A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Biology

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Summary

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

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Chowdhury, A. N., Vo, H. T., Olang, S., Mappus, E., Peterson, B., Hlavac, N., Harvey, T., Dean, D. A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration. J. Vis. Exp. (121), e55264, doi:10.3791/55264 (2017).

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Abstract

A migração celular é uma parte vital da resposta imune, crescimento e cicatrização de feridas. A migração celular é um processo complexo que envolve interacções entre células, a matriz extracelular e factores químicos solúveis e não solúveis (por exemplo, quimioatractores). Métodos padrão para medir a migração de células, tais como o ensaio de câmara de Boyden, trabalho por contagem de células em ambos os lados de uma divisória. Estas técnicas são fáceis de utilizar; no entanto, eles oferecem pouca modificação geométrica para diferentes aplicações. Em contraste, os dispositivos microfluidicos podem ser utilizados para observar a migração de células com gradientes de concentração personalização de factores solúveis 1, 2. No entanto, os métodos para fazer os ensaios com base microfluidos pode ser difícil de aprender.

Aqui, nós descrevemos um método fácil para criar câmaras de cultura de células para medir a migração celular em resposta a gradientes de concentração química. Nossos mi celularesmétodo câmara gração pode criar diferentes gradientes de concentração linear de modo a estudar a migração de células para uma variedade de aplicações. Este método é relativamente fácil de usar e é normalmente realizada por alunos de graduação.

A câmara de microcanais foi criado por colocação de uma inserção de acrílico na forma da câmara de microcanais finais bem em uma placa de Petri. Depois disso, o poli (dimetilsiloxano) (PDMS) foi deitada no topo da inserção. O PDMS foi deixada endurecer e, em seguida, a inserção foi removida. Isto permitiu a criação de cavidades em qualquer forma ou tamanho desejado. As células podem ser posteriormente adicionado à câmara de microcanais, e agentes solúveis podem ser adicionados a um dos poços por imersão de um bloco de agarose, o agente desejado. O bloco de agarose é adicionado a um dos poços, e as imagens de lapso de tempo pode ser feita da câmara de microcanal, a fim de quantificar a migração celular. Variações deste método pode ser feita para uma dada aplicação, tornando este método highly personalizável.

Protocol

1. Produzir uma Câmara MicroChannel criar um gradiente de concentração

  1. Cortando uma peça de molde de acrílico
    1. Obter um pedaço de acrílico com a largura desejada. Normalmente, utilizam 1 placas de acrílico /-16 polegadas de espessura. folhas mais espessas são difíceis de cortar bem e muito finas folhas não têm a resistência mecânica, causando-lhes a quebrar ou deformar durante o processo.
    2. Criar um ficheiro CAD com a forma desejada da peça de acrílico para produzir uma cavidade no interior do polidimetilsiloxano (PDMS). Ajustar a largura do canal e comprimento para atingir o desejado gradiente relevantes para protocolos experimentais individuais.
      1. Aqui, utilizar uma peça de acrílico com as seguintes dimensões: dois quadrados (0,254 cm x 0,254 centímetros) ligada por um canal de largura 0,127 cm (0,254 cm de comprimento) (Figura 1).
    3. Importar o arquivo CAD para dentro do aparelho de corte a laser e coloque a peça de acrílico em um cortador de laser de acordo com a manuo protocolo do cante.
      NOTA: Como alternativa, 3D-imprimir a peça a partir do desenho CAD. A vantagem deste método é que os materiais alternativos podem ser usadas para o molde; No entanto, a resolução e a reprodutibilidade pode ser diminuída com impressão em 3D em comparação com o corte a laser.

figura 1
Figura 1: (CAD) Representação Computer-Aided Design de microcanais Câmara. Esta imagem descreve o desenho CAD da inserção acrílico necessário para criar a câmara de microcanais. 1 A) Vista de cima do desenho CAD, 1B) Vista lateral do desenho CAD com dimensões em polegadas, 1C) Vista superior de desenho CAD com dimensões em polegadas Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Verter o polidimetilsiloxano (PDMS)
    1. Em um barco de pesagem, misturar 10 partes em peso de base de elastómero comercial (por exemplo, Sylgard 184) com 1 parte em peso de um elastómero comercial Agente de cura (por exemplo, Sylgard 194). Tipicamente, misturar 10 g de Elastómero de base para 1 g de Elastómero Agente de cura.
    2. Agita-se para combinar a base e o agente de cura com uma micropipeta durante 5 min.
    3. Defina-se um sino de vácuo e coloque o barco pesar com PDMS no vácuo durante 30 min para remover as bolhas de ar aprisionadas.
    4. Desligue o vácuo e remover o barco pesa. Despeje o PDMS em cima do acrílico cut-out em uma pequena placa de Petri. Certifique-se de que os PDMS cobre completamente a inserção.
    5. Permitir que o PDMS a curar durante a noite (pelo menos 18 h) à temperatura ambiente.
  1. Removendo a inserção de PDMS
    1. Após a cura do PDMS, remova a inserção cortando cuidadosamente as PDMS ao redor do pedaço de acrílico com um bisturi.

    2. plaqueamento das células em uma Câmara MicroChannel

    1. Esterilizar a câmara de células de plaqueamento.
      NOTA: Enquanto PDMS pode ser esterilizado usando óxido de etileno ou outras técnicas, um tratamento rápido de UV é rápido, barato, e suficiente para estudos de culturas celulares. A duração do tratamento UV curto não prejudicar a estrutura mecânica ou a integridade da peça de PDMS.
      1. Em um armário de cultura celular padrão, cobrir completamente a câmara com 70% de etanol.
      2. Coloque a placa de Petri na capela de fluxo laminar com as tampas fora.
      3. Feche a tampa e ligar a luz UV. Expor à luz UV durante 1-2 h.
      4. Abra a câmara de fluxo laminar e aguarde 15 minutos para restabelecer o fluxo.
      5. Remover o etanol a 70%.
      6. Lavam-se as câmaras duas vezes com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Use 1 ml de PBS para cada lavagem. Remover PBS e permitir câmaras para secar durante a noite com as tampas fora.
        NOTA: Como alternativa, em vezda utilização de uma câmara de fluxo laminar, use uma caixa de câmara de UV para esterilização se estiver disponível. Adicione uma caixa de UV colocando uma fonte de luz UV na parte de trás de uma caixa de cartão revestida com folha de alumínio. A folha de alumínio reflecte a luz para permitir a iluminação uniforme da amostra.
    2. Chapeamento de células em câmara
      1. Contagem de células utilizando azul tripano e um hemocitómetro.
        1. Adiciona-se 100 uL da suspensão de células de 400 uL de 0,4% de azul de Tripano e misturar suavemente. Adicionar 100 ul desta solução para o hemocitómetro preenchendo suavemente ambas as câmaras sob a lamela de vidro.
        2. Use um microscópio com uma objetiva de 10X para se concentrar na grelha no hemocitômetro. Use um contador de contagem mão para contar as células não coradas ao vivo dentro de um conjunto de 16 quadrados no hemocitômetro.
        3. Contagem de células em todas as 4 séries de 16 quadrados. Tome a contagem média de células a partir dos 4 conjuntos de 16 quadrados e multiplicar por 5x10 4. Este número final é o number de células / ml na suspensão de células.
      2. Adicionar 2500 células a uma cavidade em cada uma das câmaras. Isto traduz-se para uma densidade quase confluentes de células de ~ 30000 / cm 2.
      3. Permitir que as células para se sentar na câmara durante 60 minutos antes de adicionar mídia (de Eagle Modificado por Dulbecco Médio, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina).

    3. Blocos de agarose Dextran Soaked

    1. Criando um bloco de agarose
      1. Pour 3% de agarose em molde 3D impressa (2 mm x 2 mm x 2 mm).
      2. Permitir que a agarose solidificar em uma câmara de vácuo durante 30 min para remover quaisquer bolhas.
      3. Remover o bloco de agarose a partir do molde.
        NOTA: Como alternativa, derrame 3% de agarose em pequena placa de Petri com uma espessura de 2 mm. Corte um bloco de 2 mm x 2 mm x 2 mm, utilizando um bisturi ou outra ferramenta de corte. Este não é tão preciso como o sistema de molde mas pode ser um pouco mais fáceis de fazer.
    2. completamente submerge o bloco de agarose numa solução com a concentração desejada do factor quimiotáctico. Para avaliar a formação de gradiente de concentração, lavar a câmara pela primeira vez com dextrano fluorescente. A concentração e peso molecular do dextrano deve coincidir com a de um factor solúvel ou droga de interesse.
    3. Mergulhe a noite bloco de agarose.

    4. Time-lapse of a difusão Dextran para avaliar o gradiente de concentração Solúvel Fator

    1. Coloque o bloco de agarose dextrano embebido em um pequeno poço quadrado da câmara de microcanais.
    2. Coloque a câmara de microcanais em um sistema de imagens de células ou utilizar outro microscópio de fluorescência com uma capacidade de lapso de tempo. Comece o lapso de tempo de acordo com as instruções do fabricante.
      Nota: Os resultados apresentados são tomadas com filtro GFP, 50% de luz, 4/10 pH, e uma ampliação de 4X.

    5. Time-lapse do crescimento celular

    1. células placa na câmara de microcanais em uma extremidade docâmara. Aqui, usar fibroblastos 3T3. Adicionar 2500 células a uma cavidade na câmara de microcanais. Contagem de células como descrito em 2.2.1.
      1. Permitir que as células para se sentar na câmara durante 60 minutos antes de adicionar mídia (de Eagle Modificado por Dulbecco Médio, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina). Manter a câmara de microcanais com células plaqueadas a 37 ° C em 5% de CO 2. A migração celular através do canal pode ser vista com um microscópio.
      2. Adicionar um marcador ou utilização de um defeito microscópico na câmara como um marcador, a fim de servir como um ponto de partida para quantificar a distância que a célula move-se.
    2. Estabelecer um gradiente por colocação de um gel de agarose (8 mm3 bloco) que contém o factor de crescimento concentrado, quimio-atractor, droga, ou outro factor a ser ensaiado (aqui, 40% de FBS está a ser utilizada como um exemplo), a uma extremidade do microcanal câmara.
    3. Tome imagens de lapso de tempo de frente da célula em movimento. Aqui, os resultados mostram imagens da célula front que foram tomadas a cada 12 h, utilizando um sistema de imagem.
    4. Use imagens de frente da célula para quantificar a taxa de crescimento celular. Calcula-se a taxa de crescimento utilizando primeiro a função polyfit MATLAB (roipoly) para criar uma máscara poligonal definido pela frente da célula, as paredes do canal, e o marcador de referência. As dimensões desta máscara se obter a distância de migração da frente a partir do qual a velocidade média frente célula é calculada. Outros estudos têm utilizado um método semelhante 8.
      NOTA: Comparar a borda da frente de crescimento da célula em cada quadro para a concentração do factor solúvel naquela mesma distância. O gradiente de concentração factor solúvel é calculado utilizando um modelo de difusão 1D aproximação.
    5. Tome imagens fluorescentes das células utilizando faloidina e DAPI coloração.
      1. Fix células antes da coloração com faloidina.
        1. Quente paraformaldeído a 4% a 37 ° C.
        2. Adicionar suficiente paraformaldeído a 4% para cobrir as células. Manter as células naparaformaldeído durante 10 min.
        3. Lavar duas vezes com PBS durante 15 min de cada vez. Use PBS suficiente para cobrir as células.
      2. Remover PBS a partir de células e adicionar solução de permeabilização suficiente (0,1% de Triton X-100 em PBS) para cobrir as células. Deixar solução durante 10 min.
      3. Lavar duas vezes com PBS durante 5 min de cada vez. Use PBS suficiente para cobrir as células.
      4. Remover PBS a partir de células e adicionar solução (1% de albumina de soro de bovino em PBS) de bloqueio durante 20 minutos.
      5. Remoção da solução de bloqueio e lavar 2 vezes com PBS durante 5 min de cada vez. Use PBS suficiente para cobrir as células.
      6. A partir deste ponto, a proteger as células da luz com folha de alumínio, quando não estiver sendo usado. Remover PBS a partir de células e adicionar 488 faloidina diluídas a 1:50 em PBS durante 1 h.
      7. Lavar 2 vezes em PBS durante 5 minutos para cada lavagem. Use PBS suficiente para cobrir as células. Em seguida, retire PBS a partir de células.
      8. Adicionar DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) diluído 1: 1000 em PBS às células durante 15 min.
      9. Remover DAPI elavar as células duas vezes com PBS durante 5 minutos para cada lavagem.
      10. Remover última lavagem e adicione o suficiente PBS para cobrir as células. As células podem agora ser visualizados com um microscópio de fluorescência.

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Representative Results

A Figura 2 mostra o movimento da parte dianteira da célula através do canal em resposta a um gradiente de soro fetal de bovino colocado na extremidade oposta do canal, de onde as células são plaqueadas. A parte dianteira da célula é mostrada em 48 h (Figura 2A), 72 h (Figura 2B), 96 h (Figura 2C), e 120 h (Figura 2D) pós chapeamento. O movimento da frente de celular foi rastreado com estas imagens de lapso de tempo, ea taxa de distância de migração e crescimento foram calculados pela função polyfit MATLAB. A partir deste, a velocidade média da frente da célula verificou-se ser de 13,4 uM / h (Figura 3). A Figura 4 mostra o gradiente fluorescente estabelecida através da colocação de um bloco de agarose embebido dextrano a uma extremidade do canal e permitindo que o dextrano de se difundir através do canal durante 12 h. Uma imagem de lapso de tempo foi feita a cada hora, e a fluorescência através da distância de o canal foi medida e representada graficamente como se mostra na Figura 4, e em comparação com um modelo de difusão 1D.

Figura 2
Figura 2: Cell Movimento Frente. imagens de lapso de tempo de frente da célula na câmara de microcanais movendo-se através do canal. A frente de células marcadas em linhas de laranja, ea distância de migração é incluído. Esta distância de migração foi medida a partir da marcação da chapa para a frente da frente da célula como mostrado. A barra de escala 1 mm é mostrado no branco. A) 48 h após o plaqueamento, B) 72 h após o plaqueamento, C) 96 h após o plaqueamento, D) 120 h pós chapeamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Taxa de crescimento de cálculo. Celular movimento frente rastreados com imagens de lapso de tempo. A taxa de crescimento foi calculada utilizando a função polyfit MATLAB (roipoly) para se obter a velocidade média da frente da célula de 13,4 uM / h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Gradiente fluorescente com dextrano. A intensidade de fluorescência medido através da distância do canal, onde cada linha representa o gradiente a uma determinada hora. ImageJ foi usada para calcular a intensidade de fluorescência. Isso pode ser feito usando o Analisar | Ferramenta da medida. Primeiro, escolha Definir Medidas sob Analisar e seleccionar intensidade. Em seguida, escolha medida ao abrigo Analisar a fim de obter avraiva intensidade pixel. Isto pode ser representada graficamente em função da distância em microns como ilustrado nesta figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A nossa câmara de microcanal pode ser utilizado para uma variedade de fins, incluindo a determinação da taxa de migração celular em resposta a factores de crescimento e quimioatractores e medindo a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero. É possível utilizar a câmara de microcanais para crescer as células e colocar um quimioatractor numa extremidade da câmara. As células crescem em resposta ao quimioatraente, e a migração de células pode ser quantificada tomando imagens de lapso de tempo que podem ser analisados ​​de modo a determinar a taxa de migração celular. Os resultados representativos deste método são apresentados na Figura 3, onde a taxa de crescimento foi determinado ser de 13,4 uM / h, através da função polyfit MATLAB.

Outra utilização do nosso câmara de microcanais é medir a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero. Um dextrano fluorescente etiquetado com um peso molecular semelhante ao fármaco de interesse pode ser utilizado para modelar a difusão do Drug de interesse. É importante notar que as amostras devem ser manuseados com cuidado, uma grande quantidade de convecção vai perturbar o gradiente. Os resultados representativos deste método são apresentados na Figura 4. Uma vantagem deste modelo em comparação com o ensaio de câmara de Boyden é que ele é mais aplicável a tipos de células aderentes por causa da superfície plana; Considerando que, as células devem cair através de um pequeno tubo na câmara de Boyden antes de aderir. Outra limitação do ensaio de câmara de Boyden é que é um ensaio de ponto final; Assim, a quimiotaxia não pode ser observada visualmente. Em contraste, com o nosso método, quimiotaxia é observada por meio das imagens de lapso de tempo 9. O uso de micropipetas contendo quimioatractores também têm sido utilizados um método de observar a migração celular. No entanto, a principal desvantagem deste método é a baixa taxa de transferência 10. A câmara de quimiotaxia de Dunn é outro ensaio que é usado em conjunto com imagiologia de lapso de tempo como the método detalhado aqui 11, 12. A câmara é constituída por dois círculos concêntricos esculpidos na face da lâmina de vidro, a fim de criar um poço de interior e exterior, e uma ponte separa os dois poços. O quimioatraente é colocada no poço externo, e as células são deixadas a migrar a partir do poço interno ao poço externo. Esta migração é quantificado através de imagens de lapso de tempo que são analisados ​​usando o software de análise de imagem. Semelhante ao ensaio de Boyden, uma das limitações do ensaio de câmara de Dunn é que ele não pode ser facilmente modificado para criar gradientes de concentração do factor costume solúveis.

Outra técnica simples para avaliar a migração celular é um in vitro arranhar 13. Este método é rápido e barato, pois só requer a criação de um arranhão na monocamada de células e captura de imagens de lapso de tempo de migração de células próximas ao zero criado anteriormente. However, a grande desvantagem deste método é que ele não é adequado para medir as respostas a um gradiente de concentração do factor química. O nosso método oferece o potencial para criar um gradiente químico e para quantificar a migração celular em relação ao gradiente químico. O nosso método pode ser combinado com o método de zero como um arranhão podem ser criados na monocamada de células, ao passo que um factor quimiotáctico está presente em um dos poços na câmara de microcanais. Isto permite a quantificação e modelagem de cicatrização de feridas. Uma outra aplicação potencial do nosso dispositivo é para determinar a resposta das células de cancro a agentes que inibem o crescimento celular.

Outros sistemas de microfluidos com base também têm sido utilizados para estudos de migração de célula 14, 15. Estes estudos utilizam técnicas litográficas com quartos limpos para criar moldes de mestre em silício e / ou usinagem a laser para criar canais microfluídicos em wafers de silício. wafe Siliconr micro usinagem pode ser caro em comparação com o nosso método que utiliza materiais mais baratos (PDMS e acrílico) para a fabricação de uma câmara de microcanais. Nosso dispositivo supera a limitação de outras PDMS com base dispositivos microfluídicos em que não foi possível criar pequenos canais 3D 15. Com o nosso método, temos criado com sucesso dispositivo baseado PDMS com canais de pequeno diâmetro. Outros estudos têm utilizado um dispositivo de microfluidos com base em PDMS com duas camadas de microcanais e um misturador de gás multi-canal que é controlado por computador, a fim de criar gradientes de oxigénio arbitrários para estudar a migração de células, sob diferentes gradientes de oxigénio 16. Existe um potencial para o nosso dispositivo para ser utilizado de uma maneira semelhante com a adição de uma câmara de mistura de gás numa extremidade da câmara de microcanais.

dispositivos microfluídicos são muitas vezes feitas utilizando técnicas litográficas suaves; estas podem ser adaptadas para criar chambe migração celularrs. Estes métodos envolvem a impressão de uma máscara com padrões de canal com desenho assistido por computador (CAD). Estas máscaras são então projetadas em um molde mestre revestido com um fotossensível resistir através de litografia óptica. Depois de o molde mestre é feita, PDMS é vertida sobre o mestre e deixou-se endurecer, de modo a criar um molde PDMS que pode ser utilizado para estudos de microfluidos 17, 18, 19. Compostos Quimioatraentes ou chemorepulsive são colocados na câmara de alta concentração em um dos reservatórios para criar gradientes de 17. Embora estas técnicas são semelhantes ao nosso conjunto, eles podem ser caras devido ao alto custo de criação do molde mestre para o sistema e a utilização de salas limpas. Além disso, estes métodos podem ser difícil para os alunos a aprender em um ambiente baseado em classes. As pastilhas utilizadas na nossa configuração para criar os canais podem ser criadas com uma variedade de métodos, incluindo pr 3Dinting e corte a laser. Assim, o nosso sistema permite a criação de uma grande variedade de moldes de custo relativamente baixo particularmente como impressão em 3D torna-se mais acessível e amplamente disponível.

PDMS com base microcanais para medir a migração de células e de crescimento têm sido utilizados para uma vasta gama de aplicações. Por exemplo, em Neuroscience Research estuda 20, os dispositivos foram fabricados usando técnicas de litografia macia em que o componente de PDMS foi colocado num prato de cultura de tecidos ou de vidro, a fim de formar dois compartimentos que foram separadas por uma barreira física com ranhuras micronizadas para permitir neurônios a crescer entre os compartimentos. imagens de lapso de tempo foram levados para mostrar neurônios que atravessam a barreira. O método de micropatterning usado para produzir este dispositivo é complexo, enquanto que o método de produção para o dispositivo é simples e pode ser utilizado por pesquisadores em todos os níveis. Outro estudo também utilizou um método de baixo custo fácil para produzir uma siDispositivo de microfluidos Milar PDMS usando um molde mestre criado a partir de fita adesiva, de modo a criar uma impressão nas PDMS para produzir microcanais. Uma vantagem da nossa abordagem sobre a descrita neste método é que os canais no nosso método são fabricados num passo, enquanto este protocolo exige a adesão entre duas camadas de PDMS o que cria problemas de circulação do meio para as células 21.

Em conclusão, o método da câmara de microcanais é personalizada e pode ser usado para obter resultados diferentes. O método permite a criação de um gradiente de concentração, a fim de se adequar às necessidades do utilizador. Além disso, o nosso dispositivo oferece uma vantagem sobre os dispositivos existentes devido ao seu custo relativamente baixo e facilidade de uso para os investigadores de todos os níveis.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Os autores reconhecem Programa criativo Inquérito da Universidade de Clemson e NSF CBET1254609 por fornecer financiamento para este projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Sigma-Aldrich 761036 poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent
Acrylic Sheets US Plastic 44200
Disposable Petri Dishes  Falcon  25373-041
Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO Sigma-Aldrich A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Fisher Scientific 11965092 Cell media components
Fetal Bovine Serium Fisher Scientific 16000036 Cell media components
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15140148 Cell media components
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP24384
EVOS XL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific AME3300 Instrument used for taking time-lapse images
Versa Laser Universal Laser Systems, Inc.  Model number VLS2.30 Laser cutter used for cutting plastic

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References

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