Fabbricazione di dispositivi microfluidici basati su carta tridimensionale per gli immunodosaggi

Published 3/09/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Noi dettaglio un metodo per fabbricare dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali per uso nello sviluppo di saggi immunologici. Il nostro approccio per il montaggio del dispositivo è di tipo multistrato, fabbricazione additiva. Dimostriamo un immunodosaggio a sandwich per fornire risultati rappresentativi per questi tipi di dispositivi basati su documenti cartacei.

Cite this Article

Copy Citation

Fernandes, S. C., Wilson, D. J., Mace, C. R. Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays. J. Vis. Exp. (121), e55287, doi:10.3791/55287 (2017).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Carta stoppini fluidi autonomamente a causa di un'azione capillare. Con patterning carta con barriere idrofobiche, il trasporto di fluidi può essere controllato e diretto all'interno di uno strato di carta. Inoltre, accatastamento più strati di carta modellata crea sofisticate reti microfluidica tridimensionali in grado di supportare lo sviluppo di test analitici e bioanalitici. dispositivi microfluidici cartacei sono economici, portatile, facile da usare, e non richiedono apparecchiature esterne ad operare. Di conseguenza, sono titolari di una grande promessa come una piattaforma per la diagnostica point-of-care. Per valutare correttamente l'utilità e prestazioni analitiche dei dispositivi cartacei, devono essere sviluppati metodi idonei a garantire la loro fabbricazione è riproducibile e in una scala che è appropriato per applicazioni di laboratorio. In questo manoscritto, un metodo per fabbricare un dispositivo un'architettura generale che può essere utilizzato per gli immunodosaggi cartacei è descritto. Usiamo una forma di manufacturin additivog (multi-strato di laminazione) preparare dispositivi che comprendono più strati di carta modellata ed adesivo modellato. Oltre a dimostrare il corretto utilizzo di questi dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali con immunoenzimatico per gonadotropina corionica umana (hCG), errori nel processo di fabbricazione che possono causare errori del dispositivo sono discussi. Ci aspettiamo che questo approccio alla produzione di dispositivi basati su carta troverà ampio programma di utilità per lo sviluppo di applicazioni analitiche progettate specificamente per le impostazioni limitato di risorse.

Introduction

La carta è ampiamente disponibile in una gamma di formulazioni o gradi, può essere funzionalizzato per sintonizzare le proprietà e può trasportare fluidi autonomamente tramite azione capillare o traspirazione. Se la carta viene modellato con una sostanza idrofoba (ad esempio, photoresist 1 o cera 2), l'assorbimento di fluidi può essere controllato spazialmente all'interno di uno strato di carta. Ad esempio, un campione acquoso applicata può essere diretto in un numero di zone diverse di reagire con reagenti chimici e biochimici memorizzati all'interno della carta. Questi dispositivi microfluidici cartacei hanno dimostrato di essere una piattaforma utile per lo sviluppo di saggi analitici portatili ed economiche 3, 4, 5, 6, 7. Applicazioni di dispositivi microfluidici basati su carta includono point-of-care diagnosticaef "> 8, il monitoraggio di contaminanti ambientali 9, l'individuazione di farmaci contraffatti 10, e l'assistenza sanitaria delocalizzato (o" telemedicina ") in alcune risorse impostazioni 11.

Strati di carta modellata possono essere assemblati in un dispositivo integrato in cui le zone idrofile da strati vicini (cioè, al di sopra o al di sotto) si collegano a formare reti fluidici continui la cui ingressi e le uscite possono essere accoppiati o sinistra indipendente. 12 Ogni strato può comprendere un modello unico, che permette la separazione spaziale dei reagenti e analisi multiple da eseguire su un singolo dispositivo. Il dispositivo di microfluidica risultante tridimensionale non è solo in grado di traspirazione fluidi per consentire saggi analitici (per esempio, la funzione epatica mette alla prova 13 e la rilevazione elettrochimica di piccole molecole 14), ma può anche supporta una serie di funzioni sofisticate (ad esempio, le valvole 15 e semplici macchine 16) comuni agli approcci tradizionali microfluidici. Importante, perché la carta stoppini fluidi per azione capillare, questi dispositivi possono essere utilizzati con il minimo sforzo da parte dell'utente.

Poiché i reagenti possono essere memorizzati all'interno dell'architettura tridimensionale di un dispositivo cartaceo, protocolli complessi possono essere ridotte ad una singola aggiunta di campione acquoso a un dispositivo. Recentemente, abbiamo introdotto un'architettura dispositivo tridimensionale generale che può essere utilizzato per lo sviluppo di immunodosaggi cartacei utilizzando la tecnica della cera-stampa per creare strati fantasia. 17, 18 Questi studi si sono concentrati su come aspetti relativi alla progettazione del dispositivo numero di strati sovrapposti utilizzati, composizione degli strati, e il modello del microfluidica rete controllata pro complessiva tridimensionaleprestazioni del immunologico. In definitiva, siamo stati in grado di utilizzare queste regole di progettazione per facilitare il rapido sviluppo di un test immunologico multiplex 19. In questo manoscritto, un immunodosaggio precedentemente sviluppato per gonadotropina corionica umana (hCG; ormone della gravidanza) 17 viene utilizzato come esempio per illustrare le strategie che abbiamo sviluppato per l'assemblaggio e la fabbricazione di immunodosaggi cartacei tridimensionali. Di conseguenza, grazie al montaggio e funzionamento di un dispositivo piuttosto che lo sviluppo di un saggio.

In un immunodosaggio a sandwich, che è il formato utilizzato per rilevare hCG, un anticorpo di cattura specifico per una subunità dell'ormone è rivestita su un substrato solido, che viene poi bloccato per limitare l'adsorbimento non specifico di un campione o di ogni reagente. Questo substrato è più spesso una micropiastra di polistirene (ad esempio, per un saggio di immunoassorbimento enzimatico o ELISA). Il campione è quindiaggiunto ad un pozzo e lasciato incubare per un periodo di tempo. Dopo rigorosa lavaggio, viene aggiunto un anticorpo specifico per l'altra subunità di hCG e lasciata incubare. Questo anticorpo di rilevazione può essere coniugato ad una colloidale di particelle, enzima, o fluoroforo per produrre un segnale misurabile. Il pozzo è ancora una volta lavato prima di interpretare i risultati di un test (ad esempio, utilizzando un lettore di piastre). Mentre kit commerciali si basano su questo processo multistep tempo, tutte queste operazioni possono essere eseguite rapidamente in dispositivi microfluidici cartacei con un intervento minimo per l'utente.

Il dispositivo usato per la immunodosaggio hCG comprende sei strati attivi, che sono, dall'alto verso il basso, utilizzate per l'aggiunta del campione, stoccaggio coniugato, incubazione, la cattura, lavaggio, e blot (Figura 1). Lo strato aggiunta del campione è costituito da carta da filtro qualitativa. Essa facilita l'introduzione di un campione liquido e protegge i reagenti nel laye coniugator dalla contaminazione dell'ambiente o contatto accidentale dall'utente. Lo strato coniugato (carta da filtro qualitativa) contiene il reagente colorato-produzione (ad esempio, anticorpi marcato con oro colloidale) per immunodosaggio. Lo strato di incubazione (carta da filtro qualitativa) consente il campione di viaggiare lateralmente nel piano della carta di promuovere legame dell'analita con reagenti prima di raggiungere lo strato successivo, lo strato di acquisizione. Lo strato di acquisizione (membrana di nylon) contiene ligandi specifici per l'analita adsorbito al materiale. Dopo il test viene completato, questo strato è rivelato per consentire la visualizzazione del immunocomplesso completata. Lo strato di lavaggio (carta da filtro qualitativa) richiama i liquidi in eccesso, tra cui reagenti coniugato libero lontano dalla faccia dello strato di cattura nello strato macchia (cromatografia su carta spessa). Il dispositivo a sei strati è tenuto insieme da cinque strati di fantasia, biadesivo: quattro strati di adesivo permanente mantenere l'integrità del assemDispositivo dissanguati e uno strato di adesivo removibile facilita sbucciatura del dispositivo per controllare i risultati del saggio immunologico sullo strato di acquisizione.

Ai fini di questo manoscritto, usiamo solo campioni di controllo positivi e negativi di hCG (0 mIU / ml e 81 mIU / ml, rispettivamente) per fornire risultati rappresentativi di un immunodosaggio cartaceo, che permette una discussione dedicato del rapporto tra metodi di fabbricazione e le prestazioni di un dispositivo. Oltre a dimostrare come fabbricare dispositivi con successo, si segnalano diversi errori di fabbricazione che potrebbero portare al fallimento di un dispositivo o di risultati del test non riproducibili. Il protocollo e la discussione dettagliato in questo manoscritto forniranno ai ricercatori informazioni preziose sul modo in cui saggi immunologici cartacei sono progettati e fabbricati. Mentre ci concentriamo la nostra manifestazione del test immunologici, ci aspettiamo che le linee guida qui presentate saranno ampiamente utile per la produzione di Tridimennale cartaceo dispositivi microfluidici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione dei Livelli dispositivo a microfluidi Paper-based

  1. Preparare modelli per strati di carta, nylon, e l'adesivo con un programma di software di progettazione grafica. 6 Ogni strato può avere un modello diverso.
    NOTA: Il modello può comprendere fori di allineamento non necessari per un immunodosaggio cartaceo funzionale, ma assisterla nella fabbricazione riproducibile di dispositivi tridimensionali. Il posizionamento di questi fori sarà diverso se i dispositivi sono assemblati singolarmente, in strisce, o come fogli interi. Il programma software utilizzato per la progettazione di modelli può variare in base alla scelta della tecnica patterning (ad esempio, la fotolitografia, la stampa della cera, o il taglio). 6
  2. Spruzzare la zona di lavoro con una soluzione di 70% (v / v) etanolo e acqua. Pulire l'area di lavoro con un tovagliolo di carta pulito.

2. Preparazione di strati di carta: Campione Inoltre, coniugato bagagli, incubazione, e livelli di lavaggio

  1. Preparare strati di carta da filtro qualitativa che utilizzano una grande taglierina da tavolo. Tagliare un foglio stock di carta in un formato carta standard per facilitare patterning utilizzando una stampante a inchiostro solido (cera). Per esempio, un singolo foglio 460 x 570 mm 2 può fare 4 fogli di carta US Letter (8,5 x 11 pollici 2). Gestire la carta con i guanti puliti in ogni momento per minimizzare la contaminazione.
  2. Caricare un foglio singolo di carta per cromatografia nel vassoio della stampante. Stampa strati precedentemente progettati (vedere Figura 1).
    NOTA: Un modello può essere stampato direttamente su questa scheda utilizzando la alimentazione automatica. Solo un foglio di carta deve essere stampato in un momento per evitare inceppamenti. Per tutti i livelli, utilizzare le impostazioni di stampa "avanzate".

3. Preparazione di Nylon strato di membrana: Strato Capture

  1. Tagliare il rotolo magazzino di membrana di nylon in fogli (7,5 x 10 pollici 2) utilizzando un taglierino da tavolo. Fare molta attenzione nel maneggiare il nylonmembrana per mantenere la sua integrità e la protezione contro lo strappo. Conservare il materiale non utilizzato in un armadio essiccatore, come le membrane di nylon sono sensibili all'umidità.
    NOTA: Tagliare fogli sono più strette rispetto alla carta US Letter. Poiché membrane di nylon sono sottili e fragili, non possono essere elaborati dal stampante direttamente e richiedono supporto. I dettagli sono discussi di seguito.
  2. Utilizzando una stampante di cera, stampare un motivo strato di acquisizione su un foglio di carta da copia e nastro ad una scatola luminosa per servire da guida per il posizionamento della membrana di nylon. La scatola luminosa aiuta l'allineamento di più livelli.
  3. Posizionare un foglio di carta da copia sul foglio precedentemente stampato su carta da copia. Tape il foglio di carta al light box, ma non a nastro i due fogli insieme.
  4. Posizionare un foglio singolo di membrana di nylon sul pezzo di carta pulito copia. Assicurarsi che la membrana copre l'area stampata dello strato inferiore di carta da copia. Nastro tutti e quattro i lati della membrana di nylon al fogliodi carta da copia.
    NOTA: Assicurarsi che la membrana di nylon è piatta e liscia in modo che non ci sono problemi con la stampa (ad esempio, inceppamenti della carta o la stampa irregolare di cera). Cera può essere stampato sul nastro in cui la membrana di nylon è attaccato alla carta da copia. In questo caso, le aree in cui non è completamente in nylon modellata a causa della copertura del nastro deve essere eliminata. Per i preparati futuri, grandi pezzi di membrana di nylon possono essere usati per evitare questo errore di stampa.
  5. Caricare un foglio di membrana di nylon (supportato dalla carta da copia fissata ad esso) nel vassoio della stampante alimentazione manuale. Stampa un solo foglio di membrana di nylon alla volta.
    NOTA: Non ci sono passi di preparazione richieste per lo strato di macchia, in quanto non è modellata.

4. La creazione di barriere idrofobi nel layer stampato

  1. Tape strati stampati su un telaio acrilica per riscaldare anche sopra e sotto il livello quando posta in un forno a convezione per gravità. Mantenere la membrana di nylon nastro ail foglio di supporto di carta da copia fino a dopo la cera viene fusa e si formano barriere idrofobiche.
    NOTA: Il telaio in acrilico è un pezzo su misura tagliato al laser di 1/2 ".. Plastica acrilica di spessore Due taglie a seconda del numero di dispositivi essere fabbricati sono stati utilizzati il ​​bordo esterno della cornice più piccola misura 11 5/8" x 2 3/4 ", e il foro interno del telaio misura 10 3/8" x 1 3/4 ". il bordo esterno del telaio più grande misura 11 5/8" x 8 7/8 ", e l'interno foro del telaio misura 10 1/4 "x 7 7/8". lo spazio interno aperto permette anche la fusione della cera attraverso l'intero spessore della carta.
  2. Posizionare i livelli nel forno a 150 ° C per 30 sec che la cera si scioglie nello spessore della carta. Verificare che la cera ha permeato lo spessore della carta capovolgendolo e controllo per imperfezioni nel disegno.
    NOTA: forzata forni ad aria o piastre possono anche essere utilizzati per sciogliere l'inchiostro cera solida. tempi di fusioneo temperature possono variare a seconda del metodo di riscaldamento.
  3. Rimuovere la carta e membrana di nylon dal telaio acrilico. Inoltre, rimuovere la membrana di nylon dal foglio di supporto della carta da copia.

5. Preparazione di strati adesivi

  1. Motivo fogli su due lati di pellicole adesive utilizzando un plotter coltello robotico, utilizzando file di progettazione precedentemente preparati (passo 1.1). Proteggere qualsiasi superficie adesiva esposta utilizzando un foglio di rivestimento di cera.
    NOTA: Il biadesivo deve essere modellato con fori che consentono il campione di fluire attraverso gli strati come un percorso fluidico continuo. Il liner cera viene facilmente rimosso dal collante, e serve per proteggerlo dalla contaminazione e lacerazione durante il taglio. Una taglierina laser o stampo della pressa può essere utilizzato anche per strati modello di pellicole adesive.

6. Supporto di strati di periferica con adesivo

  1. Spruzzare la luce casella con una soluzione di 70% (v / v) etanolo e acqua. Pulire con una carta t pulitoowel.
  2. Nastro uno strato fantasia di carta o membrana di nylon che ha bisogno di essere sostenuta con adesivo sul light box con il lato stampato verso il basso.
  3. Peel un lato del rivestimento protettivo dal foglio modellato di adesivo e applicarla allo strato di carta o membrana di nylon. Utilizzare la casella di luce per garantire il corretto allineamento dei modelli. Press insieme. Posizionare il dispositivo parzialmente assemblato in uno slittamento di protezione.
    NOTA: Lo slittamento di protezione è un pezzo piegato di supporto in film di laminazione che protegge i dispositivi da contaminazione o danni, garantendo che essi non entrino in contatto i rulli laminatore.
  4. Passare il gruppo a due strati risultante attraverso un laminatore automatico per premere completamente l'adesivo e carta insieme, rimuovendo eventuali sacche di aria dagli strati comunicanti.
    NOTA: sacche d'aria tra gli strati del dispositivo possono interferire con l'integrità del dispositivo e traspirante riproducibilità causando perdite.

7. Il trattamento di coniugato Layer con i reagenti per gli immunodosaggi prima del montaggio del dispositivo

  1. strato coniugato nastro su un telaio in acrilico tali che la zona idrofila da trattare viene sospeso e non a contatto con il telaio.
  2. Aggiungere 2,5 ml di 100 mg / ml di siero albumina bovina (BSA) in 1x tampone fosfato salino (PBS) alla zona idrofila sullo strato coniugato. Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 2 minuti e poi a 65 ° C per 5 min.
    NOTA: Questo volume è sufficiente per bagnare la zona della carta. La soluzione BSA aiuta a prevenire l'aggregazione delle nanoparticelle colloidali durante il processo di essiccazione, che faciliterà il rilascio delle nanoparticelle quando la carta ei reagenti vengono reidratate dal campione.
  3. Aggiungere 5 ml di 5 OD colloidale delle nanoparticelle d'oro coniugato anticorpo anti-β-hCG, e ripetere il processo di essiccazione.
    NOTA: Le unità di concentrazione di nanoparticelle di oro colloidale sono spesso espressa come densità ottica (OD) come misurato da absorbance a λ = 540 nm. Non è necessario alcun trattamento per il pad stoppino prima del montaggio del dispositivo nella sezione 10.

8. Il trattamento di Lateral Canale con reagente per gli immunodosaggi prima del montaggio del dispositivo

  1. Tape strato canale laterale su un telaio in acrilico tali che la zona idrofila da trattare viene sospeso e non a contatto con il telaio.
  2. Aggiungere 10 ml di agente bloccante (5 mg ml di latte / senza grassi e 0,1% (v / v) Tween 20 in PBS 1x) per trattare il canale laterale. Ripetere lo stesso processo di essiccazione (2 min a temperatura ambiente e poi a 65 ° C per 5 min) come strato coniugato.

9. Il trattamento dello strato di cattura con i reagenti per gli immunodosaggi prima del montaggio del dispositivo

  1. strato cattura nastro su un telaio in acrilico tali che la zona idrofila da trattare viene sospeso e non a contatto con il telaio.
  2. Trattare lo strato di acquisizione con 5 ml di 1 mg / ml di anti-α-hCG anticorpi e quindi consentire lacampione asciugare a temperatura ambiente per 2 min seguita da 8 minuti a 65 ° C.
  3. Aggiungere 2 ml di agente bloccante (5 mg / ml di latte non grasso e 0,1% (v / v) Tween 20 in PBS 1x). Ripetere il processo di essiccazione per lo strato di acquisizione.
    NOTA: Questo valore è appropriato per rivestire le carte senza occludere i pori della membrana di nylon, che può accadere quando si utilizza troppo agente molto bloccante.

Dispositivi microfluidici 10. Assemblea dei tridimensionale su supporto cartaceo

  1. Nastro il livello di lavaggio al light box (lato stampato rivolto verso l'alto). Se si usano fori di allineamento, rimuoverli da strati successivi utilizzando uno strumento buco-punch palmare.
  2. Rimuovere la pellicola protettiva sul retro dello strato cattura per esporre l'adesivo. Allineate lo strato di acquisizione di sopra dello strato di lavaggio utilizzando i fori di allineamento come guida. Premere insieme i due strati. Evitare di toccare le zone idrofile per minimizzare la contaminazione o danni al dispositivo. Pinzette possono essere utilizzati per assistere assembly.
  3. Rimuovere la pellicola protettiva sul retro dello strato incubazione per esporre l'adesivo. Allineate lo strato incubazione sopra lo strato di acquisizione e premerli insieme. Continuare l'aggiunta di strati in questo modo fino a quando tutti gli strati attivi sono assemblati.
  4. Posizionare il dispositivo parzialmente assemblato in una scivolata protettivo e saldamente apporre insieme gli strati con una plastificatrice.
  5. Rimuovere la pellicola protettiva sulla parte posteriore dello strato di lavaggio e fissare lo strato blot alla parte inferiore del dispositivo. Ripetere passaggio di laminazione 10.4 per completare l'assemblaggio del dispositivo microfluidica cartaceo tridimensionale. Taglio desiderato numero di dispositivi da strisce o fogli di dispositivi completamente assemblati con le forbici.
    NOTA: Fogli completi di dispositivi, strisce di dispositivi o singoli dispositivi possono essere preparati utilizzando un approccio simile.

11. Esecuzione di un test immunologico su supporto cartaceo

  1. Aggiungere 20 ml di un campione alla zona idrofila sulla parte superiore del dispositivo (cioè, tegli campione layer).
  2. Attendere che il campione per favorire completamente nel dispositivo, quindi aggiungere 15 ml di tampone di lavaggio (0,05% v / v Tween 20 in 1x tampone fosfato salino). Dopo la prima aliquota di tampone di lavaggio è malvagio completamente nel dispositivo, aggiungere una seconda aliquota 15 microlitri di tampone di lavaggio.
    NOTA: Il tampone di lavaggio è completamente empi nel dispositivo quando la goccia di liquido è scomparso, non mostrando menisco sulla superficie della carta. Il test è completa quando la seconda aliquota di tampone di lavaggio è completamente inserito il dispositivo.
  3. Per rivelare i risultati del test, staccarsi i tre strati superiori del dispositivo con una pinzetta per esporre lo strato di acquisizione.
    1. Interpretazione dei risultati del saggio qualitativamente osservando la presenza o assenza di colore. In alternativa, lo strato immagine lettura tramite uno scanner desktop e usare software di elaborazione delle immagini o algoritmi per quantificare i risultati e caratterizzare le distribuzioni di intensità di unzona di rilevamento. 20

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ottenere prestazioni del saggio riproducibili in dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali si basa su un metodo di fabbricazione che garantisce la coerenza tra i dispositivi. Verso questo obiettivo, abbiamo individuato una serie di processi di fabbricazione e considerazioni materiali, e li discutere qui nel contesto di dimostrare un test immunologico cartaceo. Usiamo un metodo di stampa a cera per formare barriere idrofobiche all'interno dispositivi microfluidici basati su carta (Figura 2A). 2 Questo metodo è ideale perché si basa solo sulle apparecchiature per ufficio ampiamente disponibili, richiede fasi procedurali minime per completare, e non richiede l'uso di sostanze chimiche (ad esempio, fotoresist) che potrebbero interferire con l'adsorbimento di proteine o alterare la bagnabilità delle fibre di carta. Inoltre, la stampa cera produce percorsi fluidici con dimensioni riproducibili, che è fondamentale per le analisi con prestazioni ripetibili e la durata TImes. Dopo le barriere idrofobi sono formati, fogli adesivi vengono applicati a strati per facilitare il montaggio di dispositivi tridimensionali (Figura 2B). Eventuali reagenti richiesti per l'immunodosaggio può essere applicato dopo il film adesivo viene aggiunto alla parte posteriore di uno strato (Figura 2C). Questa procedura è utile per i processi di fabbricazione in un laboratorio accademico perché molti dispositivi possono essere preparati in parallelo. Metodo di assemblaggio di un dispositivo immunodosaggio viene completata dopo tutti gli strati del dispositivo vengono impilati e laminati insieme (Figura 2D). Aggiungiamo campione per iniziare il test. In questo esempio, si usa un controllo delle urine set per test di gravidanza, che contiene campioni negativi e positivi di hCG a tampone, come campioni per dimostrare il funzionamento dei nostri dispositivi e la riproducibilità dei test eseguiti con loro. Due aliquote di tampone di lavaggio sono poi aggiunti in modo sequenziale. Una volta che l'aliquota finale del tampone di lavaggio è completamente inserito il dispositivo, latest è considerata completa. I primi tre strati sono poi staccato per rivelare lo strato di cattura (Figura 3A). Questo passo irreversibile la periferica assicurando che non può essere riutilizzato. Il completamento di un documento basato su risultati immunodosaggio in una lettura qualitativa di colore che possono indicare un'uscita negativa o positiva a fronte di ispezione visiva. L'obiettività di questi risultati è evidente nelle immagini non corretti acquisite utilizzando uno scanner piano (Figura 3B).

esperimenti falliti spesso possono evidenziare alcune fasi procedurali la cui importanza potrebbe essere altrimenti impercettibili quando l'analisi di un esperimento è focalizzata sui risultati di successo. Dimostriamo tre errori nella produzione e assemblaggio di dispositivi tridimensionali basati su documenti cartacei microfluidici che provocano guasti del saggio immunologico: (i) Di tanto in tanto, i guasti dei dispositivi non sono evidenti solo dopo un test è stato completato. Ad esempio, a misalignment tra gli strati che compongono la zona di canale di incubazione e la cattura può causare lo sviluppo di un modello irregolare nel segnale positivo, che può provocare l'errata interpretazione del segnale qualitativa da un utente (Figura 4A). (Ii) Se la cera non viene stampato in una quantità sufficiente o non autorizzati per sciogliere completamente attraverso l'intero spessore della carta, quindi l'integrità delle barriere idrofobi risultanti può essere compromessa. formazione incompleta di queste barriere causerà una perdita di controllo dell'umidità e portare a perdite all'interno del dispositivo. Ad esempio, invece di limitare il flusso di un canale all'interno di un livello, una barriera di cera semi-permeabile consentirà fluido per favorire altrove nel piano della carta. Senza canali definiti, il campione è improbabile raggiungere gli strati di acquisizione o di lavaggio. L'utente percepirà questo tipo di errore come durata dosaggio notevolmente ridotto. Dimostriamo questo fallimento dispositivo mediante l'applicazione di una soluzione di colorante alimentare rosso per a layer il cui modello in cera non è stato permesso a sciogliersi per l'intero 30 sec (Figura 4B). Un immunodosaggio che utilizza un tale strato è stato "completato" in 6 minuti, che è chiaramente diverso da quello della durata prevista di 15 min. (Iii) Assays che richiedono più tempo del previsto per completare può indicare un malfunzionamento nella fabbricazione di un dispositivo. Ad esempio, impropriamente tagliare pori adesivi o occluse causa dell'applicazione di una quantità eccessiva di reagenti (ad esempio, agenti bloccanti o oro colloidale) potrebbe impedire un tampone o lavaggio di entrare nel dispositivo (Figura 4C).

Nel complesso, il nostro protocollo di produzione è utile per fabbricare numerosi dispositivi microfluidica cartacei in parallelo su una scala che è utile per un laboratorio accademico. Dimostriamo la performance del saggio immunologico basato su carta hCG preparato con questo metodo eseguendo 70 test in parallelo: 35 repliche negative e 35 r positivoeplicates. Ai fini di questa dimostrazione, abbiamo preparato una serie di strati con i disegni del nostro dispositivo, apposti gli strati di carta con adesivo, e poi tagliare i fogli in file di dispositivi. Ciascun foglio è stato tagliato in 7 file, che conteneva dieci dispositivi. Questo ha facilitato la disposizione degli strati sui telai acrilici minori dove gli strati sono nastrate e quindi trattati con reagenti necessari per eseguire i saggi. Questo metodo di preparazione dispositivo è suggerito in una nota nel protocollo. Dopo il trattamento di strati, i dispositivi sono stati montati in strisce di dieci e poi laminato. Dopo che sono stati completati i passi finali dispositivo di fabbricazione, i dispositivi sono rimasti nelle strisce di dieci e il campione è stato aggiunto a ciascun dispositivo. Abbiamo osservato un tasso di fallimento 0% per i dispositivi fabbricati utilizzando il nostro protocollo. Abbiamo utilizzato un open-source software di elaborazione di immagini 20 per quantificare i risultati di questi test. Mentre un certo numero di metodi sono disponibili per analizzare i distribut intensitàione in macchie circolari (ad esempio, radiale o distribuzioni lineari) 21 misuriamo l'intensità media del canale verde di un'immagine RGB del dispositivo utilizzando l'intero spot di rilevamento come una regione di interesse. 17, 18, 19 Abbiamo poi normalizzare le misurazioni dei dosaggi sia positivi che negativi sottraendo i dati negativi grezzi (Figura 3B). Abbiamo determinato il coefficiente di variazione per ogni set di dati per essere 1% per le analisi eseguite utilizzando campioni negativi e il 3% per esperimenti eseguiti utilizzando campioni positivi.

Figura 1
Figura 1: Schema di dispositivo cartaceo tridimensionale. Questa figura mostra le regioni idrofobiche e idrofiliche che definiscono il percorso fluidico all'interno del dispositivo, nonché il pattstrati plinato di adesivo permanente e rimovibile che tengono insieme gli strati. Ogni strato è etichettato dalla funzione che svolge nel saggio. Il contorno rosso, blu o verdi su ogni livello indica il materiale utilizzato per fabbricare quello strato specifico (rosso: cromatografia su carta, blu: membrana di nylon, verde: cromatografia su carta spessa). Le dimensioni sono indicate per ciascuna zona all'interno del dispositivo in mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Procedura utilizzata per fabbricare immunodosaggi da dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali. (A) Immagini della parte anteriore e posteriore di un foglio di carta cromatografia modellata utilizzando stampa della cera prima e dopo il riscaldamento. (B) Un foglio di carta per cromatografiasostenuto con una pellicola di adesivo modellato. (C) Trattamenti applicati alle zone idrofile di una striscia di membrana di nylon modellato. (D) Assemblaggio di strisce di un dispositivo multistrato utilizzando una scatola luminosa e fori di allineamento come guida. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Interpretazione dei risultati di un test immunologico cartaceo. (A) I primi tre strati del dispositivo cartaceo sono sbucciati indietro per esporre lo strato di acquisizione ed interpretare i risultati del test. (B) Rappresentazione grafica della prestazione di un immunodosaggio cartaceo per hCG. I risultati raffigurati sono le medie di 70 repliche eseguite contemporaneamente cui 35 replicati ciascuno vengono utilizzati FOr campioni positivi e negativi di hCG. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard del set di dati. , immagini rappresentative non corretti raffiguranti (colore rosso) positivo e (colore bianco) i risultati negativi di un test immuno-hCG sono riportati sopra i rispettivi dati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Esempi di errori di fabbricazione. (A) A causa disallineamento del canale laterale sopra il livello di cattura, il segnale positivo è concentrata in una piccola area della zona di lettura. Una regione "wet" circolare (linea tratteggiata) può essere osservato a destra della zona lettura derivante dal contatto tra lato del canale disallineato con lo strato di cattura (a sinistra). Immagine di una lettura positivo sullalo strato di acquisizione di un dispositivo allineato correttamente (destra). (B) fusione incompleta della cera in tutto lo spessore di uno strato può portare a perdite all'interno del dispositivo. Colorante alimentare è stato aggiunto alla soluzione per assistere con visualizzazione di campione in strati con barriere idrofobici incompleti o completamente formate. (C) adesivo impropriamente tagliare può bloccare la rete fluidico tra strati di carta, che interrompe il flusso del campione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Produzione dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali. Lo schema raffigura l'assemblaggio e laminazione da più strati di carta modellata in completate dispositivi tridimensionali. In questo esempio, 70 dispositivi cun inviate simultaneamente. Gli strati di fori di adesivi e di allineamento sono stati rimossi dallo schema a scopo di semplificazione. Dopo il montaggio, i singoli dispositivi possono essere rimossi e utilizzati in saggi. I contorni rosso, blu, e verde su ogni strato indicano il materiale utilizzato per fabbricare quello strato specifico (rosso: cromatografia su carta, blu: membrana di nylon, verde: cromatografia su carta spessa). La scala bar = 25 mm, salvo per il dispositivo separato (a destra), che ha dimensioni di 12 x 28 mm 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identificazione di una strategia di produzione riproducibile è una componente essenziale dello sviluppo test. 22 Usiamo sequenziale, layer-by-layer metodo per fabbricare dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali. In contrasto con i metodi che si applicano piegatura o origami tecniche per produrre dispositivi multistrato da un singolo foglio di carta 23, 24 di produzione di additivi offre una serie di vantaggi: (i) materiali multipli possono essere incorporati in una singola architettura dispositivo senza modifiche ai metodi per la stampa, l'allineamento, o assemblaggio di strati. (Ii) pellicole adesive modellati possono essere integrati nel processo di assemblaggio. Questi film apporre strati adiacenti, e, sulla base della forza dell'adesivo, può essere reversibile per consentire sbucciatura e la valutazione degli strati interni. Inoltre, gli adesivi forniscono integrità strutturale al dispositivo tridimensionale, che esclude la necessitàper raccoglitore 25 clip o involucri lavorati. 23 (iii) I singoli fogli di carta per cromatografia US Letter può ospitare una serie di repliche, che può migliorare notevolmente il rendimento della produzione su scala di laboratorio (Figura 5). Ciò è particolarmente vantaggioso quando si valutano numerose condizioni sperimentali che richiedono replicati tecnici. Con questo approccio, 70 dispositivi cartacei tridimensionali possono essere preparati simultaneamente. (iv) approcci multistrato simili laminazione sono utilizzati per la produzione ad alto volume di numerosi prodotti commerciali nel settore sanitario (ad esempio, ferita medicazioni cura e cerotti transdermici), che abbassa di conseguenza la barriera di produzione per tradurre questi dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali.

Oltre a facilitare peeling e montaggio, la scelta di adesivo è anche fondamentale per la progettazione della rete fluidica tridimensionale. Una pubblicitàpellicola colla per può essere un ostacolo aggiuntivo tra strati di carta, che può consentire mascheratura delle zone idrofile su strati adiacenti. In pratica, l'utilizzo di strati sottili di adesivo è desiderabile. Se l'adesivo è troppo spessa (ad esempio, molti nastri fronte-retro), quindi il divario formato tra strati di carta saranno troppo grandi per facilitare la traspirazione e deve essere riempito con una sostanza idrofila (ad esempio, polvere di cellulosa) per riguadagnare la funzione. 12 Anche se questo ulteriore passo aggiunge complessità per la produzione e la sostanza utilizzata può interferire con alcuni test, queste lacune diventano una caratteristica utile per la produzione di valvole, push-giù fluidici controllabili. 15 Altre forme di adesivo sono stati utilizzati nella fabbricazione di dispositivi microfluidici cartacei tridimensionali. spray adesivi offrono un metodo semplice per apporre strati tra loro. 26 Utilizzando questo metodo, il materiale adesivo viene applicato uniformemente su entrambi tegli zona idrofoba e idrofila della carta. Un vantaggio di questo metodo è che ulteriori attrezzature (ad esempio, plotter coltello o taglio laser) non è necessario progettare il modello per lo strato adesivo. Tuttavia, le condizioni per l'applicazione uniforme del adesivo spray devono essere determinati sperimentalmente per ogni tipo di materiale utilizzato. La topografia del materiale può influenzare l'interfaccia adesivo-materiale e tempi di spruzzo più lunghi possono essere necessari per le superfici più ruvide. Inoltre, spruzzare adesivo sulle zone idrofile del percorso fluidico può causare assorbimento ridotta alterando la bagnabilità della carta. In alternativa, l'uso di matrici 27 o stampa 8 schermo può essere utilizzato per l'adesivo modello direttamente su strati di carta modellata.

Due importanti considerazioni per lo sviluppo di tridimensionali dispositivi microfluidici cartacei sono la scelta dei materiali e la progettazione del fluirete dic. (I) Selezioniamo materiali e combinazioni di materiali basati sul tasso di traspirazione, resistenza all'acqua, spessore, e la capacità di legame con le proteine. tasso assorbente può influenzare la durata di un test e la quantità di reagenti tempo deve reagire o impegnare all'interno di un livello. Differenti tipi di carta sono caratterizzati da traspirazione tariffe sulla base, per esempio, il trattamento della carta, la sua porosità, e il suo spessore. È possibile utilizzare più strati di carta per aumentare il tasso di assorbimento efficace di un dispositivo. 28 Una buona resistenza all'acqua è desiderabile per applicazioni che richiedono la movimentazione (ad esempio, peeling un immunodosaggio) dopo che il dispositivo è stato saturato con un campione. I materiali che sono troppo spessi o che non possono essere passati attraverso la stampante commerciale a causa di fragilità richiederà un metodo alternativo per la produzione di canali fantasia (ad esempio, fotolitografia). Tuttavia, in contrasto, materiali più spessi sono ideali per gli strati della macchia (o lavandini) per disegnare fluidi attraverso esimodispositivo e. Molti tipi di membrane di nylon sono disponibili in commercio, che possono differire nella loro capacità di legare proteine ​​irreversibilmente alla zona di cattura. Sostituzioni dei materiali (pe, nitrocellulosa invece di una membrana di nylon) può anche influenzare la capacità, che può influenzare la sensibilità del saggio di legame. (ii) L'uso di simmetria nella progettazione di reti fluidiche assicura che i canali unici modellati in dispositivi tridimensionali comportamento identico (ad esempio, riempito simultaneamente), che è critica per saggi multiplex. 19 Symmetry semplifica ulteriormente la progettazione strato, assiste con l'allineamento strato in fase di montaggio fogli pieni di dispositivi, e può minimizzare gli sprechi. Le modifiche al progetto del dispositivo possono influenzare le prestazioni del dosaggio. Ad esempio, aumentando la lunghezza del lato del canale nello strato incubazione influenzerà la durata del test, perché il fluido dello stoppino una distanza proporzionalmente più prima di raggiungere il outlet. 17 Nelle applicazioni che si basano sul legame di una biomolecola bersaglio, un tempo più lungo saggio può essere vantaggioso perché può aumentare la frazione di rilegati, specie etichettati prima di immobilizzazione sullo strato di cattura.

In conclusione, abbiamo presentato un metodo per fabbricare dispositivi microfluidici tridimensionali cartacei che supportano lo sviluppo di saggi immunologici. Questo metodo, che utilizza un tipo di fabbricazione additiva per produrre dispositivi multistrato, facilita la produzione di dispositivi a scala che è adatto per ricerche di laboratorio. Il protocollo descritto in questo manoscritto è specifico per i dispositivi immunodosaggio cartacei; tuttavia, ci aspettiamo che le procedure relative al montaggio di questi test immunologici stampa a cera, patterning adesivo, allineando i livelli, e la laminazione-sarà facilmente estensibile a numerose architetture di dispositivi microfluidica a base di carta tridimensionali. Una comprensione della metodologia di fabbricazione può portareallo sviluppo di nuovi test point-of-care con una vasta gamma di applicazioni nel settore sanitario, l'ambiente e l'agricoltura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illustrator CC Adobe to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer Amazon B00R92C9DI to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven Fisher Scientific 15-103-0509 to melt wax into paper
Artograph LightTracer Amazon B000KNHRH6 to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator Amazon B00AXHSZU2 to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter Graphtec America CE6000-40 to pattern adhesive films
Swingline paper cutter Amazon B0006VNY4C to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner Amazon B000VG4AY0 to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch McMaster-Carr 3488A9 to remove alignment holes 
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 Sigma Aldrich WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)  Fisher Scientific 05-714-4 to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) Pall Corporation NBCHI3R to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF021621 to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF051521
wax liner FLEXcon FLEXMARK 80 D/F PFW LINER to assist with patterning adhesive
acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266  to fabricate frame
self-adhesive sheets Fellowes CRC52215 to use as protective slip
absolute ethanol VWR 89125-172 to sanitize work area
bovine serum albumin AMRESCO 0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls Fisher Scientific 22-071-066 to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) Arista Biologicals  CGBCG-0701 to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody Arista Biologicals  ABACG-0500 to treat capture layer
10X phosphate buffered saline Fisher Scientific BP3991
Oxoid skim milk powder Thermo Scientific OXLP0031B
Tween 20 AMRESCO M147

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 8, (12), 2146-2150 (2008).
  2. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 81, (16), 7091-7095 (2009).
  3. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. 46, (8), 1318-1320 (2007).
  4. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem. 82, (1), 2-10 (2010).
  5. Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. Recent developments in paper-based microfluidic devices. Anal. Chem. 87, (1), 19-41 (2015).
  6. Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends. Biomicrofluidics. 6, 011301 (2012).
  7. Lisowski, P., Zarzycki, P. K. Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends. Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).
  8. Pollock, N. R., et al. A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing. Sci. Transl. Med. 4, (152), 152ra129 (2012).
  9. Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals. Anal. Chem. 84, (10), 4474-4480 (2012).
  10. Weaver, A. A., et al. Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals. Anal. Chem. 85, (13), 6453-6460 (2013).
  11. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80, (10), 3699-3707 (2008).
  12. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (50), 19606-19611 (2008).
  13. Vella, S. J., et al. Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick. Anal Chem. 84, (6), 2883-2891 (2012).
  14. Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers. Lab Chip. 10, (22), 3163-3169 (2010).
  15. Martinez, A. W., et al. Programmable diagnostic devices made from paper and tape. Lab Chip. 10, (19), 2499-2504 (2010).
  16. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper machine" for molecular diagnostics. Anal. Chem. 87, (15), 7595-7601 (2015).
  17. Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays. Lab Chip. 14, (24), 4653-4658 (2014).
  18. Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture. Anal. Methods. 8, (26), 5204-5211 (2016).
  19. Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever. Anal. Chem. 88, (12), 6161-6165 (2016).
  20. Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11, (7), 36-42 (2004).
  21. Derda, R., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PLoS ONE. 6, (5), e18940 (2011).
  22. Mace, C. R., Deraney, R. N. Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices. Microfluid. Nanofluidics. 16, (5), 801-809 (2014).
  23. Liu, H., Crooks, R. M. Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami. J. Am. Chem. Soc. 133, (44), 17564-17566 (2011).
  24. Kalish, B., Tsutsui, H. Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices. J. Vis. Exp. (110), e53805 (2016).
  25. Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices. Anal. Chem. 86, (13), 6501-6507 (2014).
  26. Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 12, (15), 2630-2633 (2012).
  27. Kalish, B., Tsutsui, H. Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits. Lab Chip. 14, (22), 4354-4361 (2014).
  28. Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 15, (23), 4461-4466 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats