएच 7.1

तालिका 1: buffers की रचना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्तमान अध्ययन में हम उच्च गुणवत्ता, बरकरार है और जो इस तरह के उच्च संकल्प respirometry के रूप में कार्य के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अंतर centrifugation द्वारा कसकर मिलकर कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

आदेश बरकरार है और कसकर मिलकर माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं वर्तमान प्रोटोकॉल के भीतर विचार किया जाना है। कंकाल ऊतक कटाई के बाद, यह तुरंत ठंडा mitochondrial अलगाव बफर में डूब जाना चाहिए। सभी centrifugation कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए और mitochondrial निलंबन अलगाव के दौरान बर्फ पर हमेशा रखा जाना चाहिए। अलगाव की प्रक्रिया के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए। homogenate साफ डिटर्जेंट मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में centrifuged किया जाना चाहिए। प्रक्रिया के अंत में, mitochondrial निलंबन केंद्रित रखा जाना चाहिए और सिर्फ respirometry करने से पहले पतला हो। चूंकि respirometry डेटा दूसरी पीई प्रति pmol के रूप में व्यक्त कर रहे हैंmitochondrial प्रोटीन की आर मिलीग्राम, यह एक अच्छी तकनीक का उपयोग करने के लिए सही ढंग से अलगाव के बाद mitochondrial प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए महत्वपूर्ण है।

कुछ mitochondrial अलगाव प्रक्रियाओं में, यह हो सकता है कि माइटोकॉन्ड्रिया uncoupled हैं या ऑक्सीजन ठीक से उपभोग नहीं करते उच्च संकल्प respirometry का उपयोग कर। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, ऊतक हमेशा एक ही तरीके (स्ट्रोक के एक ही नंबर) में homogenized किया जाना चाहिए ढीले ढाले मूसल (कदम 1.12) के साथ homogenizer का उपयोग। यहाँ, हम हमेशा 10 स्ट्रोक के साथ एक स्वचालित homogenizer का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों homogenize। स्ट्रोक के एक उच्च संख्या को नुकसान पहुंचा और माइटोकॉन्ड्रिया uncouple सकता है। स्वयं (और आत्मगत) कांच homogenizers में homogenized ऊतकों के नमूनों पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के विभिन्न गुणों का उत्पादन कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रिया की ठंड भी uncoupled माइटोकॉन्ड्रिया में हो सकता है और एक यकीन है कि centrifugations और नहीं इस ते नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर काम कर रहे हैं बनाना चाहिएmperature। mitochondrial अखंडता के रूप में अच्छी तरह से समझौता किया जा सकता है, तो बफर समाधान के पीएच गलत है या centrifugation नलियों साफ नहीं कर रहे हैं। एक यकीन है कि centrifugation नलियों डिटर्जेंट मुक्त और ठीक से धोया हैं बनाना चाहिए।

पहली महत्वपूर्ण कारकों में अलगाव के दौरान विचार किया जाना से एक एक सौम्य तरीके से ऊतकों homogenize करने के लिए है। मुलायम ऊतकों, कोमल यांत्रिक homogenization के दौरान लागू बलों की आवश्यकता होती है, जबकि मुश्किल ऊतकों में ज्यादा मजबूत यांत्रिक बलों की आवश्यकता होती है। homogenization और centrifugations के दौरान इस्तेमाल किया बफ़र बर्फ के ठंडे हो सकता है और cytosol के साथ संगत एक ईओण और आसमाटिक ताकत के साथ एक शारीरिक प्रासंगिक पीएच होनी चाहिए। इस तरह के कंकाल की मांसपेशी के रूप में मुश्किल ऊतकों के लिए, यांत्रिक homogenization के बाद, इस तरह के रूप में trypsin proteases आगे ऊतक 4, 5 disaggregate करने के लिए जोड़ा जा सकता है।

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की सीमाओं से कुछ, डी पर आधारितifferential centrifugation i) homogenization और अलगाव की प्रक्रिया के दौरान 19 संभवतः क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया, द्वितीय) ऊतक mitochondrial अलगाव के लिए आवश्यक नमूनों की बड़ी मात्रा में, तृतीय) संभावित नुकसान और कुछ mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला परिसरों सब यूनिटों में परिवर्तन homogenization के दौरान और कर रहे हैं centrifugation कदम 18, और iv) homogenization और centrifugation चरणों के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, जो mitochondrial समारोह 18 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के उत्पादन में वृद्धि। Dounce homogenization और अंतर centrifugation विधि के लाभ में इस तरह के घनत्व ढाल centrifugation 20 के रूप में मौजूदा तरीकों के संबंध में श्वसन प्रयोगों के लिए कच्चे तेल की माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए हैं कि विधि जल्दी है और माइटोकॉन्ड्रिया समय की एक छोटी अवधि के भीतर अलग कर रहे हैं। इसलिए श्वसन प्रयोगों 1 के भीतर किया जा सकता हैज। इसके अलावा, प्रक्रिया सस्ती, बहुत ही कुशल है और अंतर centrifugation द्वारा प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया respirometry assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत की जांच permeabilized फाइबर या कोशिकाओं पर कई लाभ प्रदान करता है: साइटोसोलिक प्रोटीन है कि mitochondrial समारोह और बायोइनरजेटिक्स के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के साथ कोई महत्वपूर्ण हस्तक्षेप; सेलुलर permeabilization के लिए कोई ज़रूरत नहीं है; और mitochondrial सांस की श्रृंखला परिसरों के substrates पृथक माइटोकॉन्ड्रिया को सीधे जोड़ा जा सकता है।

वैकल्पिक तरीकों कंकाल की मांसपेशी mitochondrial श्वसन को मापने के लिए एक प्रयोग मांसपेशी फाइबर 9 permeabilized है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के ऊपर permeabilized मांसपेशी फाइबर के लाभ में से कुछ को मैं) कोई यांत्रिक homogenization के कदम की जरूरत है और, द्वितीय) ऊतक (कुछ मिलीग्राम) की बहुत थोड़ी मात्रा respirometry assays के लिए आवश्यक हैं। पी का नुकसानermeabilized मांसपेशी फाइबर फाइबर बंडल में माइटोकॉन्ड्रिया के लिए कम ऑक्सीजन प्रसार है। यह प्रसार प्रतिबंध respirometry assays के दौरान ADP की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। एक अन्य विकल्प विधि पूरे ऊतक homogenates 22 का उपयोग करते हैं, जो एक बहुत ही त्वरित तरीका है और माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए अंतर centrifugation कदम की आवश्यकता नहीं होती है। पूरे ऊतक homogenate के उपयोग अपने अलगाव के दौरान कुछ माइटोकॉन्ड्रिया के नुकसान को रोकने सकता है, लेकिन वहाँ अन्य साइटोसोलिक वर्तमान कारक है, जो इस तरह के ऑक्सीजन की खपत के रूप में mitochondrial कार्यों के विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हो सकता है।

अंतर centrifugation माहिर श्वसन assays के लिए कच्चे तेल की माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के बाद, एक भविष्य आवेदन ऐसे mitochondrial बाहरी झिल्ली विरोधी TOM22 (बाहरी mitochondrial झिल्ली 22 Homolog की translocase) एंटीबॉडी coupl का उपयोग कर के रूप में उभर तकनीकों के माध्यम से अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के श्वसन क्षमता की जांच करने के लिए हैएड चुंबकीय मोती 21।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
ATP Sigma A 7699 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
EGTA fluka 3779 Chemical
Glutamate Sigma, G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) Merck 1.06129 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial Sigma P 8038 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser  schuett-biotec GmbH 3.201 011 Tissue homogenizer
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
  2. Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55, (2), 698-707 (1990).
  3. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9, (11), 3209-3214 (2009).
  4. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
  5. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  6. Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416, (2), 218-227 (2011).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3, (6), 965-976 (2008).
  8. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, (4), 1041-1053 (2013).
  9. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41, (10), 1837-1845 (2009).
  10. Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18, (2), 217-230 (2012).
  11. Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42, (8), e550-e559 (2014).
  12. Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
  13. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
  14. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, (2), 297-312 (2011).
  16. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, (20), 11080-11085 (2000).
  17. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
  18. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6, (3), e18317 (2011).
  19. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9, (6), 1032-1046 (2010).
  20. Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
  21. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8, (12), 382392 (2013).
  22. Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11, (5), 722-728 (2011).
  23. Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475, (2), 84-88 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics