La fabricación de dispositivos de microfluidos basados ​​en papel tridimensional para inmunoensayos

Published 3/09/2017
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Bioengineering

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Summary

Nos detalle un método para fabricar dispositivos microfluídicos basados ​​en papel tridimensionales para su uso en el desarrollo de inmunoensayos. Nuestro enfoque de conjunto de dispositivo es un tipo de múltiples capas, la fabricación aditivo. Demostramos un inmunoensayo sándwich para proporcionar resultados representativos de estos tipos de dispositivos basados ​​en papel.

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Fernandes, S. C., Wilson, D. J., Mace, C. R. Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays. J. Vis. Exp. (121), e55287, doi:10.3791/55287 (2017).

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Abstract

Papel absorbe los líquidos de manera autónoma debido a la acción capilar. Modelando papel con barreras hidrofóbicas, el transporte de fluidos puede ser controlada y dirigida dentro de una capa de papel. Por otra parte, apilar varias capas de papel con diseño crea redes de microfluidos tridimensionales sofisticados que pueden apoyar el desarrollo de ensayos analíticos y bioanálisis. dispositivos microfluídicos basados ​​en papel son de bajo costo, portátil, fácil de usar, y no requieren ningún equipo externo para funcionar. Como resultado, ellos son una gran promesa como una plataforma para el diagnóstico de punto de atención. Con el fin de evaluar correctamente la utilidad y el rendimiento analítico de los dispositivos basados ​​en papel, métodos adecuados deben ser desarrollados para asegurar su fabricación es reproducible y a una escala que es apropiado para entornos de laboratorio. En este manuscrito, un método para fabricar una arquitectura general del dispositivo que se puede utilizar para los inmunoensayos basados ​​en papel se describe. Utilizamos una forma de fabricar em aditivog (laminado multicapa) para preparar dispositivos que comprenden varias capas de papel con diseño y el adhesivo con diseño. Además de demostrar el uso apropiado de estos dispositivos microfluídicos basados ​​en papel tridimensionales con un inmunoensayo para la gonadotropina coriónica humana (hCG), se discuten los errores en el proceso de fabricación que pueden resultar en fallos de dispositivos. Esperamos que este enfoque para la fabricación de dispositivos basados ​​en papel encontrarán una amplia utilidad en el desarrollo de aplicaciones analíticas diseñadas específicamente para entornos de recursos limitados.

Introduction

El papel es ampliamente disponibles en una variedad de formulaciones o grados, se pueden funcionalizar para sintonizar sus propiedades, y pueden transportar fluidos autónoma por acción capilar o de mecha. Si el papel se modela con una sustancia hidrófoba (por ejemplo, resina fotosensible 1 o cera 2), el efecto de mecha de los fluidos puede ser controlado espacialmente dentro de una capa de papel. Por ejemplo, una muestra acuosa aplicada puede ser dirigido en una serie de diferentes zonas para reaccionar con reactivos químicos y bioquímicos almacenados dentro del papel. Estos dispositivos microfluídicos basados en papel se han demostrado ser una plataforma útil para el desarrollo de ensayos de análisis portátiles y de bajo costo 3, 4, 5, 6, 7. Aplicación de los dispositivos de microfluidos en papel incluyen el diagnóstico de punto de atenciónef "> 8, la vigilancia de los contaminantes ambientales 9, la detección de productos farmacéuticos falsificados 10, y la asistencia sanitaria deslocalizada (o" telemedicina ") en los recursos limitados ajustes 11.

Las múltiples capas de papel estampado pueden montarse en un dispositivo integrado donde las zonas hidrófilas de las capas vecinas (es decir, por encima o por debajo) se conectan para formar redes de fluidos continuos cuyas entradas y salidas pueden estar acoplados o hacia la izquierda independiente. 12 Cada capa puede comprender un patrón único, que permite la separación espacial de los reactivos y múltiples ensayos a realizar en un solo dispositivo. El dispositivo de microfluidos resultante tridimensional no sólo es capaz de drenar fluidos que permitan a ensayos analíticos (por ejemplo, pruebas de función hepática 13 y la detección electroquímica de moléculas pequeñas 14), pero también puede suppuerto de una serie de funciones sofisticadas (por ejemplo, las válvulas 15 y simples máquinas 16) comunes a los enfoques tradicionales de microfluidos. Es importante destacar que, porque el papel absorbe fluidos por acción capilar, estos dispositivos pueden ser operados con un mínimo esfuerzo por parte del usuario.

Desde reactivos se pueden almacenar dentro de la arquitectura tridimensional de un dispositivo basado en papel, protocolos complejos se pueden reducir a una sola adición de la muestra acuosa a un dispositivo. Recientemente, hemos introducido una arquitectura de dispositivo tridimensional general que puede ser utilizado para el desarrollo de inmunoensayos basados ​​en papel usando la técnica de la cera de impresión para crear capas estampadas. 17, 18 Estos estudios se centraron en cómo los aspectos relacionados con el diseño del dispositivo de número de capas apiladas utilizan, la composición de las capas, y el patrón de la red de microfluidos controlado por el conjunto de tres dimensionesrendimiento del inmunoensayo. En última instancia, hemos sido capaces de utilizar estas reglas de diseño para facilitar el rápido desarrollo de un inmunoensayo multiplexado 19. En este manuscrito, un inmunoensayo desarrollado previamente para la gonadotropina coriónica humana (hCG; hormona del embarazo) 17 se utiliza como un ejemplo para ilustrar las estrategias que hemos desarrollado para el montaje y la fabricación de los inmunoensayos basados en papel tridimensionales. De acuerdo con ello, nos centramos en el montaje y funcionamiento de un dispositivo en lugar del desarrollo de un ensayo.

En un inmunoensayo de tipo sándwich, que es el formato utilizado para detectar hCG, un anticuerpo de captura específico para una subunidad de la hormona se reviste sobre un sustrato sólido, que se bloquea entonces para limitar la adsorción no específica de una muestra o cualquier reactivo posterior. Este sustrato es muy a menudo una placa de micropocillos de poliestireno (por ejemplo, para un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas o ELISA). La muestra es entoncesañadido a un pozo y se deja incubar durante un período de tiempo. Después del lavado riguroso, se añade un anticuerpo específico para la otra subunidad de hCG y se dejó incubar. Este anticuerpo de detección puede ser conjugado a una partícula coloidal, enzima, fluoróforo o con el fin de producir una señal medible. El pocillo se lava de nuevo antes de la interpretación de los resultados de un ensayo (por ejemplo, usando un lector de placas). Mientras que los kits comerciales se basan en este proceso de múltiples pasos que consume tiempo, todos estos pasos se pueden realizar rápidamente en dispositivos de microfluidos en papel con una intervención mínima del usuario.

El dispositivo que se utiliza para el inmunoensayo de hCG comprende seis capas activas, que son, de arriba hacia abajo, que se utiliza para la adición de la muestra, almacenamiento conjugado, la incubación, la captura, lavado, y blot (Figura 1). La capa de adición de la muestra está hecha de papel de filtro cualitativo. Se facilita la introducción de una muestra líquida y protege los reactivos en el Laye conjugador de la contaminación del medio ambiente o el contacto accidental por parte del usuario. La capa de conjugado (papel de filtro cualitativo) mantiene el reactivo productor de color (por ejemplo, anticuerpo marcado con oro coloidal) para el inmunoensayo. La capa de incubación (papel de filtro cualitativo) permite que la muestra de viajar lateralmente dentro del plano del papel para promover la unión del analito con reactivos antes de llegar a la siguiente capa, la capa de captura. La capa de captura (membrana de nylon) contiene ligandos específicos para el analito adsorbido en el material. Después de que se completó el ensayo, esta capa se revela para permitir la visualización del inmunocomplejo completado. La capa de lavado (papel de filtro cualitativo) dibuja el exceso de líquidos que incluyen reactivos conjugados libres de distancia de la superficie de la capa de captura en la capa de transferencia (papel de cromatografía de espesor). El dispositivo de seis capas se mantiene unido por cinco capas de adhesivo modelada, de doble cara: cuatro capas de adhesivo permanente a mantener la integridad de la assemdispositivo de sangrado y una capa de adhesivo desprendible facilita el pelado del dispositivo para inspeccionar los resultados del inmunoensayo en la capa de captura.

A los efectos de este manuscrito, utilizamos solamente las muestras de control negativo y positivo de hCG (0 mUI / ml y 81 mUI / ml, respectivamente) para proporcionar resultados representativos de un inmunoensayo basado en papel, que permite una discusión dedicado de la relación entre métodos de fabricación y el funcionamiento de un dispositivo. Además de demostrar cómo fabricar dispositivos con éxito, destacamos varios errores de fabricación que podrían conducir a la falla de un dispositivo o de los resultados del ensayo irreproducibles. El protocolo y la discusión se detalla en este manuscrito se proporcionar a los investigadores información valiosa sobre cómo los inmunoensayos basados ​​en papel son diseñados y fabricados. Mientras que nos centramos nuestra demostración en inmunoensayos, anticipamos que las directrices que se presentan en este documento serán ampliamente útil para la fabricación de las tres dimensional en papel en dispositivos de microfluidos.

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Protocol

1. Preparación de Capas dispositivo de microfluidos basados ​​en papel

  1. Preparar las pautas de capas de papel, nylon, y el adhesivo usando un programa de software de diseño gráfico. 6 Cada capa puede tener un patrón diferente.
    NOTA: El patrón puede incluir orificios de alineación que no son necesarios para un inmunoensayo basado en papel funcional, pero ayudar con la fabricación reproducible de los dispositivos tridimensionales. La colocación de estos agujeros será diferente si los dispositivos se ensamblan de forma individual, en tiras, o como hojas completas. El programa de software usado para diseñar los patrones puede variar en función de la elección de la técnica de modelado (por ejemplo, fotolitografía, impresión de la cera, o de corte). 6
  2. Pulverizar el área de trabajo con una solución de 70% (v / v) de etanol y agua. Limpie el área de trabajo con una toalla de papel limpia.

2. Preparación de capas de papel: Muestra Además, conjugado de almacenamiento, incubación, y capas de preparación

  1. Preparar capas de papel de filtro cualitativo utilizando un gran cortador de papel de sobremesa. Cortar una hoja de balance de papel en un tamaño de papel estándar para facilitar el modelado usando una impresora de tinta sólida (cera). Por ejemplo, un solo 460 x 570 mm 2 hojas puede hacer 4 hojas de papel Carta EE.UU. (8,5 x 11 pulgadas 2). La carga de papel con guantes limpios en todo momento para minimizar la contaminación.
  2. Cargar una hoja de corte de papel de cromatografía en la bandeja de la impresora. Imprimir capas diseñadas previamente (ver Figura 1).
    NOTA: Un patrón puede ser impreso directamente sobre esta hoja utilizando la alimentación automática. Sólo una hoja de papel se debe imprimir a la vez para evitar los atascos de papel. Para todas las capas, utilice la configuración de impresión "mejoradas".

3. Preparación de Nylon capa de membrana: capa de captura

  1. Cortar el material en rollo de membrana de nylon en forma de láminas (7,5 x 10 pulgadas 2) usando un cortador de papel de sobremesa. Tenga mucho cuidado al manejar el nylonmembrana para mantener su integridad y proteger contra la rasgadura. Almacenar cualquier material no utilizado en un armario desecador, como membranas de nylon son sensibles a la humedad.
    NOTA: Cortar las hojas son más estrechas que el papel de carta de los EEUU. Debido a membranas de nylon son delgadas y frágiles, que no pueden ser procesados ​​por la impresora directamente y requieren apoyo. Los detalles se describen a continuación.
  2. El uso de una impresora de cera, imprima un patrón de capa de captura sobre un pedazo de papel de copia y la cinta a una caja de luz para servir como una guía para la colocación de la membrana de nylon. La caja de luz ayuda a la alineación de múltiples capas.
  3. Coloque una hoja de papel de copia en la hoja impresa de papel de copia. Cinta de la hoja de papel en blanco de la caja de luz, pero no de cinta las dos hojas juntas.
  4. Coloque una hoja de corte de la membrana de nylon sobre el pedazo de papel en blanco de la copia. Asegúrese de que la membrana cubre el área impresa de la capa inferior de papel de copia. Cinta de los cuatro lados de la membrana de nailon a la hoja limpiadel papel de copia.
    NOTA: Asegúrese de que la membrana de nylon es plana y lisa para que no haya problemas con la impresión (por ejemplo, los atascos de papel o impresión desigual de cera). Cera puede ser impreso en la cinta, donde la membrana de nailon se une al papel de copia. Si esto ocurre, las zonas donde nylon se modela de forma incompleta debido a la cobertura de la cinta debe ser desechada. Para las preparaciones futuras, grandes piezas de membrana de nylon se pueden utilizar para evitar este error de impresión.
  5. Cargue una hoja de membrana de nylon (apoyado por el papel de copia pegada a ella) en la bandeja de alimentación manual de la impresora. Imprimir sólo una hoja de membrana de nylon a la vez.
    NOTA: No hay pasos de preparación necesarios para la capa de transferencia, ya que no es el modelo.

4. La creación de barreras hidrofóbicas en la capa impresa

  1. Cinta de las capas impresas sobre un marco de acrílico para el calentamiento uniforme por encima y debajo de la capa cuando se coloca en un horno de convección por gravedad. Mantenga la membrana de nylon pegado ala lámina de soporte de papel de copia hasta después de que la cera se funde y se forman las barreras hidrofóbicas.
    NOTA: El marco de acrílico es una pieza cortada por láser a medida de 1/2 ".. Plástico acrílico de espesor Dos tamaños de trama en función del número de dispositivos que se fabrican se utilizaron El borde exterior del marco más pequeño mide 11 5/8" x 2 3/4 ", y el agujero interior del marco mide 10 3/8" x 1 3/4 ". el borde exterior del marco más grande mide 11 5/8" x 8 7/8 ", y el interior orificio del bastidor mide 10 1/4 "x 7 7/8". el espacio abierto, interno permite la fusión uniforme de cera a través de todo el grosor del papel.
  2. Colocar las capas en el horno a 150 ° C durante 30 segundos hasta que la cera se funde en el espesor del papel. Confirmar que la cera se ha impregnado el espesor del papel dándole la vuelta y la comprobación de las imperfecciones en el diseño.
    NOTA: Forced hornos de aire o placas calientes también se pueden usar para fundir la tinta cera sólida. tiempos de fusióno las temperaturas pueden variar dependiendo del método de calentamiento.
  3. Retire el papel y membrana de nylon del marco de acrílico. Además, quite membrana de nylon de la hoja de apoyo de papel de copia.

5. Preparación de capas adhesivas

  1. Patrón de hojas a doble cara de las láminas adhesivas utilizando un trazador cuchillo robótica, utilizando archivos de diseño preparadas previamente (paso 1.1). Proteger cualquier superficie adhesiva expuesta utilizando una lámina de revestimiento de cera.
    NOTA: El adhesivo de doble cara debería ser diseñado con agujeros que permiten que la muestra fluya a través de las capas como una vía de fluido continuo. El revestimiento de cera se retira fácilmente del adhesivo, y sirve para protegerlo de la contaminación y el desgarro durante el corte. Un cortador de láser o mueren de prensa también puede ser usado para las capas de patrón de las películas adhesivas.

6. Soporte de capas de dispositivos con Adhesivo

  1. Pulverizar la caja de luz con una solución de 70% (v / v) de etanol y agua. Limpie con un papel limpio tOwel.
  2. Cinta de una capa modelada de papel o membrana de nylon que necesita ser respaldada con adhesivo sobre la caja de luz con la cara impresa hacia abajo.
  3. Peel un lado del revestimiento protector de la lámina de adhesivo y fijar a la capa de papel o membrana de nylon. Utilice la caja de luz para asegurar una alineación correcta de los patrones. Presione al mismo tiempo. Coloque el dispositivo parcialmente montado en un deslizamiento de protección.
    NOTA: El deslizamiento de protección es una pieza doblada de soporte de film de laminación que protege los dispositivos de contaminación o daños al asegurar que no entren en contacto los rodillos laminadores.
  4. Pasar el montaje de dos capas resultante a través de un laminador automatizado para presionar completamente el adhesivo y el papel en conjunto, la eliminación de las bolsas de aire de las capas adosadas.
    NOTA: bolsas de aire entre las capas del dispositivo pueden interferir con la integridad del dispositivo y que absorbe la reproducibilidad, causando fugas.

7. Tratamiento de conjugado LAyer con reactivos para inmunoensayos antes del montaje del dispositivo

  1. Tape capa conjugado a un marco acrílico tal que la zona hidrófila de ser tratado se suspende y no en contacto con el marco.
  2. Añadir 2,5 l de 100 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la zona hidrófila de la capa de conjugado. Deje que se seque a temperatura ambiente durante 2 minutos y después a 65 ° C durante 5 min.
    NOTA: Este volumen es suficiente para humedecer la zona del papel. La solución de BSA ayuda a evitar la agregación de las nanopartículas coloidales durante el proceso de secado, lo que facilitará la liberación de las nanopartículas cuando el papel y los reactivos se rehidratan por la muestra.
  3. Añadir 5 l de 5 OD coloidal de nanopartículas de oro conjugado con anticuerpo anti-β-hCG, y repetir el proceso de secado.
    NOTA: Las unidades de concentración de nanopartículas de oro coloidal a menudo se expresan como densidad óptica (DO) medida por absorbance a λ = 540 nm. No se requiere tratamiento para la base de mecha antes del montaje del dispositivo en la Sección 10.

8. Tratamiento de canal lateral con Reactivo para inmunoensayos antes del montaje del dispositivo

  1. Cinta de capa de canal lateral en un marco acrílico tal que la zona hidrófila de ser tratado se suspende y no en contacto con el marco.
  2. Añadir 10 l de agente de bloqueo (5 mg leche no grasa / ml y 0,1% (v / v) de Tween 20 en 1x PBS) para tratar el canal lateral. Repetir el mismo proceso de secado (2 min a temperatura ambiente y después a 65 ° C durante 5 min) como la capa de conjugado.

9. El tratamiento de la capa de captura con reactivos para inmunoensayos antes del montaje del dispositivo

  1. Tape capa de captura sobre un marco de acrílico de tal manera que la zona hidrófila de ser tratado se suspende y no en contacto con el marco.
  2. El tratamiento de la capa de captura con 5 l de 1 mg / ml de anticuerpo anti-α-hCG y luego permitir que ella muestra se seque a temperatura ambiente durante 2 min seguido de 8 minutos a 65 ° C.
  3. Añadir 2 l de agente de bloqueo (5 mg / ml de leche no grasa y 0,1% (v / v) de Tween 20 en 1x PBS). Repetir el proceso de secado de la capa de captura.
    NOTA: Esta cantidad es adecuado para recubrir los papeles sin ocluir los poros de la membrana de nylon, que puede ocurrir cuando se utiliza demasiado agente de mucho de bloqueo.

Dispositivos de microfluidos basados ​​en papel 10. Montaje de tres dimensiones

  1. Tape la capa de lavado para la caja de luz (lado impreso hacia arriba). Si se utilizan orificios de alineación, sacarlos de las capas posteriores utilizando una herramienta de taladro de mano.
  2. Retire la película protectora en la parte posterior de la capa de captura para exponer el adhesivo. Alinear la capa de captura por encima de la capa de lavado utilizando los orificios de alineación como una guía. Presione las dos capas juntas. Evitar tocar zonas hidrófilas para minimizar la contaminación o daños en el dispositivo. Pinzas se pueden usar para ayudar a assembLy.
  3. Retire la película protectora en la parte posterior de la capa de incubación para exponer el adhesivo. Alinear la capa de incubación por encima de la capa de captura y presionarlos juntos. Continuar la adición de capas de esta manera hasta que todas las capas activas son ensambladas.
  4. Coloque el dispositivo parcialmente montado en un deslizamiento de protección y fijar firmemente las capas entre sí usando un laminador.
  5. Retire la película protectora en la parte posterior de la capa de lavado y colocar la capa de transferencia a la parte inferior del dispositivo. Repita el paso de laminación 10.4 para completar el montaje del dispositivo de microfluidos en papel tridimensional. Corte deseado número de dispositivos a partir de hojas o placas de dispositivos montados completamente con unas tijeras.
    NOTA: Hojas completas de dispositivos, tiras de dispositivos o dispositivos individuales se pueden preparar usando un enfoque similar.

11. Realización de un inmunoensayo basado en Papel

  1. Añadir 20 l de una muestra a la zona hidrófila en la parte superior del dispositivo (es decir, tse muestra de capa).
  2. Espere a que la muestra para absorber por completo en el dispositivo, a continuación, añadir 15 l de tampón de lavado (0,05% v / v de Tween 20 en 1x tampón fosfato salino). Después de la primera alícuota de tampón de lavado ha Wicked por completo en el dispositivo, añadir una segunda alícuota de 15 l de tampón de lavado.
    NOTA: El tampón de lavado tiene completamente malvados en el dispositivo cuando la gotita de líquido ha desaparecido, sin mostrar menisco en la superficie del papel. El ensayo se completa cuando el segundo alícuota de tampón de lavado ha entrado completamente el dispositivo.
  3. Para revelar los resultados del ensayo, pelar las tres capas superiores del dispositivo con unas pinzas para exponer la capa de captura.
    1. Interpretar los resultados del ensayo cualitativamente mediante la observación de la presencia o ausencia de color. Por otra parte, la imagen de la capa de lectura utilizando un escáner de escritorio y el uso de software de procesamiento de imágenes o algoritmos para cuantificar y caracterizar los resultados de las distribuciones de intensidad dentro de unazona de detección. 20

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Representative Results

La obtención de la funcionalidad del test reproducibles en dispositivos de microfluidos en papel tridimensionales se basa en un método de fabricación que garantiza la consistencia entre los dispositivos. Para lograr este objetivo, hemos identificado una serie de procesos de fabricación y las consideraciones materiales, y discutirlas aquí en el contexto de la demostración de un inmunoensayo basado en papel. Utilizamos un método de impresión de la cera para formar barreras hidrófobas dentro de los dispositivos de microfluidos en papel (Figura 2A). 2 Este método es ideal, ya que se basa sólo en los equipos de oficina ampliamente disponible, requiere pasos de procedimiento mínimas para completar, y no requiere el uso de productos químicos (por ejemplo, las fotorreservas) que pudieran interferir con la adsorción de proteínas o alterar la humectabilidad de las fibras de papel. Además, la impresión de la cera produce vías de fluido con dimensiones reproducibles, lo cual es crítico para los ensayos con actuaciones repetibles y Ti duraciónMES. Después se forman las barreras hidrofóbicas, hojas adhesivas se aplican a las capas para facilitar el montaje de los dispositivos tridimensionales (Figura 2B). Cualquier reactivos necesarios para el inmunoensayo se pueden aplicar después de que se añadió la película adhesiva a la parte posterior de una capa (Figura 2C). Este procedimiento es útil para procesos de fabricación en un laboratorio académico porque muchos dispositivos se pueden preparar en paralelo. El proceso de montaje para un dispositivo de inmunoensayo se completa después de todas las capas del dispositivo se apilan y laminan juntas (Figura 2D). Añadimos muestra para comenzar el ensayo. En este ejemplo, se utiliza un control de la orina colocado para las pruebas de embarazo, que contiene muestras negativas y positivas de hCG en tampón, como muestras para demostrar el funcionamiento de nuestros dispositivos y la reproducibilidad de los ensayos realizaron con ellos. Dos alícuotas de buffer de lavado A continuación se añaden secuencialmente. Una vez que la parte alícuota final del tampón de lavado ha entrado completamente el dispositivo, elensayo se considera completa. Las tres capas superiores son entonces pelados para revelar la capa de captura (Figura 3A). Este paso irreversible daña el dispositivo que asegura que no puede ser utilizado de nuevo. La realización de un basados ​​en papel los resultados de inmunoensayo en una lectura cualitativa de color que pueden indicar una salida negativa o positiva después de una inspección visual. La objetividad de estos resultados es evidente en las imágenes no corregidas adquiridos usando un escáner de superficie plana (Figura 3B).

experimentos fallidos pueden a menudo señalar ciertos pasos de procedimiento, cuya importancia puede ser de otra manera imperceptible cuando el análisis de un experimento se centra en resultados exitosos. Demostramos tres errores en la fabricación y montaje de los dispositivos tridimensionales basados ​​en papel de microfluidos que resultan en fracasos del inmunoensayo: (i) De vez en cuando, fallos de dispositivos no son evidentes hasta después de que se complete un ensayo. Por ejemplo, un misalignment entre capas que comprenden la zona de canal de la incubación y de captura puede causar el desarrollo de un patrón irregular en la señal positiva, lo que puede dar lugar a la interpretación errónea de la señal cualitativa por un usuario (Figura 4A). (Ii) Si la cera no se imprime en una cantidad suficiente o no se deja fundir completamente a través de todo el espesor del papel, entonces la integridad de las barreras hidrofóbicas resultantes puede verse comprometida. formación incompleta de estas barreras provocará una pérdida de control sobre la mecha y dar lugar a fugas dentro del dispositivo. Por ejemplo, en lugar de confinar el flujo a un canal dentro de una capa, una barrera de cera semi-permeable permitirá que el fluido a absorber la otra parte en el plano del papel. Sin canales definidos, la muestra es poco probable que alcance las capas de captura o de lavado. El usuario percibirá este tipo de error como un ensayo de tiempo de duración mucho más corta. Demostramos este fallo en el dispositivo mediante la aplicación de una solución de colorante rojo en A Layer cuyo patrón de cera no se deja fundir durante los 30 segundos (Figura 4B). Un inmunoensayo usando una capa de este tipo fue "terminado" en 6 min, lo que es claramente diferente de la duración prevista de 15 min. (Iii) Los ensayos que requieren más tiempo de lo esperado para completar puede indicar un mal funcionamiento en la fabricación de un dispositivo. Por ejemplo, mal cortado poros ocluidos adhesivo o debido a la aplicación de una cantidad excesiva de los reactivos (por ejemplo, agentes de bloqueo o de oro coloidal) podría prohibir a un tampón de muestra o de lavado que entra en el dispositivo (Figura 4C).

En general, nuestro protocolo de fabricación es útil para la fabricación de numerosos dispositivos de microfluidos en papel en paralelo a una escala que es útil para un laboratorio académico. Se demuestra el rendimiento del inmunoensayo basado en papel hCG preparó usando este método mediante la realización de 70 ensayos en paralelo: 35 réplicas negativas y 35 r positivoeplicates. A los efectos de esta demostración, hemos preparado una serie de capas con los diseños de nuestro dispositivo, provistos de las capas de papel con adhesivo, y luego cortar las hojas en filas de dispositivos. Cada hoja se cortó en 7 filas, que contenían diez dispositivos. Esto facilitó la disposición de las capas sobre los marcos de acrílico más pequeñas, donde las capas se graban y luego se trata con reactivos necesarios para realizar los ensayos. Este método de preparación dispositivo se sugiere en una nota en el protocolo. Después del tratamiento de capas, los dispositivos se ensamblaron en tiras de diez y luego laminadas. Después de la finalización de las etapas finales de fabricación del dispositivo, los dispositivos se mantuvieron en las tiras de diez y se añadió la muestra a cada dispositivo. Se ha observado una tasa de fracaso del 0% para los dispositivos fabricados utilizando nuestro protocolo. Se utilizó un software de procesamiento de imágenes de código abierto 20 para cuantificar los resultados de estos ensayos. Mientras que un número de métodos disponibles para analizar los distribut intensidadion en puntos circulares (por ejemplo, radial o distribuciones lineales) 21 que mide la intensidad media de la canal verde de una imagen RGB del dispositivo a través de todo el punto de detección como una región de interés. 17, 18, 19 A continuación se normalizan las mediciones de ensayos positivos y negativos restando los datos negativos primas (Figura 3B). Se determinó el coeficiente de variación para cada conjunto de datos a ser 1% para los ensayos realizaron con muestras negativas y 3% para los ensayos realizaron con muestras positivas.

Figura 1
Figura 1: Esquema del dispositivo basado en papel tridimensional. Esta ilustración muestra las regiones hidrófobas e hidrófilas que definen la vía de fluido dentro del dispositivo, así como la Pattpendientes regidas capas de adhesivo permanente y medios que mantienen capas juntas. Cada capa está marcada por la función que realiza en el ensayo. El contorno de color rojo, azul o verde en cada capa indica que el material utilizado para fabricar esa capa específica (rojo: papel de cromatografía, azul: membrana de nylon, verde: papel de cromatografía de espesor). Las dimensiones se indican para cada zona dentro del dispositivo en mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Procedimiento utilizado para fabricar los inmunoensayos de dispositivos microfluídicos basados en papel tridimensionales. Imágenes (A) de la parte delantera y trasera de una hoja de papel de cromatografía modelado mediante la impresión de la cera antes y después del calentamiento. (B) Una hoja de papel de cromatografíarespaldado con una película de adhesivo con diseño. (C) Los tratamientos aplicados en las zonas hidrófilas de una tira de membrana de nylon con diseño. (D) El conjunto de tiras de un dispositivo multicapa utilizando una caja de luz y orificios de alineación como guía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Interpretación de resultados de un inmunoensayo basado en papel. (A) Las tres capas superiores del dispositivo basado en papel se pelan hacia atrás para exponer la capa de captura e interpretar los resultados del ensayo. (B) Representación gráfica de los resultados de un inmunoensayo basado en papel para hCG. Los resultados representados son los promedios de 70 repeticiones realizan simultáneamente en 35 repeticiones cada uno se utilizan for muestras positivas y negativas de hCG. Las barras de error representan la desviación estándar del conjunto de datos. No corregidos, que representan imágenes representativas (color rojo) positivo y los resultados negativos (de color blanco) a partir de un inmunoensayo de hCG se muestran por encima de sus respectivos datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Ejemplos de los errores de fabricación. (A) Debido a la desalineación del canal lateral por encima de la capa de captura, la señal positiva se concentra en una pequeña área de la zona de lectura. Una región circular "húmedo" (línea discontinua) se puede observar a la derecha de la zona de lectura resultante del contacto entre el canal lateral desalineada con la capa de captura (izquierda). Imagen de una lectura positiva enla capa de captura de un dispositivo correctamente alineado (a la derecha). (B) de fusión incompleta de la cera en todo el espesor de una capa puede dar lugar a fugas dentro del dispositivo. Colorante de alimentos ha sido añadido a la solución para ayudar en la visualización de la muestra en capas con barreras hidrofóbicas incompletos o completamente formados. (C) de adhesivo incorrectamente cortar puede bloquear la red de fluido entre las capas de papel, que se detiene el flujo de una muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: La fabricación de los dispositivos de microfluidos en papel tridimensionales. El esquema representa el montaje y laminación de múltiples capas de papel con dibujos en los dispositivos tridimensionales completas. En este ejemplo, 70 dispositivos cun hacerse simultáneamente. Las capas de orificios adhesivas y de alineación se han eliminado de la esquemática a efectos de simplificación. Después del montaje, los dispositivos individuales se pueden quitar y utilizar en ensayos. Los contornos rojos, azules, y verdes en cada capa indican que el material utilizado para fabricar esa capa específica (rojo: papel de cromatografía, azul: membrana de nylon, verde: papel de cromatografía de espesor). La Escala de barra = 25 mm, excepto para el dispositivo separado (derecha), que tiene unas dimensiones de 12 x 28 mm 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La identificación de una estrategia de fabricación reproducible es un componente esencial del desarrollo del ensayo. 22 se utiliza un enfoque secuencial capa por capa para la fabricación de dispositivos microfluídicos basados en papel tridimensionales. En contraste con los métodos que se aplican técnicas de plegado o de papel a producir dispositivos de múltiples capas a partir de una sola hoja de papel 23, 24 de fabricación aditivo ofrece una serie de ventajas: (i) materiales múltiples se pueden incorporar en una única arquitectura de dispositivo sin modificaciones a los métodos para la impresión, la alineación, o conjunto de capas. (Ii) películas adhesivas con dibujos se pueden integrar en el proceso de montaje. Estas películas estampan capas contiguas, y, en base a la resistencia del adhesivo, puede ser reversible para permitir la peladura y la evaluación de las capas internas. Por otra parte, los adhesivos proporcionan integridad estructural al dispositivo en tres dimensiones, lo que excluye la necesidadde ligante 25 clips o recintos mecanizadas. 23 (iii) las hojas individuales de papel de cromatografía carta de los EEUU puede acomodar una serie de repeticiones, lo que puede mejorar en gran medida el rendimiento de la fabricación a escala de laboratorio (Figura 5). Esto es particularmente beneficioso en la evaluación de numerosas condiciones experimentales que requieren repeticiones técnica. Por este método, 70 dispositivos basados ​​en papel tridimensionales se pueden preparar de forma simultánea. (iv) enfoques de múltiples capas similares de laminación se utilizan para la fabricación de alto volumen de numerosos productos comerciales en la asistencia sanitaria (por ejemplo, apósitos para el cuidado y parches transdérmicos), que por lo tanto reduce la barrera de producción para la traducción de estos dispositivos de microfluidos en papel tridimensionales.

Además de facilitar el pelado y el montaje, la elección del adhesivo es también crítica para el diseño de la red fluídica tridimensional. Un anunciopelícula adhesiva puede servir como una barrera adicional entre las capas de papel, que puede permitir el enmascaramiento de zonas hidrófilas en las capas adyacentes. En la práctica, el uso de capas delgadas de adhesivo es deseable. Si el adhesivo es demasiado grueso (por ejemplo, muchas cintas de doble cara), entonces la brecha formada entre capas de papel será demasiado grande como para facilitar la mecha y debe ser llenado con una sustancia hidrófila (por ejemplo, polvo de celulosa) para recuperar la función. 12 Mientras que esta etapa adicional añade complejidad a la fabricación y la sustancia utilizada puede interferir con algunos ensayos, estos vacíos se convierten en una característica útil para la producción de válvulas push-down controlables, fluídicos. 15 Otras formas de adhesivo se han utilizado en la fabricación de dispositivos microfluídicos basados en papel tridimensionales. aerosoles adhesivos ofrecen un método simple para fijar las capas entre sí. 26 Usando este método, se aplica el material adhesivo uniformemente sobre ambos tél área hidrofóbica e hidrofílica del papel. Una ventaja de este método es que no se necesita equipo adicional (por ejemplo, trazador cuchillo o un cortador de láser) para diseñar el modelo para la capa adhesiva. Sin embargo, las condiciones para la aplicación uniforme de la pulverización de adhesivo debe ser determinado experimentalmente para cada tipo de material utilizado. La topografía del material puede afectar a la interfaz adhesivo de material y puede ser necesario tiempos de aspersión más largos para superficies más ásperas. Además, la pulverización de adhesivo sobre las zonas hidrófilas de la vía de fluido puede dar lugar a deterioro de efecto de mecha mediante la alteración de la humectabilidad del papel. Alternativamente, el uso de plantillas 27 o impresión de la pantalla 8 se puede usar para adhesivo patrón directamente sobre capas de papel con diseño.

Dos consideraciones principales para el desarrollo de dispositivos de microfluidos en papel tridimensionales son la elección de materiales y el diseño de la fluiDIC red. (I) Seleccionamos materiales y combinaciones de materiales basados ​​en velocidad de trenzado, resistencia a la humedad, el grosor, y la capacidad de unión a proteínas. velocidad de trenzado puede influir en la duración de un ensayo y la cantidad de los reactivos de tiempo tienen que reaccionar o se unen dentro de una capa. Diferentes grados de papel se caracterizan por efecto de mecha tarifas basadas en, por ejemplo, el tratamiento del papel, su porosidad, y su espesor. Es posible utilizar varias capas de papel para aumentar la proporción de absorción eficaz de un dispositivo. 28 Una buena resistencia a la humedad es deseable para aplicaciones que requieren una manipulación (por ejemplo, descamación un inmunoensayo) después de que el dispositivo ha sido saturado con una muestra. Los materiales que son demasiado gruesas o que no se pueden pasar a través de la impresora comercial debido a la fragilidad requerirá un método alternativo para producir canales de molde (por ejemplo, fotolitografía). Sin embargo, en contraste, los materiales más gruesos son ideales para las capas de transferencia (o sumideros) para extraer fluidos a través de THdispositivo e. Muchos grados de membranas de nylon están disponibles comercialmente, que pueden diferir en su capacidad para unir proteínas de forma irreversible a la zona de captura. Las sustituciones de material (por ejemplo, nitrocelulosa en lugar de una membrana de nylon) pueden también influyen en la capacidad, que puede afectar a la sensibilidad del ensayo de unión. (ii) El uso de la simetría en el diseño de redes de fluidos se asegura de que los canales únicos estampadas en los dispositivos tridimensionales comportan de forma idéntica (por ejemplo, llenado al mismo tiempo), que es crítica para los ensayos multiplexados. 19 La simetría simplifica aún más la capa de diseño, ayuda con la capa de alineación durante el montaje de hojas completas de dispositivos, y puede minimizar el desperdicio. Las modificaciones del diseño del dispositivo pueden influir en el rendimiento del ensayo. Por ejemplo, el aumento de la longitud del canal lateral en la capa de incubación afecta a la duración del ensayo, debido a que el líquido se absorbe y expulsa una distancia proporcionalmente más larga antes de llegar a la unidad organizativatlet. 17 En las aplicaciones que se basan en la unión de una biomolécula diana, un tiempo de ensayo más largo puede ser ventajoso porque puede aumentar la fracción de especies unidas, etiquetados antes de la inmovilización en la capa de captura.

En conclusión, hemos presentado un método para fabricar dispositivos de microfluidos en papel tridimensionales que apoyan el desarrollo de inmunoensayos. Este método, que utiliza un tipo de fabricación de aditivos para producir dispositivos de múltiples capas, facilita la producción de dispositivos a una escala que es adecuado para la investigación de laboratorio. El protocolo descrito en este manuscrito es específico para los dispositivos de inmunoensayo basados ​​en papel; Sin embargo, esperamos que los procedimientos relacionados con el montaje de estos inmunoensayos la impresión de la cera, modelando adhesivo, la alineación de capas, y laminación será fácilmente ampliable a numerosas arquitecturas de dispositivos de microfluidos en papel tridimensionales. La comprensión de la metodología de fabricación puede conducirpara el desarrollo de nuevos ensayos de punto de atención con una amplia gama de aplicaciones en la salud, el medio ambiente y la agricultura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illustrator CC Adobe to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer Amazon B00R92C9DI to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven Fisher Scientific 15-103-0509 to melt wax into paper
Artograph LightTracer Amazon B000KNHRH6 to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator Amazon B00AXHSZU2 to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter Graphtec America CE6000-40 to pattern adhesive films
Swingline paper cutter Amazon B0006VNY4C to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner Amazon B000VG4AY0 to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch McMaster-Carr 3488A9 to remove alignment holes 
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4 Sigma Aldrich WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)  Fisher Scientific 05-714-4 to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size ) Pall Corporation NBCHI3R to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF021621 to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner FLEXcon DF051521
wax liner FLEXcon FLEXMARK 80 D/F PFW LINER to assist with patterning adhesive
acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266  to fabricate frame
self-adhesive sheets Fellowes CRC52215 to use as protective slip
absolute ethanol VWR 89125-172 to sanitize work area
bovine serum albumin AMRESCO 0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls Fisher Scientific 22-071-066 to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1) Arista Biologicals  CGBCG-0701 to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody Arista Biologicals  ABACG-0500 to treat capture layer
10X phosphate buffered saline Fisher Scientific BP3991
Oxoid skim milk powder Thermo Scientific OXLP0031B
Tween 20 AMRESCO M147

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References

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