अंतर स्कैनिंग उष्मामिति - थर्मल स्थिरता और प्रोटीन एंटीजन की रचना का आकलन के लिए एक विधि

Biochemistry
 

Summary

अंतर स्कैनिंग उष्मामिति थर्मल संक्रमण तापमान (एस) और कुल गर्मी ऊर्जा एक प्रोटीन denature के लिए आवश्यक उपाय। प्राप्त परिणामों के टीके योगों में प्रोटीन एंटीजन के थर्मल स्थिरता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

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Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).

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Abstract

अंतर स्कैनिंग उष्मामिति (डीएससी) एक विश्लेषणात्मक तकनीक है कि तापमान के एक समारोह के रूप में नमूने की दाढ़ गर्मी क्षमता को मापता है। प्रोटीन के नमूने के मामले में, डीएससी प्रोफाइल थर्मल स्थिरता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, और कुछ हद तक एक संरचनात्मक "" फिंगरप्रिंट कि संरचनात्मक रचना का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है। (; टी एम पिघलने के तापमान) और ऊर्जा बातचीत तृतीयक संरचना स्थिर बाधित करने की आवश्यकता है, प्रोटीन की (तापीय धारिता ΔH) यह एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर कि थर्मल संक्रमण तापमान उपायों का उपयोग किया जाता है। तुलना योगों के साथ ही उत्पादन बहुत सारे के बीच बना रहे हैं, और व्युत्पन्न मूल्यों में मतभेद थर्मल स्थिरता और संरचनात्मक रचना में मतभेद का संकेत मिलता है। स्थिरता के अध्ययन के लिए एक औद्योगिक सेटिंग में डीएससी के उपयोग को दर्शाता हुआ तथा प्रमुख विनिर्माण कदम निगरानी डेटा इस समर्थक की प्रभावशीलता के सबूत के रूप में प्रदान की जाती हैंtocol। प्रोटीन रचना के थर्मल स्थिरता का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, डीएससी, लागत प्रभावी है कुछ नमूना तैयार कदम की आवश्यकता है, और यह भी प्रोटीन खुलासा प्रक्रिया की पूरी thermodynamic प्रोफ़ाइल प्रदान करता है।

Introduction

अंतर स्कैनिंग उष्मामिति (डीएससी) एक प्रयोगात्मक विधि है कि सीधे नियंत्रित तापमान परिवर्तन 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 के दौरान एक संदर्भ के लिए एक नमूना रिश्तेदार में हो रही गर्मी ऊर्जा तेज में अंतर की गणना करता है , 10, 11, 12। एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर में किए गए, विधि एक नमूना सेल और एक संदर्भ सेल एक साथ, जबकि हूबहू समय 2, 13 से अधिक दोनों कोशिकाओं के तापमान में वृद्धि में गर्मी ऊर्जा को शुरू करना शामिल है,14। नमूना और संदर्भ की संरचना में अंतर के कारण, ऊर्जा के विभिन्न राशि कोशिकाओं 2, 12, 13 के तापमान को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो जाएगा। इस प्रकार, कोशिकाओं के तापमान के बीच अंतर के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए आवश्यक ऊर्जा की अतिरिक्त राशि मापा जाता है और सीधे नमूना 1, 3 की विशिष्ट thermodynamic के गुणों के लिए सहसंबद्ध।

1960 के दशक में, एम जे ओ 'नील और Perkin एल्मर का ई वाटसन ठोस सामग्री 2, 3, 4 की गर्मी प्रवाह को मापने के लिए पहली अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर विकसित की है। समानांतर में, पीएल Privalov और भौतिकी संस्थान के डॉ Monaseldze ईएल जॉर्जिया के गणराज्य (पूर्व सोवियत संघ) एक अद्वितीय अंतर adiabatic कैलोरीमीटर कि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बनायाआर जैव रासायनिक अनुसंधान 5, 6। इसके बाद, भौतिकी संस्थान, जॉर्जिया के गणराज्य में Andronikashvili की टीम, ऐसे रेशेदार और गोलाकार प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और डीएससी 7, 8, 9 का उपयोग कर के रूप में biomolecules की गर्मी क्षमता की सूचना दी। Sturtevant 10, 11, 12, 13 Brandts, और Privalov 14, 15, 16 के नेतृत्व में कई टीमों प्रोटीन खुलासा के thermodynamic विवरण की जांच करने के सिद्धांत और डीएससी के व्यावहारिक अनुप्रयोगों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया। ऐसे फगेस, क्लोरोप्लास्ट, फॉस्फोलिपिड तरल क्रिस्टल, और मांस प्रोटीन के रूप में बड़े supramolecular संरचनाओं का अध्ययन करने में डीएससी के मूल्य भी 17 सूचित किया गया है sup>, 18, 19, 20।

डीएससी अब, biomolecules के थर्मल स्थिरता के मूल्यांकन के लिए दवा अनुसंधान और विकास में आम हो गया है, विशेष रूप से प्रोटीन 1, 21, 22। यह ज्यादातर संवेदनशीलता और प्रयोग 23, 24 से बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया इंस्ट्रूमेंटेशन के स्वचालन के मामले में प्रगति के कारण है। इधर, डीएससी प्रयोग, अर्थात्, तापमान के एक समारोह के रूप में दाढ़ गर्मी क्षमता के अंतिम परिणाम, निम्नलिखित thermodynamic के मापदंडों का अनुमान किया जाता है (ΔS गर्मी क्षमता (ΔCp), तापीय धारिता (ΔH), एन्ट्रापी में परिवर्तन () और गिब्स मुक्त ऊर्जा (ΔG)) नीचे समीकरण का उपयोग:

eq1.jpg "/> (1)

2 समीकरण (2)

3 समीकरण (3)

4 समीकरण (4)

5 समीकरण (5)

कहाँ सी.पी. गर्मी क्षमता मापा जाता है; क्यू परीक्षण सामग्री में गर्मी प्रवाह है; 0 टी और टी क्रमश: 22, 25 संक्रमण के प्रारंभिक और अंतिम तापमान हैं। यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि समीकरणों से ऊपर एकल डोमेन प्रोटीन है कि दो राज्य के संक्रमण और प्रतिवर्ती थर्मल खुलासा 22 गुजरना कर सकते हैं करने के लिए आवेदन के लायक है। और अधिक जटिल प्रोटीन (जैसे, गैर-दो राज्य प्रोटीन, और oligomers) का विश्लेषण जएवेन्यू Friere एट अल द्वारा सूचना दी गई। 26; जॉनसन एट अल। 27; और Kasimova एट अल। 28।

एक प्रोटीन दो राज्य के संक्रमण से होकर गुजरती है या थर्मल विकृतीकरण के दौरान मध्यवर्ती रूपों यह निर्धारित करने के लिए, प्रयोगात्मक निकाली गई तापीय धारिता (ΔH, के रूप में भी उष्मापन तापीय धारिता ΔH काल कहा जाता है) तापीय धारिता van't हॉफ समीकरण भी कम दिया (का उपयोग ली गई की तुलना में है van't हॉफ तापीय धारिता के रूप में भेजा, ΔH VH):

समीकरण 6 (6)

जहां टी एम संक्रमण के मध्य तापमान, आर आदर्श गैस निरंतर (1.987 कैलोरी मोल -1 कश्मीर -1) है और वाई सामने आया राज्य 16, 29 में प्रोटीन की आबादी का अंश है। अगरΔH VH ΔH काल के बराबर है; या ΔH VH / ΔH काल 1 के बराबर है, तो प्रोटीन एक "सभी या कोई नहीं" संक्रमण (यानी दो-राज्य संक्रमण) 16, 25, 29 से होकर गुजरती है। हालांकि, अगर ΔH VH ΔH काल से भी कम है; या ΔH VH / ΔH काल कम से कम 1 प्रोटीन एक गैर-दो राज्य संक्रमण 16, 25, 29 से गुज़रता है। ΔH VH / ΔH काल के अनुपात से भी प्रोटीन संरचना है कि एक thermodynamic सहकारी इकाई या डोमेन के रूप में 26 के अनुपात में पिघला देता है से मेल खाती है।

ΔG और ΔH के रूप में इस तरह के ऊपर उल्लेख किया thermodynamic के मापदंडों के प्रोटीन के थर्मल स्थिरता, बायोलॉजिक्स सहित के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान 30। हालांकि, जोर दिया है, इस प्रकाशन में टी मी और ΔH पर रखा जाएगा के रूप में वे इस प्रोटोकॉल के लिए सूचना मान रहे हैं। टी एम संक्रमण, जहां मुड़ा और प्रोटीन के सामने आया राज्यों संतुलन पर हैं (यानी, ΔG = 0), 25, 31 के मध्य बिंदु तापमान है। उच्च एक प्रोटीन की टी एम, उच्च अपने थर्मल स्थिरता 31। ΔH बनाम तापमान ग्राफ (भी thermogram के रूप में जाना जाता है) गर्मी क्षमता के शिखर (एस) के तहत क्षेत्र से मेल खाती है डीएससी प्रयोग 16, 25 के अंत में उत्पन्न। यह ऊर्जा प्रोटीन denature करने के लिए और एक प्रोटीन तैयार करने में सक्रिय अंश (एफ) एक अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता जरूरी है (यानी, एक नमूने में सक्रिय रचना के साथ प्रोटीन के अनुपात में) निम्न समीकरण का उपयोग:

jove_content "> समीकरण 7 (7)

कहाँ ΔH प्रोटीन नमूने की प्रयोगात्मक निकाली गई तापीय धारिता है और क्यू तापीय धारिता एक अच्छी तरह से विशेषता संदर्भ या मानकीकृत प्रोटीन 22 के लिए चुना गया है। एफ एक के आकलन तनाव की स्थिति के तहत उत्पादों की वास्तविक समय की निगरानी स्थिरता के साथ ही स्थिरता अध्ययन करने के रूप में आईसीएच दिशा निर्देशों 32 द्वारा अपेक्षित के लिए महत्वपूर्ण है। ΔH की तुलना भी एक प्रोटीन 31 के तृतीयक संरचना रचना की सघनता के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल एक औद्योगिक सेटिंग में प्रोटीन की थर्मल स्थिरता का आकलन करने के लिए एक प्रक्रिया का विवरण और बड़े पैमाने पर टीके के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह एक स्वचालित अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम एफ उत्पन्न का उपयोग कर विकसित किया गया थाया 300 माइक्रोग्राम / एमएल के रूप में के रूप में कम प्रोटीन सांद्रता।

Protocol

1. साधन शुरू हुआ

  1. अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर पर स्विच और कोशिकाओं में दबाव बढ़ाने के नमूने के उबलते को दबाने के लिए के रूप में अच्छी तरह से गठन ऊंचा तापमान पर बुलबुले को रोकने के। यह आमतौर पर इस प्रणाली में नाइट्रोजन की आपूर्ति के द्वारा हासिल की है।
  2. सेल (जैसे, टैंटलम, सोना, प्लेटिनम, आदि) के गठन सामग्री पर निर्भर करता है, सेल को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए निर्माता की सिफारिश दबाव के अनुसार नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति के दबाव को समायोजित। उदाहरण के लिए, इस प्रक्रिया को विकसित करने के लिए इस्तेमाल साधन के लिए 45 साई को नाइट्रोजन गैस की आपूर्ति का दबाव है, और दबाव 80 साई ऊपर सेल नुकसान हो सकता है निर्धारित किया है।
  3. सुनिश्चित करें कि सभी सफाई एजेंट जलाशयों आवश्यक मात्रा को भर रहे हैं। सफाई की आवश्यकता एजेंटों साबुन और पानी से धोने और प्रत्येक नमूना चलाने के बाद क्रमश: सेल साफ करने के लिए शामिल हैं।
  4. नमूना पकड़े डिब्बे के तापमान सेटएक उचित मूल्य, अधिमानतः 5 डिग्री सेल्सियस, नमूना प्रयोग करने से पहले की अखंडता को बनाए रखने के लिए।

2. नमूना तैयार

  1. बफर कि प्रयोग के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा के खिलाफ नमूना Dialyze। वैकल्पिक रूप से, क्षालन बफर प्रोटीन शुद्धि (यानी स्तंभ क्षालन) के अंतिम चरण में एकत्र किया जा सकता है।
  2. ऐसे Kjedahl विधि 33 या लौरी विधि 34 के रूप में सबसे उपयुक्त प्रोटीन एकाग्रता दृढ़ संकल्प विधि का उपयोग प्रोटीन के नमूने की एकाग्रता का निर्धारण। परिणामों का उद्देश्य तुलना के लिए, इसी अध्ययन के भीतर लगातार एक ही विधि का उपयोग करें। आवश्यक एकाग्रता रेंज साधन के मॉडल के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। 1 मिलीग्राम / एमएल - इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त साधन के लिए, बेहतर काम कर सीमा 0.5 है।
  3. शून्य में नमूना और संदर्भ बफर सूक्ष्मबुद्बुद कि मात्रा inaccur पैदा कर सकता है छुटकारा पाने के लिए देगासacy। यह कदम नए कैलोरीमीटर मॉडल के लिए छोड़ दिया जा सकता है।
  4. एक लामिना का प्रवाह biocontainment कैबिनेट में एक micropipette और बाँझ सुझावों का प्रयोग, 96 अच्छी तरह से साधन के साथ संगत प्लेटों में जोड़े में नमूने और उनके संबंधित बफर लोड। बफर बफर और क्रमश: पानी स्कैन के लिए पानी के साथ पहले दो पिछले दो जोड़े के बफर के साथ कुओं के जोड़े और भरें। बफर बफर स्कैन साधन माप (इंस्ट्रूमेंटेशन त्रुटि के यानी आकलन) नमूना करने के साथ ही एक आधारभूत स्थापित प्रायर की उपयुक्तता का सत्यापन करें, कोशिकाओं को साफ करने के लिए, जबकि पानी स्कैन चलाए जा रहे हैं।
  5. एक सील फिल्म के साथ 96 अच्छी तरह से थाली कवर, और यह सुनिश्चित करें कि कुओं को ठीक से जैव सुरक्षा कैबिनेट से बाहर प्लेट लेने के नमूना संक्रमण से बचने के लिए पहले सील कर रहे हैं।
  6. उचित अभिविन्यास में नमूना पकड़े डिब्बे में थाली रखें।

3. प्रायोगिक पैरामीटर सेटअप

नोट: मैं पर निर्भर करता हैnstrumentation, नमूने सेल में लोड किया जा सकता है या तो स्वयं एक सिरिंज का उपयोग कर, या स्वचालित रूप से एक autosampler का उपयोग कर। इस मामले (यानी एक औद्योगिक सेटिंग) में, एक autosampler समय बचाने के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, आदेश प्लेट धारा 2.4 के अनुसार भरी हुई थी में नमूना जानकारी दर्ज करें। यदि उपलब्ध सांद्रता दर्ज करें, अन्यथा, डेटा विश्लेषण (धारा 4.2) से पहले विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एकाग्रता मूल्यों दर्ज करें।
  2. विकल्प है कि हर नमूना स्कैन, जो कई पानी से कुल्ला कदम से पालन किया जाना चाहिए कोई डिटर्जेंट अवशेषों की कोशिकाओं में छोड़ दिया जाता है सुनिश्चित करने के लिए पहले साबुन के साथ कोशिकाओं की सफाई सुनिश्चित करता है का चयन करें।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रयोग के शुरू तापमान सेट, लेकिन इस नमूने के पूर्व ज्ञान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। नाम से जाना जाता प्रोटीन के लिए, पूर्व निर्धारित शुरू तापमान, इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एक कम शुरू तापमान अज्ञात नमूने के लिए लागू किया जा सकता है।
  4. अंतिम तापमान सेटप्रयोग के, जैसे 100 डिग्री सेल्सियस। अंतिम तापमान नमूना के पूर्व ज्ञान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  5. प्रयोग की दर स्कैन, जैसे 60 डिग्री सेल्सियस / घंटा है जो ठेठ दर स्कैन सेट करें। हालांकि, दर स्कैन नमूना के पूर्व ज्ञान के आधार पर जैसे 90 डिग्री सेल्सियस / घंटा या 120 डिग्री सेल्सियस / ज भिन्न हो सकते हैं। यह खुलासा के कैनेटीक्स का आकलन करने के लिए अलग-अलग दरों पर स्कैन अज्ञात नमूनों को स्कैन करने की सलाह दी जाती है।
  6. Rescan नमूने थर्मल खुलासा के उलटने की जांच करने के लिए। एक प्रोटीन का खुलासा प्रतिवर्ती माना जाता है अगर तापीय धारिता दूसरे स्कैन के लिए प्राप्त पहले स्कैन के लिए तापीय धारिता मूल्य कम से कम 80% है।
  7. कैलोरीमीटर की कोशिकाओं की अखंडता की रक्षा करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस के बाद प्रयोग थर्मोस्टेट सेट करें।
  8. सत्यापित करें कि प्रयोग सेटअप मानकों प्रयोग क्रियान्वित करने से पहले सही हैं। यदि सब कुछ जगह में है, प्रयोग शुरू करते हैं।

4. डेटा एकalysis

  1. प्रयोग से कच्चे डेटा पुनः प्राप्त करने और विश्लेषण के लिए एक समय में एक नमूना चयन करें। घटाना संदर्भ स्कैन, यानी बफर, नमूना स्कैन से।
    नोट: संदर्भ घटाव डीएससी उपकरणों के नए मॉडल द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है।
  2. नमूना एकाग्रता मान दर्ज करता है, तो यह धारा 3.1 के अनुसार छोड़ा गया था।
  3. फ़िट और जो खुलासा पर पानी के लिए हाइड्रोफोबिक समूहों के जोखिम के कारण होता है प्रोटीन की मुड़ा और सामने आया राज्यों की गर्मी क्षमताओं में मतभेद के लिए खाते में प्राप्त कर लिया thermogram से आधारभूत घटाना। रैखिक या घन वक्र ढाले नमूना के लिए डीएससी प्रोफ़ाइल के आकार के आधार पर लागू किया जा सकता है। स्थिरता के लिए, फिटिंग का एक ही प्रकार के एक अध्ययन, जैसे वास्तविक समय स्थिरता अध्ययन के दौरान इस्तेमाल किया जा रहा है। यह कदम वक्र पर कार्रवाई करने के चोटी के एकीकरण के संक्रमण की तापीय धारिता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
  4. गैर रेखीय कम से कम वर्ग फिट का उपयोग कर चोटी एकीकरण को पूरा करें। उत्पाद के आधार परज्ञान को लागू दो राज्य या गैर-दो राज्य के मॉडल। दो राज्य मॉडल एकल सहकारी थर्मल बदलाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रोटीन के लिए अज्ञात, गैर दो राज्य मॉडल लागू जब तक आगे उत्पाद ज्ञान उपलब्ध है। यदि लागू हो, उपकरण के सॉफ्टवेयर के चलने का वक्र ढाले समारोह का उपयोग कर जब तक ची-वर्ग मूल्य लगातार बना रहता है ढाले वक्र समायोजित करें।
  5. प्राप्त परिणामों के संक्रमण तापमान (टीएम), उष्मापन तापीय धारिता (ΔH), और नमूने के van't हॉफ तापीय धारिता (ΔH VH) के मध्य के लिए मूल्यों को दिखाएगा।

Representative Results

सबसे डीएससी प्रयोगों से कच्चे डेटा, एक गर्मी प्रवाह बनाम तापमान ग्राफ के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं के रूप में वास्तव में कैलोरीमीटर नमूना समाधान में गर्मी प्रवाह की दर में अंतर के उपाय और बफर 35। इसलिए, यदि दोनों कोशिकाओं (यानी नमूना और संदर्भ कोशिकाओं) एक प्रयोग के दौरान समान समाधान होते हैं, स्कैन से कच्चे डेटा कोई नमूदार चोटियों के साथ एक फ्लैट लाइन होना चाहिए। मनाया किसी भी शिखर इंस्ट्रूमेंटेशन त्रुटि (जैसे क्षतिग्रस्त या दूषित कोशिकाओं), यही वजह है कि बफर स्कैन चल रहा है नमूना करने से पहले विश्लेषण एक पर्याप्त व्यवस्था उपयुक्तता परीक्षण है के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। चित्रा 1 एक ठेठ बफर स्कैन का संकेत है कि कैलोरीमीटर अच्छा काम कर हालत का नमूना विश्लेषण करने से पहले में था का परिणाम दिखाता है।

चित्रा 2 से पता चलता है एक डीएससी प्रयोग के लिए कच्चे डेटा अन्तर पर बाहर कियादो प्रोटीन के नमूने की erent बहुत सारे। पहले निहित के रूप में मनाया चोटियों के नमूने और उनके संबंधित buffers की गर्मी प्रवाह में मतभेद हैं। नमूना एकाग्रता में मतभेद कैलोरीमीटर द्वारा दर्ज की गर्मी क्षमता में बदलाव का कारण बन सकता है; हालांकि, इन बदलावों प्रक्रिया की धारा 4.2 के अनुसार नमूना विश्लेषण के दौरान सामान्यीकृत कर रहे हैं। उच्च सांद्रता भी अतिरिक्त thermodynamic डोमेन का पता चलता है कम सांद्रता में संक्रमण के लिए योगदान नहीं कर सकते। इसके अलावा, प्रत्येक संक्रमण एक thermodynamic डोमेन कि प्रोटीन 36 में से एक या एक से अधिक संरचनात्मक डोमेन शामिल हो सकते हैं प्रतिनिधित्व करता है। इस मामले में, प्रोटीन 1 तीन संरचनात्मक डोमेन है कि सहयोगात्मक पिघल गया है।

चित्रा 3 प्रोटीन 1 और 2 के लिए कच्चे डेटा चित्रा 2, अर्थात् में प्रस्तुत के विश्लेषण से उत्पन्न परिणामों, आधारभूत घटाव और चलने की अवस्था फाई के बाद पता चलता हैtting। जिसके परिणामस्वरूप thermograms दर स्कैनिंग के लिए सामान्यीकृत किया गया है और एकाग्रता (स्वचालित रूप से विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक पूर्व निर्धारित एल्गोरिथ्म द्वारा किया जाता है); इस प्रकार, तापमान रेखांकन बनाम तुलनीय गर्मी क्षमता में प्रयोग के परिणाम पेश किया। विश्लेषण सॉफ्टवेयर ऐसी टी मी और ΔCp के रूप में तापमान रेखांकन, बनाम गर्मी क्षमता से डेटा का उपयोग करता है, खुलासा प्रोटीन की सहकारिता के आधार पर ऊपर दिए गए समीकरणों के रूपांतरों का उपयोग अन्य thermodynamic मानकों को प्राप्त करने के लिए।

अज्ञात नमूने परीक्षण, स्थापना उचित तापमान रेंज महत्वपूर्ण है। अन्यथा, अधूरा thermograms, परिणाम के रूप में 4 चित्र में सचित्र सकता है। हालांकि इस तरह के प्रोफाइल से टी एम प्राप्त किया जा सकता है, ΔH सही निर्धारित नहीं किया जा सकता। इसलिए, नमूना पूरी तरह से थर्मल संक्रमण पर कब्जा करने के लिए एक बड़ा तापमान रेंज के साथ पुनर्परीक्षण किया जाना चाहिए। कुछ प्रोटीन भी फिर सेadily फार्म, पूरा विकृतीकरण के बाद एक बढ़ती हुई समुच्चय के बाद संक्रमण गर्मी क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप: इस बार एक अधूरी thermogram के रूप में प्रकट होता है के रूप में चित्रा 2 बी में सचित्र। हालांकि, एक उच्च तापमान के साथ अंतिम retesting पुष्टि thermogram की है कि इस क्षेत्र में एक गठनात्मक संक्रमण की एक घटना है कि क्या वहाँ या यह प्रोटीन समुच्चय के महज गर्मी अवशोषित प्रभाव है कर सकते हैं।

थर्मल स्थिरता उद्योग 37 में प्रोटीन और प्रोटीन आधारित उत्पादों का सबसे महत्वपूर्ण भौतिक गुणों में से एक है। दवाइयों में, यह सूत्रीकरण buffers और ऐसे नमी और तापमान के रूप में पर्यावरणीय कारकों सहित विभिन्न शर्तों के तहत बायोलॉजिक्स की स्थिरता को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह भी महत्वपूर्ण कदम निर्माण (जैसे, शुद्धि और detoxification) की निगरानी के लिए उत्पादन बहुत सारे के बीच गठनात्मक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। > 5 आंकड़े और 6 डीएससी के उपयोग का वर्णन स्थिरता और दो अलग अलग प्रोटीन के संरचनात्मक रचना पर क्रमश: रासायनिक detoxification और भंडारण की स्थिति के प्रभाव की जांच करने के लिए। टीएम और ΔH में काफी अंतर क्रमश गठनात्मक परिवर्तन और प्रोटीन गिरावट का संकेत मिलता है। इसके अलावा, चित्रा 6 में तीसरी संक्रमण के नुकसान के आगे एक डोमेन है जो आणविक वजन में कमी से इसकी पुष्टि की थी जब नमूने बहु कोण प्रकाश बिखरने (एसईसी-MALS) के साथ आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग विश्लेषण किया गया की गिरावट दिखाता है ( डाटा नहीं दिखाया गया)।

आकृति 1
चित्रा 1: बफर स्कैन। कोई नमूदार चोटियों के साथ प्रत्येक स्कैन की ढाल में समानता इंगित करता है कि साधन अच्छा काम कर हालत में है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न।//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: कच्चे डीएससी प्रयोगों से एकत्र आंकड़ों। ये ग्राफ़ प्रयोगात्मक रन के बाद अधिग्रहीत unanalyzed (रॉ) के आंकड़ों के अच्छे अभ्यावेदन (आधारभूत घटाव और वक्र ढाले यानी पहले) कर रहे हैं। प्रत्येक पंक्ति एक उत्पादन बहुत प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटीन 2, ताप पर अधिक आसानी से कुल करने के लिए thermogram के बाद संक्रमण क्षेत्र में ऊपर 100 डिग्री सेल्सियस गर्मी क्षमता में वृद्धि हुई है, जिसके परिणामस्वरूप जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: विश्लेषण डीएससी डेटा। ये रेखांकन का विश्लेषण किया डीएससी डेटा का अच्छा निरूपण (यानी आधारभूत घटाव और वक्र ढाले के बाद) कर रहे हैं। जबकि लाल रेखा thermogram करने के लिए सबसे अच्छा फिट के साथ वक्र का प्रतिनिधित्व करता है ब्लू लाइन, आधारभूत घटाव के बाद thermogram प्रतिनिधित्व करता है। (ए) टी मी और ΔH के लिए प्रोटीन 1 नमूना # 12 80.16 डिग्री सेल्सियस और 1.69 x 10 6 सीएएल / मोल क्रमशः रहे हैं। (बी) टी मी और ΔH के लिए प्रोटीन 1 नमूना # 13 80.15 डिग्री सेल्सियस और 1.71 x 10 6 सीएएल / मोल क्रमशः रहे हैं। (सी) टी मी और ΔH के लिए प्रोटीन 2 नमूना # 21 75.01 डिग्री सेल्सियस और 4.08 x 10 6 सीएएल / मोल क्रमशः रहे हैं। (डी) टी मी और ΔH के लिए प्रोटीन 2 नमूना # 22 75.67 डिग्री सेल्सियस और 4.22 x 10 6 सीएएल / मोल क्रमशः रहे हैं। करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक अधूरी thermogram। कच्चे डेटा प्रोटीन 1 एक अपर्याप्त तापमान रेंज में विश्लेषण के लिए इकट्ठा। प्रयोग के अंतिम तापमान 90 डिग्री सेल्सियस है जो प्रोटीन की पूरी संक्रमण प्रोफ़ाइल को समायोजित नहीं किया चित्रा 2A के लिए प्रयोग जो 120 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थापित किया गया था की तुलना के रूप में स्थापित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: डेटा का विश्लेषण प्रोटीन 1. (ए) प्रोटीन 1 के तृतीयक संरचना पर रासायनिक detoxification के प्रभाव दिखा अपने मूल रचना और में एक विष हा है2.57 x 10 5 कैलोरी / मोल पर 56.84 डिग्री सेल्सियस पर अपनी टी मी और ΔH है। (बी) प्रोटीन 1 (यानी toxoid) की detoxified रूप में क्रमश: टी मीटर और 81.01 डिग्री सेल्सियस के ΔH मूल्यों और 1.89 x 10 6 सीएएल / मोल है। इस प्रकार, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि विषहरण कदम है जो अपने detoxified फार्म के लिए अधिक से अधिक स्थिरता (उच्च टी एम) प्रदान प्रोटीन 1 के संरचनात्मक रचना करने के लिए बदलाव के कुछ फार्म की शुरुआत की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: डेटा का विश्लेषण शर्तों का संग्रहण का असर दिखा प्रोटीन 3. की रचना पर ये ग्राफ़ भंडारण तापमान के प्रभाव को समझाना (2 - 8 डिग्री सेल्सियस) स्थिरता और समर्थक के तृतीयक संरचना पर3 से 30 हफ्तों Tein। टी मीटर और 8 वें (ए) में प्रोटीन 3 और भंडारण के 38 वें सप्ताह (बी) के लिए ΔH मूल्यों नीचे तालिका 1 में दिया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना टीएम 1 (डिग्री सेल्सियस) ΔH 1 (सीएएल / मोल) टीएम 2 (डिग्री सेल्सियस) ΔH 2 (सीएएल / मोल) टीएम 3 (डिग्री सेल्सियस) ΔH 3 (सीएएल / मोल)
प्रोटीन 3 से 8 सप्ताह के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 61.91 1.71 x 10 5 75.54 2.17 x 10 5 90.29 4.17 x 10 5
61.87 1.66 x 10 5 75.18 1.46 x 10 5 90.22 5.76 x 10 5

तालिका 1: 2 में भंडारण के 8 वें और 38 वें वीक में प्रोटीन 3 के लिए टीएम और ΔH मान - 8 डिग्री सेल्सियस। हालांकि दोनों समय बिंदुओं पर टी एम मूल्यों के समान हैं, ΔH मूल्यों में अंतर को इंगित करता है कि प्रोटीन 3 की तृतीयक संरचना निर्दिष्ट भंडारण शर्त के तहत 30 सप्ताह से अधिक अपमानित किया है।

Discussion

इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक स्थिरता और उत्पाद तुलनीयता के अध्ययन के 21 सहित विभिन्न लक्षण वर्णन परीक्षण संकुल, में शामिल किया गया है। वास्तविक समय स्थिरता अध्ययन में, डीएससी टी मीटर पर नजर रखने के लिए, साथ ही समय के साथ एफ बायोलॉजिक्स के एक अनुमान उनकी शेल्फ जीवन का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। साथ उत्पाद तुलनीयता करने का संबंध है, यह प्रक्रिया और सुविधा परिवर्तन के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से उत्पादित लॉट के संरचनात्मक रचना पर कुंजी विनिर्माण कदम के प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आमतौर पर एक संदर्भ उत्पाद है कि आदर्श उत्पाद के रूप में नामित किया गया है करने के लिए उत्पादन बहुत की ΔH के प्रत्यक्ष तुलना शामिल है। इसके अलावा, DSC उत्पाद तैयार करने के अध्ययनों से 37 के लिए एक उपयोगी विश्लेषणात्मक उपकरण साबित हो गया है। विभिन्न बफ़र्स में और अलग सांद्रता में एक प्रोटीन की टी एम सूत्रीकरण कि सबसे करने के लिए स्थिरता proffers निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताप्रोटीन।

इस विधि और उसके परिणामों की निष्पक्षता की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, यह एक ही अध्ययन (जैसे, वैक्सीन तैयार करने अध्ययन) के भीतर चलाने के लिए रन से लगातार परीक्षण मानकों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, प्रक्रिया विभिन्न प्रोटीन के भौतिक गुणों में मतभेद को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक संशोधन का एक उदाहरण है कि बनाया जा सकता प्रयोग 38, 39 की स्कैनिंग दर में फेरबदल किया गया है। प्रोटीन है कि गठन के समुच्चय से ग्रस्त थे जब गरम एक तेजी से स्कैनिंग दर पर जांच की गई है (जैसे, 120 डिग्री सेल्सियस / एच) थर्मल संक्रमण प्रोफ़ाइल के समुच्चय के योगदान कैलोरीमीटर की केशिकाओं clogging के रूप में से बचने के लिए भी है। यह ध्यान देने योग्य है कि स्कैनिंग की दर एक डीएससी प्रयोग 38 के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं लायक है। थर्मल संक्रमण चोटी के विस्तार कुछ समर्थक में स्कैनिंग की दरों में वृद्धि के साथ देखा गया हैteins; हालांकि, टी एम काफी लगातार 38 बने रहे। इसके अलावा, नमूना तैयार करने के लिए डायलिसिस और degassing कदम भी सही परिणाम 31 के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। डायलिसिस सुनिश्चित करता है कि नमूना और बफर की संरचना में फर्क सिर्फ इतना प्रोटीन होता है; इस प्रकार, सभी अतिरिक्त गर्मी नमूना द्वारा अवशोषित प्रोटीन की गर्मी क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। के रूप में thermodynamic पैरामीटर के एक्सट्रपलेशन मानता है कि खुलासा घटना निरंतर मात्रा और दबाव 31 के तहत हो रहा है degassing, सटीक मात्रा विश्लेषण करता है। इस धारणा के लगातार दबाव भाग प्रक्रिया की धारा 1.1 के अनुसार इस प्रणाली के नाइट्रोजन दबाव से हिसाब है।

इस तरह के परिपत्र Dichroism (सीडी) और प्रतिदीप्ति spectroscopies के रूप में प्रोटीन रचना की स्थिरता का निर्धारण करने के अन्य तरीकों की तुलना में, डीएससी एक कॉम में लाभ के एक नंबर प्रदान करता हैलागत और समय की बचत सहित तौर पर वाणिज्यिक सेटिंग। सबसे पहले, एक अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर के समोष्ण डिजाइन सीडी और प्रतिदीप्ति spectroscopies 6 के लिए उपकरण के साथ माप की तुलना में बेहतर तापमान परिशुद्धता के साथ थर्मल स्थिरता की माप के लिए अनुमति देता है। दूसरे, सीडी के विपरीत, डीएससी डेटा की सटीकता नहीं प्रोटीन 39, 40 के helicity पर निर्भर है; हालांकि, सीडी माध्यमिक संरचना है, जो डीएससी 41 के लिए मानार्थ होगा के खुलासा के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, डीएससी प्रणाली के दबाव नमूना उबलते के बिना एक व्यापक तापमान रेंज के साथ परीक्षण के लिए अनुमति देता है; इस प्रकार, प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला डीएससी द्वारा परीक्षण किया जा सकता है।

डीएससी एक अपेक्षाकृत तेजी से और सीधा बायोलॉजिक्स के थर्मल स्थिरता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण है, यह सीमाओं के बिना नहीं है। सबसे पहले, आधारलाइन घटाव कदम कच्चे डेटा विश्लेषण में मानव विसंगति के कुछ फार्म का परिचय; इस प्रकार, परिणाम में बदलाव के विभिन्न उपयोगकर्ताओं के बीच मनाया जा सकता है। दूसरा, अंतर स्कैनिंग calorimeters न्यूनतम एकाग्रता की सीमा जो थोक विनिर्माण पैमाने पर प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। तीसरा, अपरिवर्तनीय थर्मल विकृतीकरण के ΔH निरपेक्ष नहीं है; जो अर्थ है कि ली गई ΔG (प्रोटीन स्थिरता का सूचक) समान स्थितियों में गुमराह किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि शुद्ध नमूने के लिए सबसे अच्छा काम करता है। अशुद्धियों की उपस्थिति या तो टी मीटर में बदलाव का कारण हो सकता है अगर वहाँ जांच के तहत प्रोटीन, या नए थर्मल संक्रमण की उपस्थिति के साथ एक बातचीत है अगर कोई बातचीत है। किसी भी मामले में thermograms पर इन अतिरिक्त सुविधाओं को गलत तरीके से नमूने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, इस प्रकार परिणामों की व्याख्या को प्रभावित। इन सीमाओं के बावजूद, डीएससी एक विश्वसनीय तरीका है कि वें के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते thermodynamic रहता हैई प्रोटीन प्रक्रिया खुलासा अगर ठीक से 42 लागू किया है।

अंत में, डीएससी टीका उत्पादों और उनके मध्यवर्ती के लिए एक गठनात्मक readout उपकरण के रूप में काफी लाभ प्रदान करता है। दो मापदंडों, टी एम और ΔH, एक ही उत्पाद की बहुत सारी की एक सरणी के लिए एकत्र एक अनुभवजन्य आधारभूत है कि इस प्रक्रिया में परिवर्तन, निर्माण, और तृतीयक संरचना पर भंडारण की स्थिति और प्रोटीन की स्थिरता के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और हो सकता है वायरल एंटीजन 21, 43।

Disclosures

सभी लेखकों सनोफी पाश्चर में कर्मचारी हैं। काम सनोफी पाश्चर द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और इस वीडियो लेख के लिए प्रकाशन फीस सनोफी पाश्चर द्वारा भुगतान किया गया। लेखकों कोई प्रासंगिक जुड़ाव या किसी भी संगठन या संस्था के विषय या सामग्री पांडुलिपि में चर्चा के साथ एक वित्तीय संघर्ष है के साथ वित्तीय भागीदारी की है। ये रोजगार, परामर्शी, शेयर स्वामित्व या विकल्प हैं, या रॉयल्टी शामिल हैं।

कोई लेखन सहायता इस पांडुलिपि के उत्पादन में इस्तेमाल किया गया था।

Acknowledgments

लेखकों की स्थापना और अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर, Sasmit देशमुख और वेबस्टर Magcalas अपनी चर्चा के लिए पर प्रशिक्षण में उनकी भूमिका के लिए यूसुफ मैनसिनी (जीई हेल्थकेयर के साथ पूर्व), पावेल Czudec, थॉमस केज (Malvern उपकरण लिमिटेड) के लिए बहुत आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Differential Scanning Calorimeter Malvern Instruments Ltd 28428948 (Via GE Healthcare) Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100 Decon Laboratories Inc 1504 Dilute with water to 20% before use
500 µL Polypropylene round bottom 96 well plate Canadian Life Science ML072100 Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac  Malvern Instruments Ltd N/Ap provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet  Labconco Logic+ - A2 biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette Thermo Scientific 66810 or 66380 to equilibrate the sample and buffer

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