Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis Microfluidic Devices für Immunoassays

Published 3/09/2017
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Bioengineering

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Summary

Wir Detail ein Verfahren dreidimensionalen Papierbasis Mikrofluidik-Vorrichtungen in der Entwicklung von Immunoassays für die Verwendung herzustellen. Unser Ansatz zur Gerätemontage ist eine Art von mehrschichtigen, additive Fertigung. Wir zeigen, ein Sandwich-Immunoassay repräsentative Ergebnisse für diese Arten von papierbasierten Vorrichtungen bereitzustellen.

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Fernandes, S. C., Wilson, D. J., Mace, C. R. Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays. J. Vis. Exp. (121), e55287, doi:10.3791/55287 (2017).

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Abstract

Papier transportiert Flüssigkeiten autonom aufgrund der Kapillarwirkung. Durch Strukturieren Papier mit hydrophoben Barrieren kann der Transport von Flüssigkeiten kontrolliert und innerhalb einer Schicht von Papier geleitet. Darüber hinaus schafft mehrere Schichten aus gemustertem Papier stapeln hoch entwickelte dreidimensionale mikrofluidischen Netzwerken, die die Entwicklung von analytischen und bioanalytischen Assays unterstützen können. Papierbasierte Mikrofluidik-Vorrichtungen sind kostengünstig, tragbar, einfach zu bedienen und erfordern keine externe Geräte zu bedienen. Als Ergebnis halten sie ein großes Versprechen als Plattform für den Point-of-Care-Diagnostik. Um müssen den Nutzen und die analytische Leistungsfähigkeit von Papier-basierten Geräten, geeignete Methoden entwickelt werden, um richtig zu bewerten ihre Herstellung zu gewährleisten, ist reproduzierbar und in einem Maßstab, der für Laborumgebungen geeignet ist. In diesem Manuskript, herzustellen Verfahren eine allgemeine Vorrichtungsarchitektur, die für papierbasierte Immunoassays verwendet werden können, beschrieben. Wir verwenden eine Form von Additiv manufacturing (mehrschichtige Laminierung) Vorrichtungen herzustellen, die mehrere Schichten aus gemustertem Papier und gemusterten Klebstoff umfassen. Zusätzlich die richtige Verwendung dieser dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen mit einem Immunoassay für humanes Chorion-Gonadotropin (hCG) zu demonstrieren, Fehler in dem Herstellungsverfahren, das in Geräteausfällen führen können, werden diskutiert. Wir erwarten, dass dieser Ansatz zu Herstellung von Papier-basierten Geräten wird eine breite Anwendung bei der Entwicklung von analytischen Anwendungen speziell für die limitierte Ressource-Einstellungen finden.

Introduction

Das Papier ist in einer Reihe von Formulierungen oder Sorten weithin verfügbar sind, können ihre Eigenschaften stimmen funktionalisiert werden, und können Flüssigkeiten autonom durch Kapillarwirkung transportieren oder Wicking. Wenn Papier mit einer hydrophoben Substanz strukturiert wird (beispielsweise Photoresist - 1 oder Wachs 2) kann das Saugen von Flüssigkeiten kontrolliert innerhalb einer Papierschicht räumlich werden. Beispielsweise eine aufgebrachte wässrige Probe kann in eine Anzahl von unterschiedlichen Zonen gerichtet werden mit chemischen und biochemischen Reagenzien innerhalb des Papiers gespeichert zu reagieren. Diese Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen gezeigt worden für die Entwicklung von tragbaren und kostengünstigen analytischen Tests 3, 4, 5, 6, 7 eine nützliche Plattform zu sein. Anwendungen von papierbasierten Mikrofluidik-Vorrichtungen umfassen Point-of-Care-Diagnostikef "> 8, Überwachung von Umweltschadstoffen 9, Erkennung von gefälschten Arzneimitteln 10 und delokalisiert Gesundheitswesen (oder" Telemedizin ") in limitierter Ressourceneinstellungen 11.

Mehrere Schichten von gemusterten Papier kann in eine integrierte Vorrichtung zusammengebaut werden , in dem hydrophilen Bereiche von benachbarten Schichten (dh über oder unter) verbinden kontinuierlichen fluidische Netzwerke , deren Einlässe und Auslässe zu bilden gekoppelt sein können oder unabhängig gelassen. 12 Jede Schicht kann ein einzigartiges Muster umfassen, die die räumliche Trennung von Reagenzien und multiple Assays können auf einer einzigen Vorrichtung durchgeführt werden. Die sich ergebende dreidimensionale mikrofluidischen Vorrichtung kann nicht nur Flüssigkeiten aus Docht analytischen Assays zu ermöglichen (zB Leberfunktionstests 13 und die elektrochemische Detektion von kleinen Molekülen 14), aber es kann auch supPort eine Reihe von anspruchsvollen Funktionen (zB die Ventile 15 und einfachen Maschinen 16) gemeinsam zu herkömmlichen mikrofluidischen Ansätze. Wichtig ist, weil Papier Flüssigkeiten durch Kapillarwirkung transportiert, können diese Geräte mit minimalem Aufwand von dem Benutzer bedient werden.

Da Reagenzien können in der dreidimensionalen Architektur einer papierbasierten Vorrichtung, komplexe Protokolle gespeichert werden können, auf eine Vorrichtung mit einer einzigen Zugabe von wässrigen Probe reduziert werden. Vor kurzem haben wir eine allgemeine dreidimensionale Vorrichtungsarchitektur, die für die Entwicklung von papierbasierten Immunoassays verwendet werden kann, um das Wachs-Druckverfahren unter Verwendung von gemusterten Schichten zu erzeugen. 17, 18 Diese Untersuchungen konzentrierten sich auf , wie Aspekte der Gestaltung der geräte Anzahl gestapelter Schichten, Zusammensetzung der Schichten und das Muster des dreidimensionalen mikrofluidischen Netzwerk gesteuert die Gesamt pro bezogenEntwicklung des Immunoassay. Letztlich konnten wir diese Design - Regeln zu verwenden , um die schnelle Entwicklung eines Multiplex - Immunoassay - 19 zu erleichtern. In diesem Manuskript wird ein zuvor entwickelten Immunoassay für humanes Chorion - Gonadotropin (hCG; Schwangerschaftshormon) 17 wird als ein Beispiel verwendet , um die Strategien zu veranschaulichen , die wir für die Montage und Herstellung von dreidimensionalen Papier-basierten Immunoassays entwickelt. Dementsprechend konzentrieren wir uns auf die Montage und den Betrieb einer Vorrichtung, anstatt der Entwicklung eines Assays.

In einem Sandwich-Immunoassay, der das Format verwendet wird, ist hCG zu erfassen, einen Einfang-Antikörper spezifisch für eine Untereinheit des Hormons auf ein festes Substrat aufgetragen wird, die dann die nicht-spezifische Adsorption von einer Probe oder einem späteren Reagens blockiert zu begrenzen. Dieses Substrat ist meist eine Mikrotiter - Platte (beispielsweise für ein Enzym-linked Immunosorbent Assay oder ELISA). Die Probe wird dannzu einer gut und erlaubt für einen bestimmten Zeitraum inkubiert. Nach strengen Waschen wird ein Antikörper, der spezifisch an die andere Untereinheit von hCG zugegeben und inkubieren gelassen. Dieser Nachweis-Antikörper kann zu einer kolloidalen Teilchen, Enzym oder Fluorophor, um ein messbares Signal zu erzeugen, konjugiert werden. Die Vertiefung wird erneut gewaschen , bevor die Ergebnisse eines Assays Interpretieren (beispielsweise ein Plattenlesegerät verwendet wird ). Während kommerzielle Kits auf diese zeitraub mehrstufiger Prozess verlassen, können alle diese Schritte schnell in Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen mit minimalen Eingriffen an den Benutzer durchgeführt werden.

Das Gerät für die hCG - Immunoassay verwendet wird, umfasst sechs aktive Schichten, die sind, von oben nach unten, verwendet zur Aufnahme der Probe, Konjugat Lagerung, Inkubation, zu erfassen, zu waschen, und Blot (Abbildung 1). Die Probe Zusatzschicht wird aus qualitativen Filterpapier. Es erleichtert die Einführung einer flüssigen Probe und schützt die Reagenzien in dem Konjugat Layer vor Kontamination aus der Umgebung oder versehentlichen Kontakt durch den Benutzer. Die Konjugatschicht (qualitative Filterpapier) hält die farberzeugendes Reagens (zB kolloidales Gold-markiertem Antikörper) für den Immunoassay. Die Inkubation Schicht (qualitatives Filterpapier) kann die Probe seitlich des Papiers innerhalb der Ebene zu reisen Bindung des Analyten mit den Reagenzien zu fördern, bevor die nächste Schicht erreicht, die Aufnahmeschicht. Die Erfassungsschicht (Nylonmembran) enthält Liganden spezifisch für den Analyten zu dem Material adsorbiert. Nachdem der Test abgeschlossen ist, wird diese Schicht Visualisierung des vervollständigten Immunokomplex zu ermöglichen, offenbart. Die Waschschicht (qualitative Filterpapier) zieht überschüssige Flüssigkeiten einschließlich freie Konjugat-Reagenzien weg von der Fläche der Fangschicht in die Blot-Schicht (dicke Chromatographie-Papier). Die Sechs-Schicht-Gerät wird zusammen mit fünf Schichten aus Klebstoff gemustert, doppelseitig gehalten: vier Schichten aus permanentem Kleber, die Integrität des assem haltengeblutet Vorrichtung und einer Schicht aus entfernbarem Kleber erleichtert der Vorrichtung Abschälen der Ergebnisse des Immunoassays auf der Erfassungsschicht zu untersuchen.

Für die Zwecke dieses Manuskripts, verwenden wir nur positive und negative Kontrollproben von hCG (0 mIU / ml und 81 mIU / mL, jeweils) repräsentative Ergebnisse eines papierbasierten Immunoassays zur Verfügung zu stellen, die eine engagierte Diskussion der Beziehung ermöglicht zwischen Herstellungsverfahren und die Leistung der Vorrichtung. Zusätzlich zu demonstrieren, wie Geräte erfolgreich herzustellen, markieren wir mehrere Produktionsfehler, die zum Ausfall eines Gerätes oder einer nicht reproduzierbaren Testergebnissen führen könnte. Das Protokoll und die Diskussion in diesem Manuskript detailliert wird bieten den Forschern wertvolle Einblicke, wie Papier-basierte Immunoassays sind so konzipiert und hergestellt. Während wir unsere Demonstration auf Immunoassays konzentrieren, erwarten wir, dass die hier vorgestellten Leitlinien im Großen und Ganzen für die Herstellung von dreidimens nützlich sein wirdnellen papierbasierten Mikrofluidik-Vorrichtungen.

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Protocol

1. Herstellung von Papier-basierten Mikrofluidikvorrichtung Layers

  1. Bereiten Sie Muster für Schichten aus Papier, Nylon und Klebstoff eine Grafik-Design-Software-Programm. 6 Jede Schicht kann ein anderes Muster haben.
    HINWEIS: Das Muster kann Ausrichtungslöcher enthalten, die nicht für ein funktionelles Papier-basierten Immunoassays erforderlich sind, aber mit der reproduzierbaren Herstellung von dreidimensionalen Geräte unterstützen. Platzierung dieser Löcher unterscheiden sich, wenn Geräte individuell zusammengestellt werden, in Streifen oder als Voll Blätter. Das Softwareprogramm verwendet , um Muster zu entwerfen , kann von der Wahl der Strukturierungstechnik (beispielsweise Photolithographie, Wachsdruck oder Schneiden) variieren. 6
  2. Sprühen Sie den Arbeitsbereich mit einer Lösung von 70% (v / v) Ethanol und Wasser. Wischen Sie den Arbeitsbereich mit einem sauberen Papiertuch.

2. Herstellung von Papierlagen: Probenzugabe, Konjugat Lagerung, Inkubation und Waschen Schichten

  1. Bereiten Sie Schichten von qualitativen Filterpapier eine große Tischpapierschneider. Schneiden Sie ein Lager Blatt Papier in eine Standard-Papierformat Musterung unter Verwendung eines festen Tinte (Wachs) Drucker zu erleichtern. Zum Beispiel kann eine einzelne 460 x 570 mm 2 Blatt kann 4 Blatt US - Letter Papier (8,5 x 11 Zoll 2) zu machen. Fassen Sie das Papier mit sauberen Handschuhen jederzeit Kontamination zu minimieren.
  2. Legen Sie ein Einzelblatt-Chromatographie Papier in den Drucker-Fach. Drucken zuvor entworfenen Schichten (siehe Abbildung 1).
    Hinweis: Es kann ein Muster unter Verwendung der automatischen Beschickung direkt auf dieses Blatt gedruckt werden. Nur ein Blatt Papier sollte in einer Zeit gedruckt werden, um Papierstaus zu vermeiden. Für alle Schichten, verwenden Sie die "Erweitert" Druckeinstellungen.

3. Herstellung von Nylon Membranschicht: Aufnahmeschicht

  1. Schneiden Sie die Vorratsrolle von Nylonmembran in Platten (7,5 x 10 Zoll 2) unter Verwendung eines Tischpapierschneider. Achten Sie unbedingt auf die Nylon in der HandhabungMembran ihre Integrität zu erhalten und zu schützen gegen Rippen. Bewahren Sie nicht verwendetes Material in einem Trockenschrank, wie Nylon-Membranen Feuchtigkeit empfindlich sind.
    HINWEIS: Schneiden Blätter sind schmaler als US-Letter-Papier. Da Nylon-Membranen sind dünn und zerbrechlich, können sie nicht direkt vom Drucker verarbeitet werden und Unterstützung benötigen. Details werden nachstehend erläutert.
  2. Mit Hilfe eines Wachsdrucker, drucken Sie eine Capture-Schichtstruktur auf ein Stück Kopierpapier und kleben Sie es auf einem Lichtkasten als Führung für die Positionierung der Nylonmembran zu dienen. Der Lichtkasten unterstützt die Ausrichtung von mehreren Schichten.
  3. Ein sauberes Blatt Kopierpapier auf die zuvor bedruckten Blatt Kopierpapier. Kleben Sie die leeren Blatt Papier an die Licht-Box, aber nicht Band die beiden Blätter zusammen.
  4. Legen Sie ein Einzelblatt aus Nylonmembran auf die saubere Stück Kopierpapier. Stellen Sie sicher, dass Membran den bedruckten Bereich der unteren Schicht des Kopierpapiers abdeckt. Kleben Sie alle vier Seiten der Nylonmembran auf die saubere BlattKopierpapier.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die Nylonmembran ist flach und glatt , so dass es keine Probleme mit dem Druck (zB Papierstau oder ungleichmäßiger Druck von Wachs) sind. Wachs, kann auf das Band gedruckt werden, in dem die Nylonmembran auf dem Kopierpapier befestigt ist. Wenn dies der Fall ist, Bereiche, in denen Nylon unvollständig aufgrund der Bandabdeckung wird strukturiert sollte verworfen werden. Für zukünftige Zubereitungen, größere Stücke Nylonmembran kann verwendet werden, um diese Druckfehler zu vermeiden.
  5. Legen Sie ein Blatt Nylonmembran (unterstützt durch das Kopierpapier, um es angebracht) in den manuellen Einzug Druckerfach. Drucken nur ein Blatt Nylonmembran zu einer Zeit.
    HINWEIS: Es sind keine Vorbereitungsschritte für die Blot-Schicht erforderlich, da es nicht strukturiert wird.

4. Erstellen von Hydrophobsperren in der gedruckten Schicht

  1. Kleben Sie die gedruckten Schichten auf einem Acryl-Rahmen für noch oberhalb und unterhalb der Schicht erhitzt, wenn sie in einem Schwerkraftumluftofen gelegt. Halten Sie die Nylonmembran abgeklebtdie Trägerkopierpapierblatt bis nach dem Wachs wird geschmolzen und hydrophobe Barrieren gebildet werden.
    HINWEIS: Der Acryl-Rahmen ist eine maßgeschneiderte, lasergeschnittene Stück 1/2 ".. Dicken Acryl-Kunststoff Zwei Rahmengrößen auf die Anzahl der Geräte je nach verwendetem hergestellt ist wurden die äußere Grenze des kleineren Rahmens misst 11 5/8" x 2 3/4 "und das innere Loch des Rahmens misst 10 3/8" x 1 3/4 ". der äußere Rand des größeren Rahmens 11 5/8 misst" x 8 7/8 ", und die innere Loch des Rahmens misst 10 1/4 "x 7 7/8". die offene, Innenraum für noch Wachs ermöglicht durch die gesamte Dicke des Papiers zu schmelzen.
  2. Platzieren der Schichten in dem Ofen bei 150 ° C für 30 sec, bis das Wachs in die Dicke des Papiers schmilzt. Bestätigen, dass das Wachs die Dicke des Papiers, indem sie über und Kontrolle von Unregelmäßigkeiten in der Gestaltung durchdrungen hat.
    HINWEIS: Umluftöfen oder heißen Platten können auch die feste Wachstinte zum Schmelzen verwendet werden. Schmelzzeitenoder Temperaturen können in Abhängigkeit von dem Erwärmungsverfahren variieren.
  3. Entfernen Sie das Papier und Nylonmembran aus dem Acryl-Rahmen. Auch Nylonmembran von der Unterstützung Blatt Kopierpapier entfernen.

5. Herstellung von Klebeschichten

  1. Muster doppelseitige Blätter von Klebefolien ein Roboter-Messer Plotter, mit Design-Dateien, die zuvor vorbereitet (Schritt 1.1). Schützen Sie freiliegenden Klebefläche ein Blatt Wachs Liner verwenden.
    HINWEIS: Die doppelseitige Klebstoff sollte mit Löchern strukturiert werden, dass die Probe ermöglichen, durch Schichten als ein kontinuierlicher Fluidpfad zu fließen. Das Wachs Liner leicht von dem Klebstoff entfernt wird, und es dient zum Schutz vor Verschmutzung und Reißen während des Schneidens. Ein Laserschneider oder Gesenkpresse auch Musterschichten von Klebefolien verwendet werden.

6. Sichern von Geräte Schichten mit Klebstoff

  1. Sprühen Sie das Licht-Box mit einer Lösung von 70% (v / v) Ethanol und Wasser. Wischen Sie mit einem sauberen Papier towel.
  2. Band eine gemusterte Schicht aus Papier oder Nylonmembran, die mit Klebstoff auf den Lichtkasten mit der bedruckten Seite nach unten gesichert werden muss.
  3. Peel einer Seite des Schutzfolie von der gemusterten Schicht aus Klebstoff und bringen es auf die Schicht aus Papier oder Nylonmembran. Verwenden Sie das Lichtfeld die richtige Ausrichtung von Mustern zu gewährleisten. Zusammendrücken. Legen Sie die teilweise montierte Gerät in einen Schutzschlupf.
    HINWEIS: Die Schutz Schlupf ein gefaltetes Stück Lamination Folienträger ist, die, indem sichergestellt wird, die Geräte vor Verschmutzung oder Beschädigung schützt, dass sie die Laminator Rollen nicht berühren.
  4. Übergeben Sie die erhaltene Zweischichtaufbau durch einen automatisierten Laminator den Klebstoff vollständig und Papier zusammen zu drücken, alle Taschen der Luft aus den anschließt Schichten zu entfernen.
    HINWEIS: Lufttaschen zwischen den Schichten der Vorrichtung mit Geräte Integrität beeinträchtigen kann und Reproduzierbarkeit wicking durch Leckagen verursachen.

7. Behandlung von Konjugat Layer mit Reagenzien für Immunoassays Vor der Gerätemontage

  1. Band Konjugats Schicht auf einem Acrylrahmen derart, daß die hydrophile Zone ausgesetzt ist und nicht mit dem Rahmen in Kontakt zu behandelnden.
  2. Hinzufügen, 2,5 ul 100 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu dem hydrophilen Bereich auf der Konjugatschicht. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 2 min und dann bei 65 ° C für 5 min trocknen lassen.
    HINWEIS: In diesem Band ist gerade genug, um die Zone des Papiers zu benetzen. Die BSA-Lösung hilft Aggregation der kolloidalen Nanopartikel während des Trocknungsprozesses zu verhindern, die die Freisetzung der Nanopartikel erleichtern wird, wenn das Papier und Reagenzien durch die Probe rehydratisiert werden.
  3. Zugabe von 5 & mgr; l von 5 OD kolloidalen Gold-Nanopartikel konjugiert an anti-β-hCG-Antikörper, und wiederholen den Trocknungsprozess.
    HINWEIS: Die Einheiten der Konzentration des kolloidalen Gold-Nanopartikel werden häufig als optische Dichte ausgedrückt (OD), wie sie gemessen absorbance bei λ = 540 nm. Keine Behandlung wird für den Docht Pad vor Gerätemontage in Abschnitt 10 erforderlich.

8. Behandlung von Seitenkanal mit Immuntestreagens Vor der Gerätemontage

  1. Bandseitenkanalschicht auf einem Acrylrahmen derart, daß die hydrophile Zone ausgesetzt ist und nicht mit dem Rahmen in Kontakt zu behandelnden.
  2. Zugabe von 10 & mgr; l Blockierungsmittel (5 mg / ml fettfreien Milch und 0,1% (v / v) Tween 20 in 1x PBS) zur Behandlung der Seitenkanal. Wiederholen Sie die gleiche Trocknungsvorgang (2 min bei Raumtemperatur und dann bei 65 ° C für 5 min) als Konjugatschicht.

9. Behandlung von Capture-Schicht mit Reagenzien für Immunoassays Vor der Gerätemontage

  1. Banderfassungsschicht auf einem Acrylrahmen derart, daß die hydrophile Zone ausgesetzt ist und nicht mit dem Rahmen in Kontakt zu behandelnden.
  2. Behandeln Sie die Fangschicht mit 5 & mgr; l von 1 mg / ml anti-α-hCG-Antikörper und dann lassen Sie dasProbe 2 min bei Raumtemperatur trocknen bei 65 ° C von 8 min gefolgt.
  3. Fügen Sie 2 & mgr; l Blockierungsmittel (5 mg / ml fettfreien Milch und 0,1% (v / v) Tween 20 in 1x PBS). Wiederholen Sie den Trocknungsprozess für die Fangschicht.
    HINWEIS: Dieser Betrag zu beschichten ist die Papiere ohne Verschließen der Poren der Nylonmembran, die passieren kann, wenn zu viel Blockierungsmittel verwendet, geeignet ist.

10. Montage von dreidimensionalen Papier-basierte Mikrofluidiksysteme

  1. Kleben Sie die Waschschicht auf die Licht-Box (bedruckte Seite nach oben). Wenn Ausrichtungslöcher verwendet werden, entfernen Sie sie aus aufeinanderfolgenden Schichten eine Handlochwerkzeug.
  2. Die Schutzfolie auf der Rückseite der Fangschicht den Klebstoff freizulegen. Richten Sie die Fangschicht oberhalb der Waschschicht unter Verwendung der Ausrichtungslöcher als Führung. Drücken Sie die beiden Schichten zusammen. Vermeiden, berühren, hydrophilen Bereiche Verschmutzung oder Beschädigung der Vorrichtung zu minimieren. Pinzette verwendet werden assemb zu unterstützenly.
  3. Die Schutzfolie auf der Rückseite der Inkubation Schicht den Klebstoff freizulegen. Richten Sie die Inkubation Schicht oberhalb der Fangschicht und drücken Sie sie zusammen. Fügen Sie weitere Schichten auf diese Weise, bis alle aktiven Schichten zusammengesetzt werden.
  4. Legen Sie die teilweise zusammengebaute Vorrichtung in eine Schutzschlupf und befestigen fest, die Schichten zusammen einen Laminator verwenden.
  5. Entfernen Sie die Schutzfolie auf der Rückseite der Waschschicht und bringt an der Unterseite des Geräts die Blot-Schicht. Wiederholen Laminierungsschritt 10.4 den Zusammenbau des dreidimensionalen Papierbasis Mikrofluidik-Vorrichtung zu vervollständigen. Cut gewünschte Anzahl von Geräten von Streifen oder Platten von vollständig montierten Geräte mit einer Schere.
    HINWEIS: Voll Blätter von Geräten, Streifen von Geräten oder einzelne Geräte können mit einem ähnlichen Ansatz hergestellt werden.

11. Durchführen einer Papierbasierte Immunoassays

  1. Geben Sie 20 ul einer Probe auf die hydrophilen Bereich auf der Oberseite der Vorrichtung (dh ter Probenschicht).
  2. Warten für die Probe vollständig in das Gerät zu saugen, fügen, dann 15 & mgr; l Waschpuffer (0,05% v / v Tween 20 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung). Nach der ersten Teilmenge von Waschpuffer vollständig in das Gerät böse ist, fügen Sie Waschpuffer eine zweite 15-ul-Aliquot.
    HINWEIS: Die Pufferwäsche vollständig Schlechten in das Gerät, wenn das Flüssigkeitströpfchen verschwunden ist, auf der Oberfläche des Papiers kein Meniskus zeigt. Der Test ist beendet, wenn die zweite Teilmenge von Waschpuffer vollständig in das Gerät eingedrungen ist.
  3. Um die Ergebnisse des Tests zeigen, ziehen weg , die drei oberen Schichten der Vorrichtung mit einer Pinzette die Aufnahmeschicht zu belichten.
    1. Interpretieren der Ergebnisse des Tests qualitativ durch das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Farbe beobachtet wird. Alternativ Bildschicht die Auslese einen Desktop-Scanner und die Verwendung einer Bildverarbeitungssoftware oder Algorithmen Ergebnisse zu quantifizieren und die Verteilung der Intensität innerhalb eines charakterisierenDetektionszone. 20

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Representative Results

Erhalten reproduzierbare Assay Leistungen im dreidimensionalen Papier-basierte Mikrofluidik-Vorrichtungen stützt sich auf ein Herstellungsverfahren, die Konsistenz zwischen den Geräten gewährleistet. Auf dem Weg zu diesem Ziel, haben wir eine Reihe von Herstellungsverfahren und Material Überlegungen identifiziert und diskutieren sie hier im Zusammenhang mit der Vorführung eines papierbasierten Immunoassays. Wir verwenden ein Verfahren Wachsdruck Hydrophobsperren innerhalb papierbasierten Mikrofluidik - Vorrichtungen (2A) zu bilden. 2 Dieses Verfahren ist ideal , weil es nur auf weit verbreitet Bürogeräten beruht, erfordert minimale Verfahrensschritte durchzuführen und erfordert nicht die Verwendung von Chemikalien ( zum Beispiel Photoresists) , die mit Proteinadsorption stören könnten oder die Benetzbarkeit der Papierfasern verändern. Ferner erzeugt Wachsdruck fluidischen Bahnen mit reproduzierbaren Dimensionen, die für Assays mit wiederholbare Leistung und Dauer ti kritischmes. Nachdem die hydrophoben Barrieren gebildet werden, werden Klebefolien auf die Schichten aufgetragen , um Erleichterung der Montage von dreidimensionalen Vorrichtungen (2B). Irgendwelche Reagenzien für den Immunoassay erforderlich kann aufgebracht werden , nachdem die Klebefolie auf der Rückseite eine Schicht (2C) hinzugefügt wird. Dieses Verfahren ist für die Herstellungsprozesse in einem akademischen Labor nützlich, da viele Geräte parallel hergestellt werden. Das Montageverfahren für eine Vorrichtung für ein Immungssay abgeschlossen ist , nachdem alle Schichten der Vorrichtung gestapelt und miteinander laminiert (Figur 2D). Wir fügen Probe den Test zu beginnen. In diesem Beispiel verwenden wir eine Urinkontrolle für Schwangerschaftstests festgelegt, die im Puffer negativen und positiven Proben von hCG enthält, wie die Proben den Betrieb unserer Geräte zu demonstrieren und die Reproduzierbarkeit von Tests durchgeführt, sie zu benutzen. Zwei Aliquots des Waschpuffers werden dann nacheinander zugegeben. Sobald die endgültige aliquote Menge von Waschpuffer vollständig in das Gerät eingedrungen, dieTest wird als abgeschlossen betrachtet. Die oberen drei Schichten werden dann abgezogen , um die Aufnahmeschicht (3A) offenbaren. Dieser Schritt irreversibel schädigt die Vorrichtung sicherstellt, dass es nicht wieder verwendet werden kann. Der Abschluss einer papierbasierten Immunoassays führt zu einer qualitativen Farbanzeige, die eine negative oder positive Ausgang bei visueller Prüfung anzeigen. Die Objektivität dieser Ergebnisse ist offensichtlich in unkorrigierten Bilder mit einem Flachbettscanner (3B) erworben.

Fehlgeschlagene Versuche können oft bestimmte Verfahrensschritte hervorheben, deren Bedeutung kann sonst nicht wahrnehmbar sein, wenn die Analyse eines Experiments auf erfolgreiche Ergebnisse fokussiert. Wir zeigen drei Fehler in der Herstellung und Montage von dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen, die in Ausfälle des Immunoassays zur Folge: (i) Gelegentlich Geräteausfälle sind nicht ersichtlich, bis nachdem ein Test abgeschlossen ist. Zum Beispiel kann ein misalignment zwischen Schichten der Inkubation Kanal und Einfangzone umfasst , kann die Entwicklung eines unregelmäßigen Musters in dem positiven Signal verursacht, was in der Fehlinterpretation des qualitativen Signals von einem Benutzer (4A) führen kann. (Ii) Wenn das Wachs nicht in einer ausreichenden Menge, gedruckt wird oder nicht vollständig durch die gesamte Dicke des Papiers zu schmelzen gelassen, dann ist die Integrität der resultierenden hydrophoben Barrieren beeinträchtigt sein kann. Unvollständige Bildung dieser Barrieren wird ein Verlust der Kontrolle über die Feuchtigkeitsregulierung führen und zu Undichtigkeiten im Gerät führen. Anstatt beispielsweise innerhalb eines Schichtströmung auf einen Kanal zu beschränken, eine semipermeable wird wax Sperrflüssigkeit ermöglichen anderer Stelle in der Ebene des Papiers zu Docht. Ohne definierte Kanäle ist die Probe unwahrscheinlich, dass die Erfassung oder Waschschichten zu erreichen. Der Benutzer wird wahrnehmen, diese Art von Fehler als stark verkürzt Testdauer. Wir zeigen diese Geräteausfall durch eine Lösung von rote Lebensmittelfarbe auf eine la Anwendungyer , deren Wachsmuster war nicht für die volle 30 Sekunden (4B) schmelzen gelassen. Ein Immunoassay, eine solche Schicht "abgeschlossen" wurde unter Verwendung der in 6 min, die als die erwartete Dauer von 15 min deutlich unterscheidet. (Iii) Assays, die länger dauern als erwartet, zu einer Fehlfunktion bei der Herstellung einer Vorrichtung zur Vervollständigung hinweisen. Beispielsweise geschnitten unsachgemäß Klebstoff oder okkludierten Poren aufgrund der Anwendung einer übermßigen Menge von Reagenzien (zB Blockierungsmittel oder kolloidales Gold) , um eine Probe oder Waschpuffer vom Eingabe der Vorrichtung (4C) verbieten kann.

Insgesamt ist unser Herstellungsprotokoll nützlich zahlreiche papierbasierte Mikrofluidik-Vorrichtungen parallel auf einer Skala herzustellen, die für eine wissenschaftliche Labor nützlich ist. Wir zeigen die Leistung des hCG papierbasierten Immunoassay unter Verwendung dieses Verfahrens hergestellt, indem man 70 Assays parallel durchführen: 35 negativ Replikaten und 35 positive replicates. Für die Zwecke dieser Demonstration, bereiteten wir eine Reihe von Schichten mit den Designs unserer Vorrichtung, befestigt, um die Schichten aus Papier mit Klebstoff und schneiden dann die Blätter in Reihen von Geräten. Jedes Blatt wurde in sieben Reihen geschnitten, die zehn Geräte enthalten. Dies erleichtert die Anordnung der Schichten auf den kleineren Acryl Rahmen, bei denen die Schichten geklebt werden und dann mit Reagenzien behandelt, benötigt, um die Assays durchzuführen. Dieses Verfahren der Vorrichtung Zubereitung wird in einem in dem Protokoll vorgeschlagen. Nach der Behandlung der Schichten wurden die Vorrichtungen in Streifen von zehn zusammengebaut und laminiert dann. Nach der letzten Schritte Vorrichtungsherstellung abgeschlossen waren, blieben die Vorrichtungen in den Streifen von zehn und die Probe wurde zu jedem Gerät hinzugefügt. Wir beobachteten eine 0% Ausfallrate für Geräte hergestellt unser Protokoll. Wir verwendeten eine Open-Source - Bildverarbeitungssoftware 20 , die die Ergebnisse dieser Tests zu quantifizieren. Während eine Reihe von Verfahren sind verfügbar, um die Intensität zu analysieren distributIon in runde Flecken (zB radiale oder lineare Verteilungen) 21 messen wir die Intensität von den grünen Kanal eines den gesamten Erfassungsfleck als eine Region von Interesse mit dem Gerät Bild von RGB bedeuten. 17, 18, 19 Wir normalisieren dann die Messungen sowohl positive als auch negative Tests durch die rohen negative Daten (3B) subtrahiert wird . Wir stellten fest, den Variationskoeffizienten für jeden Datensatz 1% zu sein für Tests unter Verwendung von negativen Proben durchgeführt und 3% für Tests unter Verwendung von positiven Proben.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der dreidimensionalen Papier-basierten Gerät. Diese Abbildung zeigt die hydrophobe und hydrophile Bereiche, die die fluidische Weg innerhalb der Vorrichtung zu definieren, sowie die patterned Schichten von permanenten und entfernbaren Klebstoff, die Schichten zusammenhalten. Jede Schicht wird durch die Funktion markiert es in dem Assay durchführt. Die roten, blauen oder grünen Umriss auf jeder Schicht zeigt das Material, das spezifische Schicht herzustellen verwendet (rot: Chromatographie-Papier, blau: Nylonmembran, grün: dicke Chromatographie-Papier). Die Abmessungen sind für jede Zone innerhalb der Vorrichtung in mm angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Verfahren verwendeten Immunoassays aus dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidische Vorrichtungen herzustellen. (A) Bilder von der Vorder- und Rückseite eines Blatts Papier Chromatographie unter Verwendung von Wachsdruck gemustert vor und nach dem Erhitzen. (B) Ein Blatt Chromatographiepapiermit einem Film aus gemusterter Klebstoff gesichert. (C) Die Behandlungen auf die hydrophilen Bereiche eines Streifens von gemusterten Nylonmembran aufgebracht. (D) Montage der Streifen eines mehrschichtigen Vorrichtung einen Lichtkasten und Ausrichtungslöcher als Leitfaden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Interpretation der Ergebnisse einer Papier-basierten Immunoassay. (A) Die oberen drei Schichten des papierbasierten Gerät abgezogen , um die Aufnahmeschicht freizulegen und die Ergebnisse des Tests zu interpretieren. (B) Grafische Darstellung der Leistung eines papierbasierten Immunoassay für hCG. Die dargestellten Ergebnisse sind die Mittelwerte von 70 Replikaten gleichzeitig durchgeführt, wobei 35 jeweils repliziert fo verwendet werdenr positive und negative Proben von hCG. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Datensatzes. Uncorrected, repräsentative Bilder zeigt positive (rote Farbe) und negativen (weiße Farbe) resultiert aus einem hCG-Immunoassay sind über ihre jeweiligen Daten angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Beispiele für Herstellungsfehler. (A) aufgrund einer Fehlausrichtung des Seitenkanals über der Erfassungsschicht, wobei die positive Signal wird in einem kleinen Bereich der Auslesezone konzentriert. A "wet" kreisförmigen Bereich (gestrichelter Kontur) auf der rechten Seite der Auslesezone durch Berührung mit der Erfassungsschicht (links) zwischen dem fehlausgerichteten Seitenkanal beobachtet werden. Bild einer positiven Anzeige aufdie Fangschicht eines richtig ausgerichtet Vorrichtung (rechts). (B) Unvollständiges Schmelzen des Wachses in der gesamten Dicke einer Schicht kann innerhalb der Vorrichtung zu Undichtigkeiten führen. Lebensmittelfarbe wurde zu der Lösung hinzugefügt, mit Visualisierung der Probe zu unterstützen, in Schichten mit unvollständigen oder vollständig gebildete hydrophobe Barrieren. (C) nicht ordnungsgemäß geschnitten Klebstoff kann das fluidische Netzwerk zwischen Papierschichten blockieren, die den Fluss einer Probe stoppt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen. Die schematische veranschaulicht die Montage und Laminieren von mehreren Schichten von gemusterten Papier in fertig dreidimensionale Geräte. In diesem Beispiel 70 c Vorrichtungeneine gleichzeitig durchgeführt werden. Die Klebstoffschichten und Ausrichtungslöcher wurden aus dem Schaltplan zur Vereinfachung entfernt. Nach der Montage können einzelne Geräte entfernt und in Tests verwendet werden. Die roten, blauen und grünen Umrisse auf jeder Ebene zeigen, das Material, das spezifische Schicht herzustellen verwendet (rot: Chromatographie-Papier, blau: Nylonmembran, grün: dicke Chromatographie-Papier). Der Maßstabsbalken = 25 mm mit Ausnahme der separaten Einrichtung (rechts), die Abmessungen von 12 x 28 mm 2 aufweist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

eine reproduzierbare Fertigungsstrategie zu identifizieren, ist ein wesentlicher Bestandteil der Assay-Entwicklung. 22 Wir verwenden eine sequenzielle, Schicht- für -Schicht - Ansatz dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidische Vorrichtungen herzustellen. Im Gegensatz zu diesen Methoden , die Falten oder Origami - Techniken anwenden , mehrschichtige Vorrichtungen aus einem einzigen Blatt Papier zu erzeugen , 23, 24 additives Herstellungsverfahren bietet eine Reihe von Vorteilen: (i) Mehrere Materialien können für in einem einzigen Gerät Architektur ohne Änderung Verfahren eingebracht werden der Druck, Ausrichtung oder Anordnung von Schichten. (Ii) Gemusterte Klebefolien können in den Montageprozess integriert werden. Diese Folien befestigen angrenzenden Schichten, und auf der Grundlage der Festigkeit des Klebstoffes kann reversibel sein, damit Abschälen und Auswertung von inneren Schichten. Darüber hinaus bieten Klebstoffe strukturelle Integrität der dreidimensionalen Vorrichtung, die die Notwendigkeit ausschließtfür Bindemittel 25 Clips oder bearbeitete Gehäuse. 23 (iii) Einzelblätter US Letter Chromatographiepapier kann ein Array von Replikaten, aufzunehmen , die den Durchsatz von Labormaßstab Herstellungs erheblich verbessern kann (Abbildung 5). Dies ist besonders vorteilhaft, wenn zahlreiche experimentellen Bedingungen die Bewertung, die technische Replikate benötigen. Durch diesen Ansatz 70 dreidimensionale papierbasierte Geräte können gleichzeitig hergestellt werden. (iv) Ähnliche Mehrschichtlaminierung Ansätze werden für die großvolumige Herstellung von zahlreichen kommerziellen Produkten im Gesundheitswesen verwendet (beispielsweise Wundauflagen und transdermale Pflaster), was folglich die Produktionsbarriere senkt diese dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen zu übersetzen.

Zusätzlich Abschälen und Montage zu erleichtern, ist die Wahl des Klebers auch entscheidend für die Konstruktion des dreidimensionalen fluidische Netzwerk. Eine Anzeigehesive Film kann als eine zusätzliche Barriere zwischen Papierschichten dienen, die Maskierung von hydrophilen Zonen auf benachbarten Schichten ermöglichen kann. In der Praxis ist die Verwendung von dünnen Schichten von Klebstoff wünschenswert. Wenn der Klebstoff zu dick ist (beispielsweise viele doppelseitige Bänder), dann wird der Spalt zwischen Papierschichten gebildet wird zu groß sein , um zu erleichtern wicking und muss mit einer hydrophilen Substanz (zB Cellulosepulver) -Funktion wieder gefüllt werden. 12 Während dieser zusätzliche Schritt Komplexität hinzufügt herzustellen und die Substanz verwendet wird, kann bei einigen Assays stören, werden diese Lücken eine nützliche Funktion für die Erzeugung von steuerbarer, fluidischen Niederdrückventile. 15 Andere Formen von Klebstoff wurden bei der Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis Mikrofluidik - Vorrichtungen verwendet. Klebesprays bieten eine einfache Methode zum Anbringen Schichten miteinander. 26 Die Verwendung dieser Methode wird das Klebematerial gleichmäßig auf beide t angewandter hydrophoben und hydrophilen Bereich des Papiers. Ein Vorteil dieser Methode ist , dass zusätzliche Geräte (zB Messer Plotter oder Laserschneider) ist nicht das Muster für die Klebeschicht zu entwerfen benötigt. Allerdings müssen die Bedingungen für die einheitliche Anwendung des Sprühkleber bestimmt werden experimentell für jede Art des verwendeten Materials. Die Topographie des Materials kann der Klebstoff-Material-Grenzfläche beeinflussen und längere Sprühzeiten kann rauhere Oberflächen benötigt werden. Zusätzlich kann durch Veränderung der Benetzbarkeit des Papiers in gestörter wicking führen Klebstoff auf die hydrophilen Bereiche des fluidischen Weg Aufsprühen. Alternativ kann die Verwendung von Schablonen 27 oder Bildschirm 8 Drucken direkt auf Schichten aus gemustertem Papier Muster Klebstoff verwendet werden.

Zwei wichtige Überlegungen für die Entwicklung von dreidimensionalen Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen sind die Wahl der Materialien und die Konstruktion des fluidic-Netzwerk. (I) Wir wählen Materialien und Kombinationen von Materialien auf Basis von Sauggeschwindigkeit, Nassfestigkeit, Stärke und Protein-Bindungskapazität. Sauggeschwindigkeit die Dauer eines Tests beeinflussen und die Menge an Zeit Reagenzien reagieren müssen oder in einer Schicht gebunden. Verschiedene Papiersorten zeichnen sich durch Raten basierend auf, beispielsweise Feuchtigkeitsregulierung, die Behandlung des Papiers, seine Porosität und seine Dicke. Es ist möglich, mehrere Schichten von Papier zur Erhöhung der effektiven Saugrate einer Vorrichtung zu verwenden. 28 Eine gute Nassfestigkeit ist wünschenswert für Anwendungen , die erfordern Handhabung (beispielsweise Abschälen eines Immunoassays) , nachdem das Gerät mit einer Probe gesättigt ist. Materialien , die zu dick sind oder sich nicht durch kommerzielle Drucker aufgrund Fragilität weitergegeben wird ein alternatives Verfahren erfordern strukturierte Kanäle zu erzeugen (zB Photolithographie). Doch im Gegensatz dickere Materialien sind ideal für Blot-Schichten (oder Senken) Flüssigkeiten durch th zu ziehene-Gerät. Viele Qualitäten von Nylon-Membranen sind im Handel erhältlich, welche in ihrer Fähigkeit, Proteine ​​zu binden irreversibel an die Einfangzone unterscheiden. Material Substitutionen (beispielsweise Nitrocellulose anstelle einer Nylonmembran) kann auch beeinflussen Bindungskapazität, die die Empfindlichkeit des Assays beeinträchtigen kann. (ii) Die Verwendung von Symmetrie in der Gestaltung von fluidische Netzwerke gewährleistet , dass die einzigartigen gemusterten Kanäle in dreidimensionale Geräte verhalten sich identisch (beispielsweise gefüllt gleichzeitig), die für Multiplex - Assays kritisch ist. 19 Symmetrie weiter vereinfacht Schichtdesign, hilft bei der Schicht Ausrichtung , wenn sie voll Blätter von Geräten Montage und Abfall zu minimieren. Modifikationen an dem Gerätedesign kann die Leistung des Assays beeinflussen. Zum Beispiel wird die Länge des Seitenkanals in der Inkubation Schicht Erhöhung beeinflussen die Dauer des Tests, da die Flüssigkeit einen proportional längeren Abstand vor dem Erreichen der ou Docht wirdtlet. 17 In Anwendungen , die auf der Bindung eines Ziel - Biomolekül verlassen, eine längere Testzeit vorteilhaft sein kann , weil sie den Anteil an gebundenem, markierten Spezies vor der Immobilisierung auf der Erfassungsschicht erhöhen kann.

Zusammenfassend haben wir ein Verfahren zur Herstellung dreidimensionaler Papierbasis mikrofluidischen Vorrichtungen dargestellt, die die Entwicklung von Immunoassays unterstützen. Dieses Verfahren, das eine Art von Additiv Herstellungs verwendet mehrschichtige Vorrichtungen herzustellen, ermöglicht die Herstellung von Vorrichtungen in einem Maßstab, der für Laborforschung geeignet ist. Das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben ist spezifisch für papierbasierte Immunoassayvorrichtungen; erwarten wir jedoch die auf die Montage dieser Immunoassays-Wachsdruck im Zusammenhang mit Verfahren, Klebstoff Strukturieren, Orientierungsschichten, und lamellen wird auf zahlreiche dreidimensionale papierbasierten Mikrofluidik-Vorrichtung Architekturen leicht erweiterbar sein. Ein Verständnis der Herstellungsmethode kann dazu führen,auf die Entwicklung neuer Point-of-Care-Tests mit einer breiten Palette von Anwendungen im Gesundheitswesen, Umwelt und Landwirtschaft.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illustrator CC Adobe to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer Amazon B00R92C9DI to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven Fisher Scientific 15-103-0509 to melt wax into paper
Artograph LightTracer Amazon B000KNHRH6 to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator Amazon B00AXHSZU2 to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter Graphtec America CE6000-40 to pattern adhesive films
Swingline paper cutter Amazon B0006VNY4C to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner Amazon B000VG4AY0 to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch McMaster-Carr 3488A9 to remove alignment holes 
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 Sigma Aldrich WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)  Fisher Scientific 05-714-4 to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) Pall Corporation NBCHI3R to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF021621 to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF051521
wax liner FLEXcon FLEXMARK 80 D/F PFW LINER to assist with patterning adhesive
acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266  to fabricate frame
self-adhesive sheets Fellowes CRC52215 to use as protective slip
absolute ethanol VWR 89125-172 to sanitize work area
bovine serum albumin AMRESCO 0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls Fisher Scientific 22-071-066 to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) Arista Biologicals  CGBCG-0701 to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody Arista Biologicals  ABACG-0500 to treat capture layer
10X phosphate buffered saline Fisher Scientific BP3991
Oxoid skim milk powder Thermo Scientific OXLP0031B
Tween 20 AMRESCO M147

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References

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