إجراء شامل لتقييم

JoVE Journal
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tang, J., Pérez-Medina, C., Zhao, Y., Sadique, A., Mulder, W. J. M., Reiner, T. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines. J. Vis. Exp. (121), e55271, doi:10.3791/55271 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مستوحاة من نجاح طب النانو السرطان السابق في العيادة، وقد ولدت الباحثون عدد كبير من الصيغ الجديدة في العقد الماضي. ومع ذلك، فقد تمت الموافقة على عدد صغير فقط من طب النانو للاستخدام السريري، في حين أن غالبية طب النانو تحت التطوير السريري قد أسفرت عن نتائج مخيبة للآمال. وتتمثل إحدى العقبات الرئيسية لترجمة السريرية الناجحة لطب النانو السرطان الجديد هو عدم وجود فهم دقيق للفي الجسم الحي أدائها. تتميز هذه المقالة إجراء صارم لوصف السلوك في الجسم الحي من طب النانو في الفئران الورم الحاملة في المنهجية، والنسيج، وحيدة الخلية، ومستويات التحت خلوية من خلال دمج انبعاث البوزيترون التصوير المقطعي التصوير المقطعي (PET-CT)، وأساليب النشاط الإشعاعي الكمي ، التدفق الخلوي، والفحص المجهري مضان. باستخدام هذا النهج، يمكن للباحثين تقييم بدقة التركيبات النانوية الجديدة في نماذج الفئران ذات الصلة canceص. قد يكون لهذه البروتوكولات القدرة على تحديد طب النانو السرطان الواعدة مع إمكانية متعدية عالية أو للمساعدة في تعظيم الاستفادة من طب النانو السرطان للترجمة في المستقبل.

Introduction

النانوي يتحول نموذج التنمية علاج السرطان 1. مستوحاة من التأثير الطبي الهائل من طب النانو السرطان السابق، مثل liposome- وnanotherapies القائم على الزلال وقد تم إنتاج العديد من الصيغ الجديدة في العقد الماضي. بيد أن التحليلات الأخيرة لنجاح الترجمة السريري لهذه طب النانو السرطان تشير إلى أنه ليس هناك سوى عدد قليل منهم قد تمت الموافقة على استخدام السريري 5. وتتمثل إحدى العقبات الرئيسية لترجمة السريرية للطب النانو جديد للسرطان هي تحسينها محدود للمؤشر العلاجية مقارنة مع الادارة مباشرة من المركبات العلاجية المجانية 6. على هذا النحو، وتقييم دقيق للأداء في الجسم الحي من طب النانو في المنهجية، والنسيج، ومستويات الخلايا في النماذج الحيوانية قبل السريرية ضرورية لidentifذ تلك مع مؤشرات العلاجية المثلى للترجمة السريرية في المستقبل.

يمكن أن المواد النانوية يكون رديولبلد لتوصيف الكمي في الحيوانات التي تعيش مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير، والذي لديه حساسية ممتازة والتكاثر بين جميع طرائق التصوير السريرية 7. على سبيل المثال، 89 عنصر الزركون المسمى اتسمت طب النانو في نماذج الماوس لسرطان 10، وكذلك في نماذج الأمراض الأخرى 11 المنتشرة منذ فترة طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نصف عمر الدم وbiodistribution من طب النانو يمكن تقييمها على نطاق واسع باستخدام القياسات الإشعاعية خارج الجسم في الأنسجة الفردية 8. لذلك، radiolabeling يسمح للتقييم الكمي للطب النانو في مستويات النظامية والأنسجة.

الأهم من ذلك، radiolabeleطب النانو د عموما لا يمكن تحليلها على خلية واحدة أو مستويات التحت خلوية نظرا لدقة المكاني المحدود للإشارة المشعة. لذلك، ووضع العلامات الفلورية يبرهن على أن تكون طريقة تكميلية لتقييم النانوية مع تقنيات التصوير الضوئي مثل التدفق الخلوي ومضان المجهري 12. تحقيقا لهذه الغاية، النانوية المسمى مع النظائر المشعة والعلامات الفلورية يمكن تقييمها كميا في الحي بواسطة التصوير النووي وخارج الحي من قبل العد النشاط الإشعاعي، ويمكن أيضا أن تكون وصفت على نطاق واسع على المستوى الخلوي عن طريق التصوير الضوئي.

سابقا، وقد وضعنا إجراءات معيارية لدمج تسميات المشعة والفلورية في مختلف النانوية، بما في ذلك البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) 11، الجسيمات الشحمية 10، النانوية البوليمرية، شظايا الأجسام المضادة، وnanoemulsions 10 و 13. وقد سمحت هذه الجسيمات النانوية وصفت لتوصيف الكمي في النماذج الحيوانية ذات الصلة على مختلف المستويات، والتي وجهت تعظيم الاستفادة من هذه المواد النانوية لتطبيقات محددة. في الدراسة الحالية، والهدف من ذلك هو استخدام الجسيمات النانوية، وliposomal منصة النانوي الأكثر رسوخا 14 -كما مثالا للتدليل إجراءات شاملة لتوليد جسيمات متناهية الصغر المزدوج وصفت وإلى تميز بدقة في كلاسيكية سرطان الجلد مسانج B16-F10 نموذج الفأر 15 . من النتائج، ونحن واثقون من هذا النهج توصيف جسيمات متناهية الصغر يمكن تكييفها لتقييم طب النانو السرطان الأخرى في نماذج الفئران ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتكون هذا الإجراء من وضع العلامات مزدوج المشعة والفلورسنت النانوية، في الجسم الحي PET-CT التصوير، وخارج الحي القياسات biodistribution، وخارج الحي المناعية والتدفق الخلوي التحليلات. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان.

1. إعداد الليبوزومات المسمى ثنائي

ملاحظة: مسانج B16 أورام سرطان الجلد يمكن أن يتسبب عن طريق حقن خلايا 300000 B16-F10 في الأجنحة الخلفية C57BL / 6 الفئران تحت التخدير من استنشاق 2٪ -isoflurane التي تحتوي على الأوكسجين. استخدام الكواشف والأدوات المعقمة في مساحة عمل عقيم أثناء الجراحة. بعد الجراحة، ومراقبة بعناية الحيوانات حتى شفائهم من التخدير. وضع الحيوانات مرة أخرى في أقفاصها فقط عندما يستعيد وعيه الكامل والتنقل. إيوائهم في غرف معقمة للحيوانات مع الاورام xenografted. الأورام مع حجممن 300 مم 3 مثالية لتوصيف جسيمات متناهية الصغر بسبب بهم وضوحا تعزيز النفاذية والاحتفاظ الآثار (الثوري)، والتي يمكن أن تزيد من تراكم جسيمات متناهية الصغر. وتقدم بروتوكولات مفصلة أدناه.

  1. في قارورة ذهابا والقاع، ويحل خليط من 20 ملغ من الدهون في 2 مل من الكلوروفورم التي تحتوي على 1،2-dipalmitoyl- التعطيل -glycero-3-phophocholine (DPPC)، والكولسترول، 1،2-disearoyl- التعطيل -glycero- 3-phosphoethanolamine بولي (جلايكول الإثيلين) 2000 (DSPE-PEG2000)، DSPE-ديفيروكسامين (DSPE-DFO) وحمض 1،1-diododecyl-3،3،3،3-tetramethylindodicarbocyanine-5،5-دسلفنك ( DiIC12 [5] -DS) في نسب الرحى من 61.3٪، 33.4٪، 5، 0.2٪، و 0.1٪ على التوالي.
    ملاحظة: هذا التكوين الدهون هي مشابهة جدا لصياغة liposomal من دوكسوروبيسين المستخدمة حاليا في عيادة 2. فإن الجسيمات الشحمية الناتجة عن إجراءاتنا تحاكي عن كثب أداء في الجسم الحي من nanomedic السريريةالمعهد الوطني للإحصاء.
  2. استخدام المبخر الدوار لإزالة المذيبات العضوية وتشكيل لفيلم الدهون رقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني ويصوتن لمدة 30 دقيقة لتوليد الجسيمات النانوية liposomal باستخدام صوتنة طرف 3.8 ملم وسعة 30 واط، مع تبريد كافية على الجليد.
  3. أجهزة الطرد المركزي في حل الحويصلية في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الركام وغسل النانوية مع برنامج تلفزيوني باستخدام الترشيح الطرد المركزي (الوزن الجزيئي قطع (MWCO: 100 كيلو دالتون) لإزالة الدهون حرة والمذيبات العضوية المتبقية التركيز على الجسيمات الشحمية، والتي سوف البقاء في الغرفة العليا، ونقلها إلى أنبوب جديد. ويمكن تخزين الجسيمات الشحمية في الثلاجة في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى 1 قبل أسبوع من خطوات لاحقة.
  4. لمراقبة الجودة، وتوصيف الجسيمات الشحمية التي تشتت الضوء الحيوي (DLS). على وجه التحديد، مزيج 50 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية مع 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ومن ثم نقل الخليط في كفيت التحجيم. ضع كفيت في تحليل وقياس الجسيماتأحجام وتوزيع حجمها. (مؤشر التشتت المتعدد (PDI)) ومن المتوقع أن تكون 90 أحجام الجسيمات وتوزيع حجمها - 120 نانومتر و 0.1 - 0.2 على التوالي.
  5. لradiolabeling، مزيج من الجسيمات الشحمية النقاء، أي ما يعادل 2 ملغ من الدهون، في برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني بين 6.9 و 7.1 مع 1 MCI 89 عنصر الزركون-أكسالات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في أنبوب 1.5 مل، (الحجم الكلي: ~ 100 ميليلتر). إزالة الحرة، غير المتفاعل 89 عنصر الزركون عن طريق الترشيح الطرد المركزي (MWCO = 100 كيلو دالتون)، على غرار الخطوة 1.3. غسل retentate مع برنامج تلفزيوني العقيمة وتمييع للحجم المطلوب. يجب أن يكون العائد الإشعاعية 80-95٪.
    الحذر! العمل مع المواد المشعة ودرجة عالية من التنظيم. يجب أن تكون معتمدة من المؤسسات وتقديم التسهيلات اللازمة، وتدريب الموظفين، ورقابة صارمة على استخدام النشاط الإشعاعي. يحتاج الباحثون لتلقي التدريب الكافي وارتداء معدات الوقاية الشخصية وحلقات قياس الجرعات / شارات عند التعامل مع النشاط الإشعاعي.
  6. 10. درجات نقاء الإشعاعية أقل من 95٪ تدل على عدم كفاية الغسيل على خطوة 1.5.
  7. بعد radiolabeling، وتحديد حجم الجسيمات النانوية التي تشتت الضوء الديناميكي. ومن المتوقع أن يكون ضمن نفس النطاق مثل القياسات في الخطوة 1.4 10 حجم وPDI.
    ملاحظة: إذا لم يسمح للعينات المشعة في قياس التدفق الخلوي أو مضان المجهر، نات غير المشعة عنصر الزركون-الأكسالات يمكن أن تستخدم لتسمية الجسيمات الشحمية في الخطوة 1.5. هذه الجسيمات الشحمية غير المشعة لها خصائص مماثلة لالنظير من المشعة. ويرد وصف هذا الإجراء في الشكل 2.

2. في فيفو التصوير PET-CT وBiodistribution من الليبوزومات المزدوج المسمى

  1. ضخ نحو 100 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية المزدوج المسمى ثإيث حوالي 300 μCi من النشاط الإشعاعي في الفئران سرطان الجلد ضبط النفس (C57BL / 6، أنثى، 10 - 16 أسبوعا من العمر) من خلال الأوردة الذيل، في حوالي 10 MCI 89 عنصر الزركون / كجم من وزن الجسم.
  2. لتحديد عمر النصف، سحب الدم من الوريد الذيل من الحيوانات تخدير أقل من 2٪ التي تحتوي على الأيزوفلورين الأكسجين باستخدام 28-G المحاقن الأنسولين. جمع الدم (10-20 ميكرولتر) في أنابيب وزنه قبل في 2 دقيقة، 15 دقيقة، 1 ساعة، 4 ساعات، 8 ساعات، 24 ساعة، و 48 ساعة بعد الحقن. تزن الدم عن طريق الفرق، وتحديد محتوى النشاط الإشعاعي باستخدام عداد غاما، وحساب تركيز النشاط الإشعاعي كنسبة مئوية من جرعة حقن للغرام الواحد (٪ ID / ز).
    ملاحظة: تنفيذ الإجراء في غرفة مجهزة بنظام التخدير، وأقفاص الانتعاش، والتدفئة، وغطاء محرك السيارة واقية. تأكد من أن الحيوانات يتعافى تماما وكسب الحراك الطبيعي بعد العملية قبل نقلها من أقفاص الانتعاش إلى عقد أقفاص. بيت الحيوانات الحاملة للورم في الغرف المخصصة للحيوانات التي تدار بالتعاون معالمواد المشعة.
  3. 24 أو 48 ساعة بعد الحقن ل الجسيمات الشحمية، صورة الفئران في الحيوانات الصغيرة MicroPET-CT الماسح الضوئي 10. وضع تخدير الحيوان أفقيا على بطنه وإبقائه تخدير. إدارة 2٪ الأيزوفلورين الأكسجين من خلال مخروط الأنف. تطبيق مرهم للعين لعينيها قبل الفحص لمنعهم من الجفاف.
  4. تنفيذ كامل الجسم PET ثابت مسح تسجيل 50 مليون على الأقل أحداث متزامنة، مع المدة التقريبية لمدة 15 دقيقة. تعيين إطار توقيت الطاقة وصدفة في 350-700 كيلو و 6 م، على التوالي. بعد ذلك، إجراء فحص 5 دقائق التصوير المقطعي (CT). تعيين أنبوب الأشعة السينية لجهد 80 كيلو فولت وتيار 500 أمبير. يستخدم الاشعة المقطعية 120 الخطوات الدوران لما مجموعه 220 درجة، مع ما يقرب من 145 مللي ثانية في إطار 10.
  5. بعد الفحص PET-CT، التضحية فورا الفئران خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون وتأكيد الوفيات pinchiنانوغرام الكفوف من الحيوانات. أكد مرة واحدة، نفذ الخلع عنق الرحم.
  6. إزالة الدم في الأنسجة الماوس عن طريق خفض أولا فتح الأذين الأيمن ومن ثم حقن 20 مل PBS إلى البطين الأيسر، وبعد ذلك جمع الأنسجة ذات الصلة مثل ورم والكبد والطحال والرئة والكلى والعضلات، وغيرها (16).
  7. وزن الأنسجة، قياس محتوى النشاط الإشعاعي من قبل جاما عد وحساب تراكم النشاط الإشعاعي الأنسجة كنسبة مئوية من الجرعة المحقونة في غرام (٪ ID / ز).

3. فيفو السابقين التدفق الخلوي والمناعية

ملاحظة: حقن حوالي 100 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية الفلورسنت في الفئران سرطان الجلد من خلال الوريد الذيل بجرعة 0.5 ملغ من الصبغة لكل كيلوغرام من وزن الجسم. إذا لم يسمح للعينات المشعة في قياس التدفق الخلوي ومضان المجهر، يجب أن تستخدم الجسيمات الشحمية غير المشعة.

  1. التضحية الفئران 24 ساعة بعد الحقن، كما في الخطوة 2.5، وجمع الأورام، التي يجب تخزينها في برنامج تلفزيوني الباردة.
  2. لالتدفق الخلوي، اتبع الخطوات التالية (17):
    1. إعداد كوكتيل انزيم التي تتكون من خليط من النقاء كولاجيناز الأول والثاني (4 U / مل)، هيالورونيداز (60 U / مل)، والدناز أنا (60 U / مل) في التدفق الخلوي عازلة (PBS مع 0.5٪ BSA و1 ملي EDTA).
    2. مزيج 100 ملغ من نسيج الورم مع 200 ميكرولتر من العازلة كوكتيل انزيم في أنبوب 1.5 مل والزهر الأنسجة إلى قطع صغيرة مع مقص غرامة. إضافة 1.3 مل أخرى من كوكتيل انزيم في أنبوب ونقل محتوياته إلى لوحة 6 جيدا.
    3. يهز لوحة 6 جيدا على شاكر الأفقي وضعها داخل الفرن C 37 درجة لمدة 60 دقيقة في 60 دورة في الدقيقة.
    4. غسل جناسة الأنسجة مع التدفق الخلوي عازلة 3 مرات للحصول على تعليق خلية واحدة.
    5. وصمة عار على الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة الخاصة المؤشرات الحيوية بما في ذلك CD45، CD11b، Ly6C، CD11c و،CD64، CD3، MHCII، وCD31 (1: 200 التخفيف لجميع الأجسام المضادة، يتم توفير المعلومات استنساخ في جدول المواد). تحديد أنواع الخلايا ذات الصلة، وتحديد كثافتها متوسط ​​مضان (MFI) من DiIC12 (5) -DS في كل خلية السكان مع تدفق المناسب الخلوي برامج التحليل.
  3. لالمناعية، اتبع الخطوات التالية:
    1. وضع الورم إلى شريط كاسيت مليئة الأمثل القطع المتوسط ​​(أكتوبر) وتجميده في الثلج الجاف.
    2. جعل 6 ميكرون أقسام المجمدة من نسيج الورم ووضعها على شرائح الأنسجة الزجاجية. وينبغي أن تشمل الأقسام أكبر المقاطع العرضية للورم، والتي توفر المعلومات الأكثر تمثيلا على الأنسجة.
    3. وصمة عار على المؤشرات الحيوية (على سبيل المثال، CD31 لخلايا بطانة الأوعية الدموية) في المصالح مع الأجسام المضادة المقابلة (على سبيل المثال، ومكافحة CD31، استنساخ MEC13.3). إصلاح الأجزاء مع امتصاص العرق. منع لهم المصل مطابقة للأصل الأنواع من الأجسام المضادة الثانوية؛ incubأكل مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية، وبعد ذلك مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة. وأخيرا، ويغسل مع برنامج تلفزيوني، وتغطي مع زلات الغطاء. صورة الشرائح ملطخة لايكا مبائر تستقيم SP5 المجهر 13 و 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن هذا الإجراء. ويبين الشكل 2 الإجراء التوليف التخطيطي من الجسيمات الشحمية المزدوج المسمى هو موضح في الخطوة 1 10. الشكل (3) يعرض تمثيلية PET-CT الصورة (الشكل 3A)، النشاط الإشعاعي الكمي من PET التصوير (الشكل 3B)، والدم نصف الحياة (الشكل 3C)، وbiodistribution (الشكل 3D) النانوية المشعة، كما هو موضح في الخطوة 2. في الشكل 3A، والجسيمات الشحمية تتراكم بشكل كبير في الورم، وهو ما يؤكده الكمي لنتائج التصوير في الشكل 3B. وعلاوة على ذلك، تظهر الجسيمات الشحمية في الدم نصف حياة حوالي 10 ساعة في الشكل 3C. وbiodistribution المجراة سابقا يؤكد تراكم ورم كبير من الجسيمات الشحمية. وأخيرا، يقدم الشكل 4 العلاقات العامة النابضة نموذجيةocedure لتحديد الخلايا ذات الصلة في وجود ورم لتحليل مستوى وحيدة الخلية من تراكم جسيمات متناهية الصغر (الشكل 4A و ب)، الذي يعرض تراكم تفضيلي للجسيمات متناهية الصغر في الضامة المرتبطة الورم (TAM). ويظهر صورة المجهر مبائر تمثيلية أيضا التداخل بين الجسيمات النانوية والخلايا البطانية (الشكل 4C).

شكل 1
الشكل 1. تخطيطي لمحة عامة عن النانوي إجراء توصيف في الجسم الحي. ويشمل هذا الإجراء وصفها النانوية مع كل علامات المشعة والفلورسنت. توصيف الجسيمات النانوية رديولبلد مع PET-CT التصوير، وقياسات الدم نصف الحياة، والتقييمات biodistribution. وحيدة الخلية وتحليل الفرعية الخلوي للالنانوية الفلورسنت التدفق الخلوي وأناmmunostaining، على التوالي. التقنيات، من اليسار إلى اليمين، وتوفير زيادة القرار المكانية من جسيمات متناهية الصغر في تراكم في الجسم الحي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. إجراء توليف الليبوزومات المزدوج المسمى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ممثل النتائج من في فيفو توصيف رديولبلد النانوية. (أ) وصور PET-CT من tumoص الحاملة الماوس بعد حقن جسيمات متناهية الصغر والقيم امتصاص (ب) المستمدة PET في أنسجة متعددة (ن = 3). (ج) النشاط الإشعاعي الدم نصف العمر للجسيمات متناهية الصغر رديولبلد، وكذلك (د) biodistribution لها في 24 ساعة بعد الحقن (ن = 3). أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري. تعديل من إشارة 8، مع الإذن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. ممثل النتائج للفي فيفو توصيف نيون النانوية. (أ) إجراء التدفق الخلوي النابضة نموذجية لتحديد الخلايا المرتبطة الورم المناعي، خلايا الورم، والخلايا البطانية (EC)، وكذلك (ب) القياس الكمي لnanopartiتراكم شركة كلي في هذه الخلايا 8. صورة تمثيلية من 3 يكرر البيولوجية. (ج) التمثيلية صورة المناعي تظهر استهداف محدد لnanoemulsion-RGD مترافق إلى الخلايا البطانية في الأورام 13. تعديل من المراجع 8 و 13، مع إذن. بلعم المرتبطة الورم (TAM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوات حاسمة في البروتوكول:

جودة عالية من الجسيمات الشحمية المزدوج المسمى هي المفتاح لتحقيق نتائج متسقة على مدى فترة طويلة من الزمن. الأصباغ الفلورية مجانية أو 89 أيونات عنصر الزركون يمكن أن تولد أنماط استهداف مختلفة تماما ويجب إزالتها تماما خلال خطوة التنقية. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان الجهاز المناعي يؤثر بشكل كبير على الأداء التجريبي السرطان النانوي، وينبغي أن يكون استخدام نماذج الماوس المناعة الأفضل، مثل نموذج سرطان الجلد B16-F10 في C57BL / 6 الفئران، والتي كانت تستخدم في جميع أنحاء هذا البروتوكول. إذا المكروية ورم أو مجموعة معينة من الطفرات الوراثية عاملا رئيسيا، فإن نماذج طعم أجنبي الورم المشتقة من المريض أن الخيارات المثالية.

تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

إجراءاتنا يوفر وسيلة واضحة وموثوقة لتقييم الأداء في الجسم الحي من طب النانو في الورم الحاملة لimals. يخدم هذا الإجراء والعمود الفقري لبناء تجارب محددة لتوصيف طب النانو السرطان لمختلف التطبيقات. على سبيل المثال، يمكن للباحثين تحديد الكمي في الجسم الحي الدوائية من المواد متناهية الصغر عندما يتم تنفيذ مسح PET-CT في نقاط زمنية متعددة على نفس الحيوانات 17؛ يتمكنوا من جمع المعلومات biodistribution من المواد متناهية الصغر من خلال تحليل الأنسجة الأخرى، مثل الأمعاء الغليظة، الأمعاء الدقيقة والبنكرياس والدماغ والجلد والغدة الصعترية، المعدة، أو الغدد اللعابية، كما هو مبين في مطبوعات أخرى 18، 19، 20، 21؛ أو أنها يمكن أن تقيم وحيدة الخلية وخصوصية التحت خلوية من طب النانو في الأنسجة الأخرى ذات الصلة من الأورام من خلال تطبيق هذا التدفق الخلوي والمناعية البروتوكول.

القيود المفروضة على التقنية:

هذه ص بروتوكولequires بعض البحوث المتخصصة البنية التحتية، بما في ذلك الكيمياء الإشعاعية والمرافق والتصوير الخبرة الفنية في radiolabeling، التصوير الحيوانات الصغيرة، وعلم المناعة. وبالتالي، فإنه سيعدم مثالي من قبل فريق متعدد التخصصات من الباحثين من ذوي الخبرة في المجالات ذات الصلة. وتبين تجربتنا الخاصة أن التنفيذ الأمثل لهذا الإجراء يتطلب التخطيط الدقيق والتعاون الفعال.

ومن الجدير بالذكر أن بروتوكولات محددة وكلاء المقترحة في هذه المخطوطة هي الأنسب لradiolabeling النانوية الدهون على أساس. ومع ذلك، فإن مفهوم الجسيمات النانوية المزدوج المسمى يمكن استخدامها لوصف الصيغ جسيمات متناهية الصغر الأخرى التي، على سبيل المثال، على أساس البلورات النانوية الذهب، والبوليمرات، أو حتى جزيئات فيروسية. في هذه الحالات، سوف تكون هناك حاجة استراتيجيات العلامات المختلفة. ومن المهم التأكيد على تشكيلة واسعة من النظائر المشعة المستخدمة في التصوير الطبي الحيوي، بما في ذلك 89 عنصر الزركون، 18 64 النحاس، 68 غ، و 123 وأنا، على سبيل المثال لا الحصر 7. يجب أن يتم الاختيار من النظائر المشعة استنادا إلى خصائص محددة من المواد متناهية الصغر قيد التحقيق، وعلى رأسها في الدورة الدموية نصف حياة، للسماح لتوصيف كامل في نقاط زمنية لاحقة. ومع ذلك، هناك عوامل أخرى، مثل وضع العلامات الكيمياء أو توافر النظير، قد تؤثر على الاختيار النهائي. لهذه الدراسة، تم اختيار 89 عنصر الزركون بسبب الطويلة المادية نصف عمر (ر 1/2 = 78.4 ساعة) يماثل الدم نصف حياة الجسيمات الشحمية. وتجدر الإشارة، يمكن لهذا البروتوكول أيضا أن يؤديها مع النظائر الأخرى، مثل 99m ح (111)، و، أو 125 I، التي تتوفر تجاريا ومناسبة للتصوير مع انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي (SPECT). وبالمثل، تم اختيار DilC بسبب للا مائية العالي وكفاءة تحميل بالتالي ارتفاع في الجسيمات الشحمية. الأصباغ الفلورية الأخرى مع properti الفيزيائية غير المواتيةوفاق يمكن مترافق مباشرة إلى الدهون الفوسفاتية 17.

أهمية تقنيات:

يعرض هذا الإجراء إمكانية متعدية عالية عندما تكييفها لتقييم طب النانو في الدراسات السريرية. 4 تقنيات وهما الرئيسية، والتصوير PET-CT، قياس النشاط الإشعاعي، وتدفق الخلوي، والمناعية، وتستخدم بشكل روتيني لتشخيص الأورام في المرضى. لذلك، هذا الإجراء قبل السريرية يمكن ترجمتها بسهولة إلى تقييم الأداء في الجسم الحي من طب النانو في المرحلة السريرية. وعلاوة على ذلك، فإن حجم أكبر من الأعضاء البشرية بالمقارنة مع الفئران يسمح لتحليل أكثر دقة من PET-CT التصوير 22، والتي يمكن أن تحل محل الغازية على أساس خزعة قياس النشاط الإشعاعي من تراكم النانوي. في هذا الإطار، غير الغازية والبروتوكولات الموجهة التصوير يمكن تطويرها لتطبق المرضى ومساعدة التجانس نتائج المرضى 10. ديفيالتخطي المواد متناهية الصغر مشعة لا يزال يتطلب الاستثمار في البنية التحتية كبير. بدلا من ذلك، وتقنيات التصوير غير المشعة على أساس التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ما فتئت تتطور بسرعة في العقد الماضي. على سبيل المثال، والتصوير الجسيمات المغناطيسية (MPI) يستخدم صغيرة جزيئات أكسيد الحديد (10-20 نانومتر) ويمكن أن توفر تقييما أكثر الكمية بكثير من طب النانو المسمى مع جزيئات أكسيد الحديد في الجسم الحي من تقنيات التصوير بالرنين المغناطيسي الحالية 23. ان الترجمة السريرية لMPI يسمح المزيد من الباحثين على استخدام القوي في تقنيات التصوير المجراة لتقييم الأداء في الجسم الحي من طب النانو السرطان.

التطبيقات المستقبلية:

مرة واحدة إتقان الباحثون هذه البروتوكولات، فإنها يمكن أن تطبق الإجراءات التي تميز معظم الفلورسنت، والمواد الجديدة المشعة المزدوج المسمى، بما في ذلك الببتيدات والبروتينات والأجسام المضادة، وأجزاء الأجسام المضادة، وهكذا دواليك. هذه الإجراءاتيمكن أن يساعد العلماء على تقييم شامل لأداء المجراة من المواد الطبية الحيوية الجديدة والتعرف على أولئك الذين يملكون القدرة متعدية كبيرة.

وفي الختام، فإننا نهدف إلى إدخال إجراء شامل النانوي توصيف التي يمكن أن توفر النظامية، والنسيج، وحيدة الخلية، والمعلومات تراكم المستوى النانوي التحت خلوية. حاليا، فإن غالبية طب النانو السرطان لا تزال تفشل في المرحلة الأولى من التجارب السريرية بسبب الدوائية الخاصة دون المستوى الأمثل، biodistributions، وملامح سمية. من ناحية أخرى، عدم تجانس كبير من استجابة العلاج لالنانوي ينص استراتيجية التصوير رفيق لاختيار المرضى الذين قد يستفيدون بشكل خاص من هذه طب النانو التجريبية. ونحن نعتقد أن اتخاذ هذا الإجراء يمكن أن يساعد المجتمع على تحديد طب النانو واعدة مع إمكانات عالية متعدية في النماذج الحيوانية قبل السريرية، ومع التعديل المناسب، ويمكن أن تساعد أيضا السريريةالباحثون لتحديد المرضى قابلة للnanotherapy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPPC Avantilipids 850355
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
DSPE-PEG2000 Avantilipids 880120P
DSPE-DFO Home made 110634 Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DS AAT Bioquest 22051
Centrifugal filter Vivaproducts VS2061
Rotary evaporator Buchi R-100
Radio-HPLC Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps N/A
89Zr-oxalate MSKCC Synthesized in house TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CT Siemens Inveon Micro-PET/CT
Gamma counter PerkinElmer 2470-0150
Flow cytometry BD Biosciences Fortessa Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice
C57BL/6 mice Jackson Laboratories
B16-YFP melanoma cells Home made N/A Salmon et al., Immunity, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7 128025 Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC 107613 Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510 103137 Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7 139313 Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605 101237 Biolegend
CD3 (17A2)--BV711 100241 Biolegend
CD31 (13.3)--PE 561073 Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5 117327 BD Biosciences
CD31 (13.3) no fluorophore 550274 BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
  2. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release. 160, 117-134 (2012).
  3. Green, M. R., et al. Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).
  4. Juliano, R. Nanomedicine: is the wave cresting? Nat Rev Drug Discov. 12, 171-172 (2013).
  5. Ledford, H. Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs. Nature. 533, 304-305 (2016).
  6. Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs! Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).
  7. Dunphy, M. P., Lewis, J. S. Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET. J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).
  8. Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).
  9. Perez-Medina, C., et al. A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting. J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).
  10. Perez-Medina, C., et al. Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy. Nature communications. (2016).
  11. Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Science advances. (2015).
  12. Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).
  13. Gianella, A., et al. Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer. ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).
  14. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).
  15. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, 924-938 (2016).
  16. Perez-Medina, C., et al. In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).
  17. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature communications. 5, 3065 (2014).
  18. Carney, B., et al. Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models. Mol Imaging Biol. (2015).
  19. Salinas, B., et al. Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging. EJNMMI Res. 5, 123 (2015).
  20. Carlucci, G., et al. Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma. Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).
  21. Tang, J., et al. Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2016).
  22. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 12, 278-287 (2012).
  23. Goodwill, P., et al. X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics