Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chowdhury, A. N., Vo, H. T., Olang, S., Mappus, E., Peterson, B., Hlavac, N., Harvey, T., Dean, D. A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration. J. Vis. Exp. (121), e55264, doi:10.3791/55264 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cel migratie is een essentieel onderdeel van het immuunsysteem, groei en wondgenezing. Celmigratie is een complex proces dat interacties tussen cellen, de extracellulaire matrix en oplosbare en niet oplosbare chemische factoren (bv chemoattractanten) omvat. Standaardwerkwijzen voor het meten van de migratie van cellen, zoals de Boyden kamer assay, werken door het tellen van cellen aan weerszijden van een scheidingswand. Deze technieken zijn gemakkelijk te gebruiken; echter, bieden ze weinig geometrische aanpassing voor verschillende toepassingen. Daarentegen kan microfluïdische inrichtingen worden gebruikt om celmigratie met aanpasbare concentratiegradiënten van oplosbare factoren 1, 2 nemen. Echter, methoden voor het maken van microfluidics gebaseerde testen moeilijk om te leren.

We beschrijven hier een eenvoudige methode om celkweek kamers om celmigratie te meten in respons op chemische concentratiegradiënten. Onze cel migratie kamermethode kunnen verschillende lineaire concentratiegradiënt te creëren om celmigratie te bestuderen voor verschillende toepassingen. Deze methode is relatief eenvoudig te gebruiken en wordt typisch uitgevoerd door studenten.

Het microkanaal kamer werd gecreëerd door het plaatsen van een acryl inzetstuk in de vorm van de uiteindelijke microkanaal kamer tot in een petrischaal. Hierna werd poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) bovenop het inzetstuk gegoten. De PDMS werd uitharden en vervolgens werd het inzetstuk verwijderd. Dit liet de creatie van putjes in elke gewenste vorm of grootte. De cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de microkanaal kamer en oplosbare middelen kan op een van de putjes toegevoegd door weken een agarose blok in de gewenste stof. De agarose blok wordt toegevoegd aan één van de putjes, en time-lapse beelden kunnen houden met het microkanaal kamer om celmigratie te kwantificeren. Variaties van deze methode kan worden gemaakt voor een bepaalde toepassing, waardoor deze methode higHLY aanpasbaar.

Protocol

1. Het produceren van een Microchannel Kamer tot een concentratie Gradient Maak

  1. Cutting een acryl mal stuk
    1. Zorg voor een stukje van acryl van de gewenste breedte. Typisch gebruiken 16/01-inch dikke acrylplaten. Dikkere platen zijn moeilijk goed en zeer dunne platen gesneden niet de vereiste mechanische sterkte, waardoor ze kunnen barsten of kromtrekken tijdens het proces.
    2. Maak een CAD-bestand met de gewenste vorm van de acrylstuk om een ​​holte in het polydimethylsiloxaan (PDMS) te produceren. Pas de breedte en lengte kanaal naar de gewenste gradiënt afzonderlijke experimentele protocollen relevant bereiken.
      1. Hier, gebruik een acrylstuk van de volgende afmetingen: twee velden (0,254 cm x 0,254 cm) die door een 0,127 cm breed kanaal (0,254 cm) (figuur 1).
    3. Importeer het CAD-bestand in het lasersnijden apparatuur en plaats de acryl stuk in een laser cutter volgens de manubrikant's protocol.
      OPMERKING: U 3D-print het stuk uit de CAD-ontwerp. Het voordeel van deze methode is dat alternatieve materialen kunnen worden gebruikt voor de matrijs; echter, kan de resolutie en reproduceerbaarheid worden verminderd met 3D-printen in vergelijking met lasersnijden.

Figuur 1
Figuur 1: Computer-Aided Design (CAD) Vertegenwoordiging van Microchannel Kamer. Dit beeld schildert de CAD-tekening van de acryl liner nodig is om de microkanaal kamer te creëren. 1 A) Bovenaanzicht van CAD-tekening, 1B) Zijaanzicht van de CAD-tekening met afmetingen in inches, 1C) Bovenaanzicht van CAD-tekening met afmetingen in inches Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Het gieten van de polydimethylsiloxaan (PDMS)
    1. In een gewichtboot, meng 10 gewichtsdelen commercieel Elastomer Base (bv Sylgard 184) met 1 gewichtsdeel commercieel elastomeer verharder (bijvoorbeeld Sylgard 194). Kenmerkend Meng 10 g elastomeer Base 1 g elastomeer verharder.
    2. Roer de basis en verharder combineren met een micropipet voor 5 min.
    3. Het opzetten van een vacuüm bel en leg de wegen boot met PDMS in het vacuüm gedurende 30 minuten om ingesloten luchtbellen te verwijderen.
    4. Schakel het vacuüm en verwijder de wegen boot. Giet de PDMS op de top van de acryl cut-out in een kleine petrischaal. Zorg ervoor dat het PDMS volledig bedekt de insert.
    5. Laat de PDMS een nacht uitharden (minimaal 18 uur) bij kamertemperatuur.
  1. Het verwijderen van het inzetstuk van PDMS
    1. Na het uitharden van de PDMS, verwijder het inzetstuk door het zorgvuldig snijden van de PDMS rond de acrylstuk met een scalpel.

    2. Plating de cellen in een Microchannel Kamer

    1. Steriliseren van de kamer voor plating cellen.
      OPMERKING: Terwijl PDMS kunnen worden gesteriliseerd met ethyleenoxide of andere technieken, een snelle UV-behandeling is snel, goedkoop en voldoende celcultuuronderzoeken. De duur korte UV-behandeling geen afbreuk doen aan de structuur of de mechanische integriteit van het PDMS stuk.
      1. In een standaard celkweek kast, volledig bedekken de kamer met 70% ethanol.
      2. Zet de petrischaal in laminaire stroming kap met de deksels af.
      3. Sluit de kap en zet de UV-licht. Blootstellen aan UV-licht voor 1-2 uur.
      4. Open de laminaire stroming kap en wacht 15 minuten om de stroom te herstellen.
      5. Verwijder de 70% ethanol.
      6. Was de kamers tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik 1 ml PBS voor elke wasbeurt. Verwijder PBS en laat de kamers een nacht drogen met de deksels af.
        NB: In plaatsvan het gebruik van een laminaire stroming kap, gebruik maken van een UV-kamer box voor sterilisatie als die beschikbaar is. Wordt UV box door een UV-lichtbron in de rug van een kartonnen doos bekleed met aluminiumfolie. De aluminiumfolie reflecteert het licht zodat zelfs verlichting van het monster.
    2. Plating Cellen in Kamer
      1. Tellen cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer.
        1. Voeg 100 ul van de celsuspensie 400 pi van 0,4% trypan blauw en meng voorzichtig. Breng 100 pi van deze oplossing aan de hemocytometer door beide kamers voorzichtig vullen onder het dekglaasje.
        2. Gebruik een microscoop met een 10X objectief te richten op het raster op de hemocytometer. Gebruik een hand telapparaat om de live ongekleurde cellen te tellen binnen een set van 16 vierkantjes op de hemocytometer.
        3. Aantal cellen in alle 4 sets van 16 vakjes. Neem het gemiddelde celgetal van de 4 sets van 16 pleinen en vermenigvuldig dat met 5x10 4. Dit laatste nummer is de numbeR cellen / ml in de celsuspensie.
      2. Voeg 2500 cellen aan één putje in elke kamer. Dit vertaalt zich naar een bijna-confluente celdichtheid van ~ 30.000 / cm2.
      3. Een cel in staat om in de kamer zitten 60 minuten voor het toevoegen van medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine).

    3. Dextran Soaked Agarose Blocks

    1. Het creëren van een agarose blok
      1. Pour 3% agarose bij 3D geprint matrijs (2 mm x 2 mm x 2 mm).
      2. Laat de agarose te stollen in een vacuümkamer gedurende 30 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen.
      3. Verwijder de agarose blok van de mal.
        OPMERKING: U pour 3% agarose in kleine petrischaal bij een dikte van 2 mm. Snijd een 2 mm x 2 mm x 2 mm blok met behulp van een scalpel of een ander snijgereedschap. Dit is niet zo nauwkeurig als de mal systeem, maar het kan een beetje makkelijker om te doen.
    2. volledig submerge de agarose blok in een oplossing van de gewenste concentratie van de chemotactische factor. Om het verloop formatie concentratie te beoordelen, spoel de kamer eerst met fluorescerende dextran. De concentratie en het molecuulgewicht dextran moet overeenkomen met die van een oplosbare factor of geneesmiddel plaats.
    3. Week de agarose blok 's nachts.

    4. Time-lapse van de dextran Diffusion de Oplosbare Factor concentratiegradiënt Assess

    1. Plaats de dextran gedrenkt agarose blok in een klein plein putje van de microkanaal kamer.
    2. Plaats de microkanaal kamer in een cell imaging-systeem of gebruik een andere fluorescentiemicroscoop met een time-lapse vermogen. Begin de time-lapse volgens de instructies van de fabrikant.
      LET OP: De getoonde resultaten zijn genomen met GFP filter, 50% licht, 4/10 pH en 4X vergroting.

    5. Time-lapse van de celgroei

    1. Plaat cellen in het microkanaal kamer aan één uiteinde van dekamer. Hier, gebruik 3T3 fibroblasten. Voeg 2500 cellen om een ​​goed in de microkanaal kamer. Aantal cellen zoals beschreven in 2.2.1.
      1. Een cel in staat om in de kamer zitten 60 minuten voor het toevoegen van medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine). Houd de microkanaal kamer met geplateerde cellen bij 37 ° C in 5% CO2. Celmigratie door het kanaal kunnen worden bekeken met een microscoop.
      2. Voeg een merker of een microscopische defect in de kamer als een marker om te dienen als een startpunt om de afstand kwantificeren cel voorzijde beweegt.
    2. Instelling van een gradiënt door het plaatsen van een agarosegel (8 mm 3 blokken) met de geconcentreerde groeifactor, chemo-attractant, drug of andere factor getest (hier, 40% FBS wordt als voorbeeld) aan één uiteinde van het microkanaal kamer.
    3. Neem de time-lapse beelden van de bewegende cel front. Hier, de resultaten tonen beelden van de cel weernt die werden elke 12 h en een beeldvormingssysteem genomen.
    4. Gebruik foto's van de cel voor naar cel groei te kwantificeren. Bereken de groei door eerst met behulp van de MATLAB polyfit functie (roipoly) om een ​​veelhoekige masker gedefinieerd door de cel front, het kanaal muren, en de referentie-marker te creëren. De afmetingen van dit masker op de migratie afstand van de voorste waaruit gemiddelde celgrootte voor snelheid wordt berekend. Andere studies hebben een soortgelijke methode 8 toegepast.
      Opmerking: Vergelijk de rand van de celgroei front op elk frame om de concentratie van de oplosbare factor op dezelfde afstand. De oplosbare factor concentratiegradiënt wordt berekend aan de hand van een 1D diffusie model benadering.
    5. Neem fluorescerende beelden van de cellen met behulp Phalloidin en DAPI kleuring.
      1. Fix cellen vóór kleuring met Phalloidin.
        1. Warm 4% paraformaldehyde bij 37 ° C.
        2. Voeg genoeg 4% paraformaldehyde aan cellen dekken. Houd cellen in deparaformaldehyde gedurende 10 min.
        3. Spoel tweemaal met PBS gedurende 15 minuten elke keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten.
      2. PBS verwijderen van cellen en voeg genoeg permeabilisatie-oplossing (0,1% Triton X-100 in PBS) aan cellen dekken. Laat gedurende 10 min.
      3. Was tweemaal met PBS gedurende 5 min per keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten.
      4. PBS verwijderen van cellen en voeg blokkeeroplossing (1% runderserumalbumine in PBS) gedurende 20 min.
      5. Verwijderen blokkerende oplossing en was 2x met PBS gedurende 5 min per keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten.
      6. Vanaf dit punt, cellen beschermen tegen licht met aluminiumfolie wanneer niet in gebruik. PBS verwijderen van cellen en voeg Phalloidin 488 verdund 1:50 in PBS gedurende 1 uur.
      7. Was 2 keer in PBS gedurende 5 min per wasbeurt. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten. Verwijder vervolgens PBS uit cellen.
      8. Voeg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) verdund 1: 1000 in PBS cellen gedurende 15 min.
      9. Verwijder DAPI enWas de cellen tweemaal met PBS gedurende 5 min per wasbeurt.
      10. Verwijder laatste wasbeurt en voeg genoeg PBS aan cellen te dekken. Cellen kunnen nu worden afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2 toont de beweging van de voorste cel over het kanaal in reactie op een gradiënt van foetaal runderserum geplaatst aan het andere uiteinde van het kanaal waar de cellen worden uitgeplaat. De cel voorzijde is getoond bij 48 uur (Figuur 2A), 72 h (figuur 2B), 96 h (figuur 2C) en 120 uur (Figuur 2D) na plating. De beweging van de cel voorzijde werd gevolgd met deze time-lapse beelden, en de migratie afstand en groeisnelheid werden berekend door de MATLAB polyfit functie. Hieruit werd de gemiddelde celgrootte voorste snelheid bleek 13,4 micrometer / uur (figuur 3) zijn. Figuur 4 toont het fluorescerende gradiënt ingesteld door een dextran doorweekte agarose blok aan één uiteinde van het kanaal en waardoor dextran diffunderen door het kanaal 12 uur. Een afbeelding time-lapse werd genomen op elk uur, en de fluorescentie over de afstand van het kanaal werd gemeten en uitgezet zoals getoond in figuur 4 en vergeleken met een 1D verspreidingsmodel.

Figuur 2
Figuur 2: Cel Frontbeweging. Time-lapse beelden van de cel front in de microkanaal kamer bewegen door het kanaal. De cel voorste gemarkeerd in oranje lijnen, en de migratie afstand is inbegrepen. Deze migratie werd gemeten afstand van de markering op de plaat aan de voorzijde van de cel voor zoals afgebeeld. Een 1 mm schaal bar wordt getoond in het wit. A) 48 uur na plating, B) 72 uur na de plating, C) 96 uur na plating, D) 120 uur na plating. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

e 3 "src =" / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg "/>
Figuur 3: Growth Rate berekening. Cell voorzijde beweging bijgehouden met time-lapse beelden. De groei werd berekend met behulp van de MATLAB polyfit functie (roipoly) om de gemiddelde cel voor snelheid van 13,4 um / h te leveren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Fluorescent verloop met dextran. Fluorescentie-intensiteit gemeten over de afstand van het kanaal waarbij elke lijn vertegenwoordigt de gradiënt op een bepaald uur. ImageJ werd gebruikt voor de fluorescentie-intensiteit te berekenen. Dit kan gedaan worden met behulp van de Analyze | Measure tool. Kies eerst Set Metingen onder Analyseren en selecteer intensiteit. Kies vervolgens maatregel in het kader analyseren om ave te krijgenrage pixel intensiteit. Dit kan worden uitgezet tegen de afstand in microns zoals getoond in deze figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Onze microkanaal kamer kan worden gebruikt voor een veelheid aan toepassingen, inclusief het bepalen van de celmigratie als reactie op groeifactoren en chemoattractanten en het meten van de diffusiesnelheid van een geneesmiddel vanuit een polymere matrix. Het is mogelijk om onze microkanaal kamer gebruiken om cellen groeien en plaats een chemoattractant aan een einde van de kamer. De cellen groeien in respons op de chemoattractant en de celmigratie kan worden gekwantificeerd door middel van time-lapse beelden dat om de celmigratie percentage voldaan kunnen worden geanalyseerd. Representatieve resultaten van deze werkwijze zijn weergegeven in figuur 3, waarbij de groeisnelheid werd bepaald op 13,4 um / h MATLAB polyfit worden verricht.

Een ander gebruik van onze microkanaal kamer is de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te meten uit een polymeermatrix. Een fluorescent gelabeld dextran van eenzelfde molecuulgewicht aan het geneesmiddel van belang kan worden gebruikt om de diffusie van de dru modellereng belang. Het is belangrijk op te merken dat de monsters zorgvuldig een grote hoeveelheid convectie zal de gradiënt verstoren moeten worden behandeld. De representatieve resultaten van deze werkwijze zijn weergegeven in figuur 4. Een voordeel van dit model in vergelijking met de Boyden kamer assay is dat het toepasselijker hechtende celtypen vanwege het vlakke oppervlak; dat moet de cellen door middel van een klein buisje in de Boyden-kamer vallen voor het naleven. Een andere beperking van de Boyden kamer assay is dat het een eindpunt assay; dus chemotaxis niet visueel waargenomen. In tegenstelling met onze methode, chemotaxis wordt waargenomen door de time-lapse beelden 9. Het gebruik van micropipetten die chemoattractants zijn ook gebruikt een werkwijze voor het waarnemen celmigratie. Echter, het belangrijkste nadeel van deze methode is lage doorvoer 10. De Dunn chemotaxis kamer is een test die wordt gebruikt in combinatie met time-lapse imaging achtige the methode die hier beschreven 11, 12. De kamer bestaat uit twee concentrische cirkels gesneden op het gezicht van het glaasje om een ​​binnenste en buitenste goed te maken en een brug scheidt de twee putten. De chemoattractant is geplaatst in de buitenste goed, en de cellen mogen migreren van de binnenste en de buitenste ook. Deze migratie wordt gekwantificeerd met behulp van time-lapse beelden die worden geanalyseerd met behulp van beeldanalyse-software. Vergelijkbaar met de Boyden test een van de beperkingen van de kamer Dunn test is dat niet gemakkelijk kan worden gewijzigd om gepersonaliseerde oplosbare factor concentratie gradiënten.

Een andere eenvoudige techniek voor het beoordelen van celmigratie een in vitro 13 krassen. Deze methode is snel en goedkoop als het vereist alleen het creëren van een kras in de cel monolaag en het vastleggen van time-lapse beelden van de cel migratie in de buurt van de eerder gemaakte scratch. However, het grote nadeel van deze werkwijze is dat het niet geschikt om chemische reacties op een factor concentratiegradiënt meten. De werkwijze biedt de mogelijkheid om een ​​chemische gradiënt creëren en celmigratie ten opzichte van de chemische gradiënt kwantificeren. Onze werkwijze kan worden gecombineerd met de krasmethode als een kras kan worden gecreëerd in de cel monolaag, terwijl een chemotactische factor in een van de putten in de microkanaal kamer is. Dit maakt de kwantificering en modellen van wondgenezing. Een andere mogelijke toepassing van ons apparaat wordt de responsie van kankercellen middelen die celgroei te remmen.

Andere microfluïdische systemen zijn ook gebruikt voor celmigratie studies 14, 15. Deze studies maken gebruik van lithografische technieken met schone kamers te beheersen schimmels in silicium en / of laser-bewerkingscentrum te creëren om microfluïdische kanalen in silicium wafers te creëren. Silicon wafer microverspaning kan duur zijn in vergelijking met onze methode goedkopere materialen (PDMS en acryl) ingezet om een ​​microkanaal kamer te vervaardigen. Ons apparaat overwint de beperkingen van andere PDMS gebaseerde microfluïdische inrichtingen waar het niet mogelijk om kleine 3D kanalen 15 creëren was. Met onze methode, hebben we met succes gemaakt PDMS-apparaat met een kleine diameter kanalen. Andere studies hebben een PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaat gebruikt met twee lagen van microkanalen en een meerkanaals gas mixer computer bestuurd om willekeurige gradiënten zuurstof creëren om de migratie van cellen te bestuderen onder verschillende gradiënten van 16 zuurstof. De mogelijkheid bestaat ons te gebruiken inrichting op soortgelijke wijze met de toevoeging van een gas mengkamer aan één uiteinde van het microkanaal kamer.

Microfluïdische apparaten worden vaak gemaakt met behulp van zachte lithografische technieken; deze kunnen worden aangepast om celmigratie chambe creërenrs. Deze methoden omvatten het afdrukken van een masker met channel patronen met computer-aided design (CAD). Deze maskers worden vervolgens geprojecteerd op een meester mal bekleed met een lichtgevoelige weerstand te bieden door middel van optische lithografie. Nadat de master mal is gemaakt, wordt PDMS gegoten op de master en uitharden teneinde een PDMS mal die kan worden gebruikt voor studies microfluïdische 17, 18, 19 te creëren. Chemoattractant of chemorepulsive verbindingen worden in deze kamer in hoge concentratie in een van de reservoirs 17 gradiënten creëren. Hoewel deze technieken zijn vergelijkbaar met onze opstelling, kunnen zij duur zijn vanwege de hoge kosten van het maken van de master-mal voor het systeem en het gebruik van schone kamers. Daarnaast kunnen deze methoden moeilijk zijn voor studenten om te leren in een klas op basis van instelling. De inserts in onze opzet om de kanalen te maken kan worden gemaakt met een verscheidenheid van methoden, waaronder 3D printing en lasersnijden. Aldus ons systeem tot het realiseren van een grote verscheidenheid van vormen voor relatief lage kosten bijzonder als 3D printing steeds betaalbaar en overal verkrijgbaar.

PDMS gebaseerde microfluïdische inrichtingen voor het meten van celmigratie en groei zijn gebruikt voor uiteenlopende toepassingen. Bijvoorbeeld in neurologieonderzoek bestudeert 20, inrichtingen werden gefabriceerd met behulp van zachte lithografie technieken waarin PDMS component op een weefselkweekplaat of glas om twee compartimenten die zijn gescheiden door een afscheiding met microscopisch kleine groeven om te vormen werd geplaatst neuronen te groeien over de compartimenten. Time-lapse beelden werden genomen om neuronen het oversteken van de barrière te laten zien. De werkwijze micropatterning gebruikt om dit apparaat te produceren is complex, terwijl de productiemethode voor onze inrichting is eenvoudig en kan worden gebruikt door onderzoekers op alle niveaus. Een andere studie gebruikte ook een eenvoudige methode om tegen lage kosten voor het produceren van een siMilar PDMS microfluïdische apparaat met behulp van een meester mal gemaakt op basis van Scotch tape om een ​​indruk in de PDMS om microkanalen produceren creëren. Een voordeel van onze benadering via een in deze methode beschreven dat de kanalen in onze methode worden vervaardigd in één stap, terwijl dit protocol hechting tussen twee PDMS lagen die problemen mediumstroming naar de cellen 21 creëert vereist.

Concluderend onze microkanaal kamermethode is aanpasbaar en kan gebruikt worden om verschillende resultaten te verkrijgen. De methode maakt het mogelijk voor de oprichting van een concentratie gradiënt om de behoeften van de gebruiker aan te passen. Bovendien zijn onze apparaat biedt een voordeel ten opzichte van bestaande apparaten te wijten aan de relatief lage kosten en gebruiksgemak voor onderzoekers op alle niveaus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

De auteurs erkennen Clemson University's Creative Inquiry programma en NSF CBET1254609 voor het verstrekken van financiering voor dit project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Sigma-Aldrich 761036 poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent
Acrylic Sheets US Plastic 44200
Disposable Petri Dishes  Falcon  25373-041
Fluorescein isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO Sigma-Aldrich A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Fisher Scientific 11965092 Cell media components
Fetal Bovine Serium Fisher Scientific 16000036 Cell media components
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15140148 Cell media components
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP24384
EVOS XL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific AME3300 Instrument used for taking time-lapse images
Versa Laser Universal Laser Systems, Inc.  Model number VLS2.30 Laser cutter used for cutting plastic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24, (21), 3563-3576 (2003).
  2. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, (3), 164-167 (2004).
  3. Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
  4. Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
  5. Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
  6. Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. (2011).
  7. Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
  8. Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203, (4), 691-709 (2013).
  9. Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
  10. Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. 125-135 (2014).
  11. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99, (4), 769-775 (1991).
  12. Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 31-41 (2005).
  13. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  14. Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
  15. Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18, (04), 816-828 (2012).
  16. Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10, (3), 388-391 (2010).
  17. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, (1), 013412 (2011).
  18. Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. 167-177 (2006).
  19. Tang, S. K., Whitesides, G. M. Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. McGraw-Hill, 2010. (2010).
  20. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19, (5), 1551-1556 (2003).
  21. Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics