利用合成生物学工程师活细胞接口,具有可编程材料

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Bioengineering

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Summary

本文提出了一系列的开发改造的细胞和,使综合工程大肠杆菌控制和操纵可编程材料的表面功能化表面的协议。

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Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. H., Zhang, R., Ruder, W. C. Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials. J. Vis. Exp. (121), e55300, doi:10.3791/55300 (2017).

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Abstract

我们已开发出一种非生物-生物界面,允许工程细胞以控制官能化表面的材料性质。 大肠杆菌细胞的合成工程化菌株和官能化材料的界面:该系统是通过创建两个模块制成。在本文中,我们详细介绍了基因工程利用分子克隆策略大肠杆菌菌株内选择行为的协议。一旦开发,当暴露于化学诱导该菌株产生的生物素的水平升高。此外,我们创建两个不同的官能化的表面,其中每一个能够以细胞合成的生物素响应详细协议。综上所述,我们提出了一个方法来创建一个允许工程细胞,以控制非生物基材料成分和组装链接,非生物,生物系统。

Introduction

这里,我们报告开发能够从工程改造的细胞系响应于化学信号的可编程衬底的步骤。 1,我们通过创建生物素-链霉接口,响应生物素由合成工程化的大肠杆菌(大肠杆菌)细胞中产生的做到这一点。此前,可编程的表面经过特别设计,从毒素检测2点护理诊断3到国防和安全的广泛应用。 4虽然可编程表面可以是传感器和致动器是有用的,它们可以通过与以适应不同的环境挑战的能力赋予他们进行“更聪明”。相比之下,即使是简单的微生物,如大肠杆菌 ,具有内在的适应性,并能够应对成熟而往往出人意料解决方案的挑战。这种适应性使E.大肠杆菌群,通过其复杂的基因网络控制,经济有效地寻求资源,创建5产品附加值,6,甚至电源微观尺度的机器人。 7通过结合活细胞与使用可编程表面中的自适应优点,我们可以创建能够响应不同环境条件的一个聪明衬底。

合成生物学给了研究人员的新能力,生物体的行为进行编程。通过工程细胞包含新的基因调控网络,研究人员可以设计出多种编程行为细胞。 8,9之外的基础研究中,可使用的应用,如控制材料组件和生物学生产增值产品这些行为。 10在此,我们我们详细介绍如何利用合成生物学的工具来恩gineer 大肠杆菌菌株在诱导合成生物素。该菌株是通过使用限制性内切酶克隆的方法来组装一个质粒,pKE1-的lacI-bioB开发的。该质粒中,当转化到大肠杆菌 K-12菌株MG1655,赋予细胞以表达bioB,生物素合成的必需酶水平升高的能力。当转化的细胞用异丙β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并设置有生物素的前体,脱硫生物素(DTB),制作了生物素的水平升高。

生物素与链霉结合相互作用是在自然界中发现的最强的非共价键中的一个。这样,生物素 - 链霉相互作用既充分表征和生物技术高度使用。 11在这个手稿中,我们提出采用生物素-链霉亲和的互动感知和检测细胞生产生物素具有功能化表面两种策略。我们参照这些对立表面,“间接”和“直接”控制方案。在间接控制方案中,细胞产生的生物素与已经缀合和固定在聚苯乙烯表面为链霉结合位点的生物素竞争。此外,链霉抗缀合有辣根过氧化物酶(HRP)。 HRP修饰3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB),以产生光信号,12可以由在450nm(OD 450)定量分光吸收( 光密度)进行监测。因此,间接控制方案允许研究人员通过监测OD 450信号的attentuation测定细胞生产生物素。

直接控制方案利用直接固定到链霉亲和材料表面并允许细胞产生的生物素和生物素化HRP链霉结合位点的竞争链霉亲和素事件。再次,在细胞产生的生物素的相对水平是通过测量的OD 450信号监测。

两者合计,改造的细胞和官能化表面允许我们通过在活细胞中诱导的网络控制可编程表面的属性。换言之,我们已经创建了一个系统,该系统通过这些系统连接起来需要生物体的适应性和可靠性和说明书中的工程材料界面的优点。

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Protocol

1.媒体和文化准备

  1. 通过混合25g的LB粉末库存用1L去离子(DI)水和高压灭菌在121℃的溶液中20分钟以消毒准备LB培养基(LB)的介质。
    1. 为了制备LB平板,琼脂15克(1.5%)灭菌前添加到LB培养基
    2. 制备在去离子水中1000倍羧苄青霉素(CB)(50毫克/毫升)的储备溶液。
    3. 如果制备,其包括用于抗性转化体的选择的抗生素的LB培养基,等到无菌LB介质的温度低于60℃,然后添加抗生素库存的1微升1毫升的LB每个介质。
  2. 对于M9基本培养基(表1),准备以下的单独的储备溶液:5X M9盐(56.4克/升),1M 硫酸镁 ,1M的CaCl 2,20%的葡萄糖和2%无生物素酪蛋白氨基酸。
    1. 在高压釜中安全瓶子,结合20 5倍的M9毫升盐,200#181; 1M 硫酸镁 ,DI水为1M的CaCl 2,2毫升20%的葡萄糖,1毫升2%的无生物素酪蛋白氨基酸,和76.8毫升10微升升。
    2. 高压釜在步骤1.2.1在121℃20分钟制备的溶液。
  3. 孵育所有文化中,在37℃,以400rpm搅拌。孵化时间取决于实验和应变,但通常持续8至12小时。

2.代生物素产大肠杆菌 (质粒pKE1-的lacI-bioB)

注:基因电路包含两个部分:一个lacI抑制子 ,通过一个P L推动,TETO-1启动子导致组成型表达由于不存在一个四面体阻遏蛋白,以及含有在P trc启动-2生物素的表达系统子,其后驱动bioB的表达的强的核糖体结合位点(RBS)。所有克隆是在商业,快速分裂大肠杆菌 STRA执行了,这一最终的构建物转化到大肠杆菌 MG1655WT进行测试。引物( 表2)商购。

  1. 隔离来自大肠杆菌基因组的bioB基因通过进行全细胞聚合酶链反应(PCR):
    1. 成长的大肠杆菌 MG 1655WT细胞过夜37℃。
    2. 在0.2毫升的PCR管中,结合在步骤2.1.1用无菌DI水9微升制备的过夜培养物1微升。
    3. 孵育管中在95℃在一个热循环5分钟,并立即将管转移到-80℃冷冻10分钟,以裂解细胞。这使基因组DNA以用作PCR的模板。
    4. 解冻溶液并加入(ⅰ)各引物nBioB2-f1和nBioB2-R的2.5微升,(ⅱ)5 5×聚合酶缓冲液100μL,(ⅲ)0.25微升DNA聚合酶,(ⅳ)0.5微升dNTP混合物的,以及(v)6.75微升的去离子水的25微升的总反应体积( 表4)。
    5. 罢工( 甩尾)管的端混合的内容。接着,立即快速降速管(〜2秒),以确保样品在管的底部。
    6. 放置管在PCR热循环,并使用表3中的3分钟的额外步骤在95℃下在协议的开始所描述的程序。
    7. 确认成功PCR,使用凝胶电泳 - 在Tris碱,乙酸和EDTA缓冲液(TAE)(1.0在去离子水+溴化乙锭的1.2%琼脂糖)。 PCR产物应该是1070个碱基对(BP)长。
    8. 使用根据制造商的说明书的商业试剂盒从凝胶从步骤2.1.7提取DNA片段。
  2. 隔离在P TRC-2启动子和来自质粒pKDL071 13(詹姆斯·柯林斯在麻省理工学院实验室提供)的操纵子的lacI:
    1. 含增长大肠杆菌细胞在pKDL071质粒过夜LB +的Cb在37℃。
    2. 提取使用根据制造商的说明在商业小量制备试剂盒的细胞中的质粒DNA。该质粒将作为PCR模板。
    3. 遵循步骤2.1.4 PCR方法。至2.1.8。并作以下修改:
    4. 在步骤2.2.2质粒提取替换裂解的细胞。
    5. 使用的引物1-f和1-R为盒式的lacI提取2.5微升。或者,使用的引物nBioB1-F和nBioB1-R对于p TRC-2提取2.5微升。
    6. 执行凝胶电泳(步骤2.1.7)确认PCR产物的的lacI盒和P trc启动-2启动子位点。它们应分别为1213 bp和109 bp的。
  3. 通过重叠延伸(SOE)PCR使用剪接构建含bioB匣P trc启动-2中,引物nBioB2-f2的合成的核糖体结合位点(RBS)和bioB 表3中。
  4. 插入结构(P L,TETO-1 + 的lacI和P TRC-2 + bioB)到pKE1-MCS质粒载体13骨干消化载体和限制性内切酶插入(詹姆斯·柯林斯在麻省理工学院的实验室提供):
    1. 提取使用限制性酶和凝胶电泳基因。每个反应含有(ⅰ)5微升10×反应缓冲液,(ⅱ)限制酶1的1微升,(ⅲ)1微升限制性内切酶2的,(ⅳ)的DNA中的至少1微克,以及(v)去离子水以使终体积到50微升( 表5)。用酶的AatII和EcoRI为的lacI卡带和用酶HindIII和SacⅡ位为bioB卡带消化。
    2. 反应被组装后,很快在37℃孵育前涡旋它们并短暂离心(〜2个),1小时。
    3. 中消化,根据标准方法进行电泳制备凝胶。
    4. 结合了凝胶电泳6X样缓冲消化DNA。
    5. 使用2日志梯验证所需构建体的位置,从凝胶上切的DNA片段,并使用根据制造商的说明商业凝胶提取试剂盒,从凝胶中提取DNA片段。
  5. 使用光谱量化DNA和计算量为0:1,1:1和3:插入物1的摩尔比使用等式1到载体:
    式(1) 式(1)
    另外,在式1中,M是插入到载体中的比率(0,1,或3)中,X i是插入DNA的量,沸点i是在碱基对插入物的长度,碱基v是矢量的长度在碱基对,且X v是向量(50毫微克)的量。
  6. 通过组合混合连接反应(ⅰ)1微升10X连接酶缓冲液,(ⅱ)1微升的T4连接酶,(ⅲ)50纳克载体DNA,(四)具体到每个反应插入DNA,以及(v)去离子水的质量,以10μL的总反应体积( 表6)。
  7. 孵育在室温下(RT)1小时。
  8. 在步骤2.7结扎孵化,准备化学感受态细胞。
    1. 分装1毫升过夜培养到1.5毫升离心管中。
    2. 离心在16,200 xg离心1分钟。
    3. 倒出上清,悬浮颗粒在冷冻200微升(冰)100毫米氯化钙2。轻轻吹打悬浮颗粒。 不要旋涡。
    4. 放置在冰上的微量离心管10分钟。
    5. 离心机,除去上清液,重悬在100微升冷却的100mM CaCl 2沉淀,并再次放置在冰上的管中。
    6. 离心管中的最后的时间和悬浮颗粒在50微升的冷却的100mM的CaCl 2。
    7. 地点冰管,并立即使用化学感受态细胞。
  9. 加入5μL连接的DNA,在步骤2.6和2.7编写,以感受态细胞,在步骤2.8编写的每管。
  10. 由撞击侧(即轻弹)将管短暂地搅动该管,然后将管在冰上30分钟。
  11. 热在42℃震荡管45秒,将管返回到冰上2分钟。
  12. 吸管细胞上选择性LB琼脂+抗生素板和扩散用玻璃镀珠的细胞。
  13. 过夜孵育所述板在37℃。
  14. 第二天早晨,拾取从镶嵌正极板菌落( ,1:1和3:1的平板)。挑选3个菌落如果0:1负控板显示没有增长,或选择5-8菌落如果0:1板有一定的增长。使用拾取菌落来接种5ml的LB +抗生素,并在37℃下搅拌生长8小时。
  15. 提取从细胞中使用minipr质粒DNAEP试剂盒,按照制造商的说明进行操作。执行使用限制酶的测试切口(以下在步骤2.4.1详述的相同程序)。
  16. 通过比较从正确构建体预期的结果的消化的DNA片段的长度识别与成功的构建体的细胞。携带成功质粒构建培养物可通过等份培养混合用无菌过滤,40%甘油的溶液(在DI水中),并冷冻在-80℃下将混合物保留下来。
    注:质粒变换成其他大肠杆菌菌株( ,MG1655WT)可以通过下列用于制备化学感受态细胞的上述步骤来完成。

3.细胞特性:生长曲线和剂量反应

  1. 生长工程菌在LB培养基中过夜与适当的抗生素。
  2. 对生长曲线,制备50mL的最小M9培养基的使用和不使用IPTG(从0.5米每秒滴答)和/或DTB(从500微克/毫升的库存)如下:
    1. 准备0毫微克/毫升DTB(0微升股票)/ 0毫米IPTG(0微升的股票)。
    2. 准备200毫微克/毫升DTB(股票200微升)/ 0毫米IPTG(0微升的股票)。
    3. 准备0毫微克/毫升DTB(0微升股票)/ 0.5毫米IPTG(股票50μL)。
    4. 准备200毫微克/毫升DTB(股票200微升)/ 0.5毫米IPTG(股票50μL)。
    5. 用过夜培养物接种于1:在上述指定媒体100。
    6. 在一个96孔板,等分试样培养200微升,一式三份,向每个孔中。
    7. 测量的OD 600,每5分钟以上24小时,在板读取器连续摇动并孵育在37℃。
  3. 对于剂量响应研究中,取代在pKE1-的lacI-bioB与mCherry实时光学定量bioB基因(红色荧光蛋白)。
  4. 添加不同的IPTG量为0.1至5mm以诱导表达在LB培养基中。
  5. 100:以1:1的稀释过夜培养物接种。
  6. 测量荧光15小时每隔30分钟。

4.改造的细胞和上清液诱导制备生物素生产

  1. 在LB培养基中生长pKE1-的lacI-bioB在大肠杆菌 MG1655株过夜。
  2. 补充的M9介质DTB范围从30至200毫微克/毫升。
  3. 加入0.5毫米IPTG诱导生物素的合成。
  4. 接种过夜培养补充,无生物素最小M9培养基以1:100稀释。
  5. 生长,离心细胞24小时后,收集生物素富集的上清液。
  6. 测量与控制的间接和直接控制功能化表面富含维生素H上清。使用上清到位步骤5.23和6.12,分别是生物素的样品。

5.间接控制方案官能表面处理

  1. 日准备Ë以下解决方案。
    1. 制备SMCC溶液由20毫克/琥珀酰亚胺反式-4-(maleimidylmethyl)环己烷-1-羧酸酯中的溶液(SMCC)在二甲亚砜(DMSO)。
    2. 制备的SPDP溶液由20毫克/琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基)丙酸酯(SPDP)在DMSO中的溶液。
    3. 在DMSO中制备20毫克/毫升的LC-LC-生物素。
    4. 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备10毫克/毫升辣根过氧化物酶(HRP)。
    5. 制备10毫克/毫升的链霉(SA)的在PBS中。
    6. 制备在PBS中的10毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)。
    7. 制备在去离子水中的100mM二硫苏糖醇(DTT)。
    8. 制备在PBS中的5mM ethylenediaminetetaacetic乙酸(EDTA)。
    9. 准备在PBS 0.5%的酪蛋白。
    10. 在去离子水配制20%吐温80的股票。
    11. 在PBS准备0.05%吐温80(20%股份)。
    12. 准备在去离子水醋酸钠50毫米。
    13. 在DMSO准备1%TMB。
    14. 准备3%H 2 O 2我ñ去离子水。
    15. 在去离子水中制备2 MH 2 SO 4。
  2. 添加SPDP液1.4微升至20微升SA的解决方案。
  3. 从孵育5.2溶液在室温1.5小时,用铝箔包裹,以避免暴露在光线。这个步骤可以使SPDP交联剂通过形成吡啶激活SA的氨基结合到SA。
  4. 从步骤5.3中添加滴滴涕溶液到该溶液中的2.4微升并在室温下孵育1小时。这允许吡啶-2-硫酮裂解,产生巯基活化的SA。
  5. 加入7.5μLSMCC解决方案,以72微升HRP解决方案,并在室温下孵育1.5小时,用铝箔包裹,以避免暴露在光线。这导致由氨基结合的马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶。
  6. 混合用200微升BSA溶液17μLLC-LC生物素溶液,在室温下孵育1.5小时,用铝箔包裹,以避免暴露在光线。此步骤允许生物素结合Ť经酰胺键ØBSA。
  7. 从步骤5.4,5.5传输解决方案和5.6离心浓缩旋管中分离出来。
  8. 对于含有SA-SPDP,从步骤5.4,离心在10000 XG直到管卷管达到100μL或16分钟。填充旋管500微升用PBS-EDTA。
    1. 重复步骤5.8五倍。在4℃保存的股票。
  9. 对于含有HRP-SMCC,来自步骤5.5,离心机以10,000 xg离心直至体积达到25微升或16分钟的管。旋管填充到500微升用PBS。
    1. 重复步骤5.9五倍。在4℃保存的股票。
  10. 对于BSA含有生物素,从步骤5.6,离心机以10,000 xg离心直至体积达到100微升或12分钟的管。旋管填充到500微升用PBS。
    1. 重复步骤5.10四倍。
    2. 离心机在10,000 XG直到体积达到100μL或12分钟。加入100微升的PBS到管。在4℃保存的股票。
  11. 在4℃添加25微升以10毫克/毫升的SA溶液并储存25微升的10毫克/毫升的HRP溶液过夜。这将导致该SA经由硫醚键成为共轭与HRP的。
    1. 准备1:用隔夜的解决方案,并存储在4℃的冰箱4可行的解决方案。在-20℃储存剩余的溶液。
  12. 准备两个解决方案,包括在PBS BSA生物素(或BSA)的,通过添加BSA生物素股票(或10μLBSA股票)10微升至PBS的490微升。
  13. 从步骤5.12中添加100μL的该溶液到96孔聚苯乙烯板的各孔中。
  14. 孵育在37℃的板1小时,包裹在箔。
  15. 用0.05%吐温80洗涤平板的孔中。
    1. 添加0.05%PBS-吐温80的200微升到孔中。在室温下孵育2分钟。倒出液体。
    2. <李>重复步骤5.15.1三次。
  16. 添加0.5%的酪蛋白溶液的200微升的每个中的96孔板的孔中。
  17. 孵育在37℃的板1小时。
  18. 重复步骤5.15洗井的三倍。
  19. 通过混合12mL的0.5%的酪蛋白溶液用0.05%吐温80的7.5微升制备溶液。
  20. 使用步骤5.19制备的溶液10000:稀释SA-HRP股票1。
  21. 添加在步骤5.20制备一个96孔板的每个孔中的溶液的80微升。
  22. 添加20微升制备的生物素的样品到聚苯乙烯板的各孔中。在4.6中制备的上清液可以用作在此步骤中的生物素的样品。
  23. 孵育在37℃的板1小时。此步骤允许自由生物素之间的竞争性结合并固定BSA生物素对SA-HRP结合位点。
  24. 重复步骤5.15洗井的三倍。
  25. 混合50mM乙酸钠溶液,1%TMB溶液,并在1000 3%的H 2 O 2溶液:10:1的比例(总体积20ml)。
  26. 从步骤5.25至每孔加入该溶液的200微升,并允许坐在RT 15分钟,用箔覆盖。
  27. 加的2 MH 2 SO 4 50微升至各孔以终止反应。用酶标仪测量OD 450。

6.直接控制方案官能表面处理

  1. 准备以下解决方案。
    1. 在DMSO中制备20毫克/毫升的LC-LC-生物素。
    2. 制备10毫克/毫升的HRP在PBS中。
    3. 在PBS准备0.17微克/毫升SA。
    4. 准备在PBS 0.5%的酪蛋白。
    5. 在去离子水配制20%吐温80的股票。
    6. 在PBS准备0.05%吐温80(20%股份)。
    7. 准备在去离子水醋酸钠50毫米。
    8. 在DMSO准备1%TMB。
    9. 在去离子水中制备3%的H 2 O 2。
    10. 制备2 MH 2 SO 4
  2. 加入7.5微升LC-LC生物素至72微升HRP,在室温孵育1.5小时,用铝箔包裹,以避免暴露在光线。此步骤通过酰胺键将导致生物素缀合物的HRP。
  3. 旋管内来自步骤6.2的溶液转移到离心浓缩
    1. 以10,000 xg离心离心该溶液,直至体积达到100微升或12分钟。填充旋管500微升用PBS重复离心和PBS另外四次。在4℃保存的股票。
  4. 从6.1.3添加100μL的该SA溶液至每孔的96孔聚苯乙烯板内。
  5. 孵育在37℃的板1小时,包裹在箔。
  6. 用0.05%吐温80洗涤平板的孔中。
    1. 添加0.05%200微升吐温80到孔中。在室温下孵育2分钟。倒出液体。
    2. 重复6.6.1三次。
  7. 添加0.5%的酪蛋白溶液的200微升的每个中的96孔板的孔中。
  8. 孵育在37℃的板1小时。
  9. 重复步骤6.6三次以洗涤井。
  10. 使用步骤6.3准备的解决方案10000:稀释生物素HRP股票1。
  11. 添加在步骤6.10制备一个96孔板的每个孔中的溶液的80微升。
  12. 添加20微升制备的生物素的样品到聚苯乙烯板的各孔中。在4.6中制备的上清液可以用作在此步骤中的生物素的样品。
  13. 孵育在37℃的板1小时。此步骤允许为固定SA结合位点自由生物素和生物素HRP之间的竞争性结合。
  14. 重复步骤6.6以洗涤孔三次。
  15. 混合50mM乙酸钠溶液,1%TMB溶液,和3%的H 2 O 2溶液以1000:10:1的比例(总体积20ml)。
  16. 从步骤6添加溶液的200微升。15至每个孔,并在室温下孵育15分钟,用箔覆盖。
  17. 加的2 MH 2 SO 4溶液50微升至各孔以终止反应。用酶标仪测量OD 450。

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Representative Results

代表性的结果在附图五个数字呈现。首先,我们提出以图形克隆过程( 图1),以便读者能够在视觉遵循用于创建合成工程化的大肠杆菌菌株的关键步骤。为了表征细胞的种群动态,我们提供由在人口为600nm(OD 600)测定的光密度所产生的生长曲线( 图2)。然后,我们显示了调节基因网络是如何验证,通过使用mCherry作为bioB代理( 图3),使我们能够光学地测量,将通过细胞在用IPTG诱导产生bioB的相对量。接下来,我们提出响应数据的间接控制和直接控制功能化的表面。这些数据图( 图4)通过使用游离测定溶液研制生物素表征功能化表面的反应曲线。最后,我们提出的特征数据示出了改造的细胞是如何诱导产生的生物素( 图5),从而改变官能化表面。

图1
图1:设计和诱导,工程细胞的构建。 (A)设计引物对bioB基因从大肠杆菌基因组,其编码在生物素生物合成途径中的关键酶隔离。 (B)中的P L,TETO-1 -lacI和P trc启动-2序列可以从包含与相应的引物的基因拨动开关的质粒中分离。 (C)所提取的bioB基因和来自切换开关的两个片段然后可以用于创建基因电路。 IPTG的加入则可以INDUCE bioB和由此的生物素合成中的表达时,DTB加入作为bioB的基板。 (D)的装配的质粒转化到K-12 MG1655 大肠杆菌 。这引起IPTG存在由工程改造的细胞系诱导bioB和由此的生物素合成中的表达时DTB被作为底物提供。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:生长曲线的工程细胞。改造的,诱导型MG1655野生型细胞生长并在基本培养基中( ,生物素-自由M9培养基),以及基本培养基补充有DTB(200毫微克/毫升)和/或IPTG(0.5毫摩尔)进行监测。该图显示的OD 600读数,测量每5英里 n,用于24小时。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:测试工程基因网络。荧光蛋白mCherry代替的使用 bioB基因这样我们就可以测量光学感应配置文件时,工程细胞与诱导表达。我们用IPTG(蓝钻),不诱导细胞对比与IPTG(红钻)诱导细胞。这些结果表明可诱导的基因网络的功效。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4:官能化材料界面的验证。通过暴露我们的官能化表面以不同的生物素的浓度,我们能够测量通过测量OD 450吸收的光的响应。这些结果使我们能够生成校正曲线,生物素的浓度,链接到响应的光强度。这里,我们提出了生物素与两个间接(左)和直接(右)官能表面方案的光信号的曲线。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5:工程细胞控制材料界面。通过利用协议部5或6中,我们能够使用感应,工程C的制品厄尔化学改性的功能化表面。我们可以通过测量OD 450光学监测这些反应。此外,通过使用图4中的校准曲线,我们可以链接响应于浓度内的生物素的光强度。我们在这里提出了不同的生物素的浓度,由我们的间接控制方案官能表面测定,野生型细胞(白色),含有pKE1-的lacI-bioB质粒(橙色)未诱导的细胞,以及含有该pKE1-的lacI-bioB诱导细胞质粒(灰色)。 请点击此处查看该图的放大版本。

化学 终浓度
5X M9盐 1X 20毫升
1M的硫酸镁 2毫米 200μL
1M的氯化钙 0.1毫米 10μL
20%的葡萄糖 0.40% 2毫升
2%无生物素酪蛋白氨基酸 0.02% 1毫升
去离子水 N / A 76.8毫升

表1:M9媒体配方。

名称 引物序列 用法
1-F CCGCCGGAATTCTCCCTATCAGTGATAGAGATT 卡带的lacI提取
1-R CCGACGTCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC 卡带的lacI提取
nBioB1-F CCCAAGCTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCAT P TRC-2提取
nBioB1-R GGGGGGTTCTTTTAATAAAGGTACCGTGTGAAATTGTT P TRC-2提取
nBioB2-F1 ACCCCCCTAAGGAGGTCATCATGGCTCACCGCCCACG bioB提取
nBioB2-R TCCCCGCGGTCATAATGCTGCCGCGTTGTAATATTC bioB提取
nBioB2-F2 ACGGTACCTTTATTAAAAGAACCCCCCTAAGGAGGTCATC 合成RBS此外

表2:引物清单。

第1步
第2步 第3步 步骤4 第5步 第6步 第7步 第8步 第9步
98℃ 98℃ 70℃ 72℃ 98℃ 60℃ 72℃ 72℃ 4℃
0:30 0:10 0:30 01:00 / KB 0:10 0:30 01:00 / KB 2:00
重复12次重复25次
-1°C /周期

表3:PCR程序。

名称
细胞裂解物(模板) 10μL
底漆(每个) 0.625μL(每个)
5X Q5缓冲 5μL
Q5聚合酶 0.25微升
dNTP混合物 0.5μL
去离子水 6.75微升

表4:全细胞PCR反应(25μL)。

名称
10点¯x反应缓冲液 5μL
酶1 1μL
酶2 1μL
模板DNA 1微克
去离子水 43μL - DNA的量

表5:酶切反应(50微升)。

名称
脱氧核糖核酸 50微克载体+ X微克插入
10X连接酶缓冲 1μL
T4连接酶 1μL
去离子水 8μL - DNA的量

表6:连接反应(10微升)。

名称 浓度 笔记
氯化钙 100毫米
Carbeniccilin 50毫克/毫升(1000倍)
DTB 50微克/毫升
IPTG 0.5M的
SMCC 20毫克/毫升 2毫克到将100ul DMSO
SPDP 20毫克/毫升 2毫克到将100ul DMSO
LC-LC-生物素 20毫克/毫升 2毫克到将100ul DMSO
HRP 10毫克/毫升在PBS
SA(间接) 10毫克/毫升在PBS
SA(直接) 0.17微克/毫升在PBS
BSA 20毫克/毫升在PBS
DTT 100mM的在去离子水
EDTA 5毫米 18.6毫克到10毫升的PBS
酪蛋白 0.50% 在PBS
吐温80 20% 在去离子水
吐温80在PBS中 0.05%
醋酸钠 50毫米在去离子水,调整到用3 M盐酸pH值5.1
TMB 1% 在DMSO
H 2 O 2 3% 在去离子水
H 2 SO 4 2M的在去离子水

表7:试剂解决方案列表。

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Discussion

我们已经提出用于连接工程活细胞与官能材料表面的新策略。这通过开发能够当用IPTG诱导合成生物素的水平升高的细胞系实现的。生物素的水平升高然后可用于修改功能化表面。该协议详细讲述了工程师大肠杆菌细胞系,以及如何创建两个不同的官能表面。

在这个协议中的关键步骤发生在整个工程细胞株的构建。以避免下游的问题,表征与两个生长曲线的工程细胞株( 图2)和荧光响应( 图3)是鼓励。应的程序问题时,其它分子克隆策略,诸如PCR提取和Gibson组件14,可被取代的步骤酌情。用于优化生物素一愕工程化细胞系的LD,这是至关重要的,以确保DTB足够量被提供给细胞。在我们的研究中,我们发现,200毫微克/毫升DTB引起生物素产量大幅和统计学显著增加时,细胞用IPTG诱导。此外,BSA - 生物素,SA-HRP,和生物素 - 辣根过氧化物酶的成功缀合是用于有效地执行和监测直接和间接控制方案至关重要。小心避免不必要曝光和使偶联物在4℃下孵育过夜,以确保形成一种有效的结合物。

我们的协议提供了超过其他方法15的优点,由于其相比于市售生物素检测试剂盒,如那些基于4'- hydroxyazobenzene -2-羧酸以检测生物素的小批量是生物学相关(皮克/毫升刻度)的能力竞争性结合策略。尽管使用链霉抗生物锡系统是在生物技术16,17常见,我们的系统对小批量的生物素的能力使我们能够直接链接我们的基因工程细胞株具有功能化表面。

我们的协议中的一个潜在的限制是生物素检测所得到的动态范围。在直接和间接控制方案,我们能够检测到10 2 3和10分别( 见图4)之间-10 4 -10 6微克/毫升,生物素。幸运的是,小范围内的间接控制方案可以让我们容易地检测从改造的细胞生物素生产。然而,间接控制的动态范围的紧带限制了其用于感测在生物素浓度变化大(100倍)的能力。变更为间接和直接控制方案的动态范围,将需要额外的工程。然而,如果检测细胞产生ð生物素是一个问题,制备生物素的上清液的稀释液在步骤4.6应该允许研究者定位的间接的控制方案( 图5)的动态范围。我们发现,1:5稀释的上清液允许我们有效地针对间接控制方案的动态范围。该稀释策略应该减轻需要直接修改的动态范围。

这里提出的两部分组成的,细胞的材料系统允许工程细胞修改功能化表面的组合物。动态,活细胞可以解释它们的化学环境产生遗传响应。通过设计这种遗传响应于增加生物素生产,我们可以赋予工程化的活细胞与控制和操纵功能化表面的能力。由以下提出的协议,工程细胞能够作为动态传感器,能够读取,处理和记录围绕第条件通过功能化的接口他们。这项技术可能会影响领域,从分子医药分析检测环境整治。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

作者非常感谢来自美国的科学研究空军办公室从获奖FA9550-13-1-0108支持。作者还从美国的海军研究办公室确认来自奖N00014-15-1-2502支持,从研究所的关键技术和应用科学在弗吉尼亚理工学院和州立大学和美国国家科学基金会研究生科研经费奖学金计划,奖号1607310。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Agar Fisher Scientific BP9744500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Casamino Acids  Fisher Scientific BP1424-100
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
NEB Turbo Cell Line New England Biolabs C2984l
Oligonucleotide Primers Thermo Fisher Scientific N/A 25N synthesis, DSL purification
Q5 High-Fidelity Polymerase New England Biolabs M0491S
Q5 Reaction Buffer New England Biolabs B9027S
dNTP Solution Mix New England Biolabs N0447S
Agarose Bioexpress E-3120-125
Ethidium Bromide, 1% Fisher Scientific BP1302-10
Gel Extraction Kits Epoch Biolabs 2260250
GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit Epoch Biolabs 2160250
AatII New England Biolabs R0117S
SacII New England Biolabs R0157S
HindIII-HF New England Biolabs R3104S
EcoRI-HF New England Biolabs R3101S
Cutsmart Buffer New England Biolabs B7204S
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202S
ColiRolle Glass Plating Beads  EMD Millipore 7101-3
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755-10
NHS-Desthiobiotin (DTB) Thermo Fisher Scientific 16129
Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC)  Thermo Fisher Scientific S1534
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)  Fisher Scientific BP231-100
Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP)  Thermo Fisher Scientific S1531
NHS-LC-LC-biotin Thermo Fisher Scientific 21343
Horseradish Peroxidase (HRP)  Thermo Fisher Scientific 31490
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fisher Scientific BP399500
Streptavidin (SA)  Thermo Fisher Scientific 21145
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Dithiothreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA)  Fisher Scientific S311-500
Tween 80  Fisher Scientific T164-500
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-4
3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) Fisher Scientific AC229280050
Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators  Viva Products VS0192
Sodium Acetate, Anhydrous Fisher Scientific BP333-500
96-Well Polystyrene Plates Thermo Fisher Scientific 266120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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