تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الاتصالات بين الخلايا النباتية، plasmodesmata (Pd)، تلعب الأدوار المركزية في مصنع التفاعلات فسيولوجيا ومصنع للفيروسات. يتم فرز الحرجة للنقل Pd الإشارات التي توجه البروتينات للمشتريات. غير معرفتنا في تسلسل هذه لا تزال في مهدها. يصف لنا استراتيجية لتحديد إشارات التعريب Pd في البروتينات المستهدفة Pd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) هي خلية إلى الاتصالات التي تعمل كبوابات تنقل من خلالها الجزيئات الصغيرة والكبيرة بين الخلايا النباتية. بينما النقل Pd من جزيئات صغيرة، مثل الأيونات والماء، المفترض أن يحدث مكتوفي الأيدي، نقل خلية إلى خلية من الجزيئات البيولوجية الكبرى، مثل البروتينات، يحدث على الأرجح عبر إليه نشطة تتضمن إشارات محددة تستهدف في نقل جزيء. ندرة plasmodesmata التي تم تحديدها (Pd) ترجمة الإشارات (PLSs) قد مقيدة بشدة فهم الفرز البروتين مسارات تشارك في زرع خلية إلى خلية الجزيئات النقل والاتصالات. من ثروة النباتات البروتينات الذاتية والفيروسية المعروفة لحركة المرور من خلال Pd، PLSs ثلاثة فقط أبلغ حتى الآن، كل منهم من البروتينات النباتية الذاتية. وبالتالي، من المهم وضع استراتيجية تجريبية موثوقة ومنهجية لتحديد تسلسل الثابتة والمتنقلة فنية، التي ضرورية وكافية لاستهداف Pd، مباشرة في المعيشة الخلايا النباتية. هنا، يمكننا وصف واحد مثل هذه الاستراتيجية كنموذج باستخدام حركة الخلية للخلية البروتين (MP) فيروس تبرقش التبغ (TMV). هذه التجارب، التي حددت ووصفت الأول النباتية الثابتة والمتنقلة الفيروسية، ويمكن تكييفها لاكتشاف تسلسل الثابتة والمتنقلة في البروتينات الأكثر استهدافاً Pd.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) تعمل كقنوات لنقل المنظمين مفتاح التنمية النباتية و morphogenesis، بدءاً من عوامل النسخ مرناً وجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذا قدرة النقل الجزيئات Pd معظم الفيروسات النباتية لانتشارها بين الخلايا أثناء العدوى؛ للانتقال عبر Pd، تطورت فيروسات النباتات البروتينات المتخصصة، ووصف حركة البروتينات (MPs)، التي تستهدف على وجه التحديد إلى Pd1،2،3،4،،من56 , 7-الجزيئية مسارات النقل Pd على الأرجح ترابطاً وثيقا مع تسلسل معين التي تستهدف نقل البروتينات في هذه المسارات. وهكذا، قد يكون تحديد هذه الإشارات التعريب Pd (PLSs) التشخيص لمسار النقل Pd المقابلة. وهذا قياسا ل النقل Pd8، على سبيل المثال، إلى مسارات مختلفة استيراد النووية، التي يمكن أن تكون محددة للتعريب النووية المختلفة إشارة (NLS) تسلسل9،10. من الناحية المفاهيمية، نلس و PLSs تمثل تسلسل استهداف سوبسيلولار غير كليفابل التي ضرورية وكافية لاستهداف. ولكن، خلافا نلس11، تسلسل المعلومات حول PLSs محدودة للغاية. على وجه التحديد، سجلت أربعة فقط تسلسل البروتين المتورطين في استهداف Pd، مع كل منهم المستمدة من البروتينات النباتية الذاتية. ويمثل أول واحد مجال هوميوبوكس KN112 – عامل نسخ الذي ينتقل من طبقات الخلايا الداخلية للبشرة من أوراق النبات13 – وبه نوكس هومولوجس14. أيضا هو ثانية واحدة من عامل نسخ، شعبة الشؤون المالية، التي تتضمن الثابتة والمتنقلة المفترضة وصفه الاتجار بين الخلايا (IT) عزر15. التسلسل الثالث من بروتين غشائي نوع plasmodesmata المقيم 1 PDLP1، ويتم تمثيله بواسطة مجال transmembrane16. وأخيراً، Pd الرابعة استهداف تسلسل أبلغ مؤخرا عن جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)-البروتينات المرتبطة، وأنه يمثل إشارة التعديل جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)17.

من المثير للاهتمام، وحتى وقت قريب جداً، لا PLSs أبلغ النواب الفيروسي. أشارت الدراسات السابقة إلى وجود تسلسل الثابتة والمتنقلة المفترضة في النبات الفيروسية MPs18،19، ولكن ليس صحيحاً الثابتة والمتنقلة، أيتسلسل الأحماض الأمينية الحد أدنى الضروري والكافي لاستهداف Pd (جزيء بضائع لا علاقة لها كل على سبيل المثال-، الحراجية المعتمدة) قد حددت في النائب فيروسية. بعد واحدة من هذه البروتينات، النائب من فيروس تبرقش التبغ (TMV)، كان الأول للمشتريات التي تم التعريب والنقل تبين20.

ولسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير استراتيجية تجريبية لتحديد "تمف النائب الثابتة والمتنقلة". استندت هذه الاستراتيجية على ثلاثة مفاهيم. (ط) وحددنا الثابتة والمتنقلة كتسلسل الحد أدنى من الأحماض الأمينية التي ضرورية وكافية لاستهداف البروتين إلى Pd21. (ثانيا) لأن النائب تمف يستهدف أولاً Pd وثم ترانسلوكاتيس من خلال هذه القنوات22، نحن تهدف إلى فصل هذين النشاطين والتعرف الثابتة والمتنقلة حسنة النية، التي تعمل فقط من أجل استهداف Pd، وليس للنقل اللاحقة. (ثالثا) قمنا بتحليل الثابتة والمتنقلة التي تم تحديدها للمخلفات من الأحماض الأمينية الهامة للمشتريات استهداف نشاط، سواء هيكلياً أو وظيفيا. باستخدام هذا النهج، نحن تحديد تسلسل بقايا الأحماض أمينية 50 في الأمينية المحطة "النائب تمف" بمثابة النية الثابتة والمتنقلة. وكان ذلك بإنتاج سلسلة من الشظايا "تمف النائب" أن مشبعة على طول من البروتين، ووضع علامات على الكربوكسيل تيرميني مع الحركة وعابر إذ تعرب عن لهم في الأنسجة النباتية. تعريب Pd كل أجزاء اختبار تحددها كوكسبريسينج لهم مع بروتين علامة Pd، PDCB1 (Pd كلوس ملزمة البروتين 1)23. واعتبر الجزء الأصغر التي لا تزال المترجمة إلى شعبة المشتريات، ولكن عدم اجتياز Pd، لتمثيل الثابتة والمتنقلة. وأخيراً، كان الثابتة والمتنقلة ألانين الممسوحة ضوئياً لتحديد بقايا الأحماض الأمينية الأساسية اللازمة لهيكل و/أو وظيفة.

بينما نحن هنا لتوضيح هذا النهج بوصف تحديد "تمف النائب الثابتة والمتنقلة"، فإنه يجوز لاكتشاف PLSs في أي البروتينات المستهدفة لشعبة المشتريات الأخرى، سواء ترميز بمسببات الأمراض النباتية أو النباتات أنفسهم؛ وهذا لأن لدينا أسلوب عدم الاستفادة من أي ميزات فريدة من نوعها الفيروسية من أعضاء البرلمان فيما يتعلق بقدرتهم على الهدف إلى Pd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-مصنع المواد

  1. اختيار أنواع النباتات
  2. استخدام الأنواع النباتية الأصلية للبروتين من الفائدة، أي، والذي يقوم بترميز هذا البروتين للبروتينات الذاتية أو الذي يمثل المضيفة الطبيعية لمسببات المرض للبروتينات الفيروسية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون الأنواع النباتية المحددة قابلة للطريقة المختارة للتحول الوراثي عابرة.
    ملاحظة: الدراسات التي تستخدم بشكل روتيني نيكوتيانا بينثاميانا، الذي يمثل مضيفة جيدة تمف وتتحول كفاءة تقنية التحول الجيني بوساطة المتبعة، أي، أجروينفيلتريشن (راجع الخطوة 3). محطات بينثاميانا أ. كما تزرع بسهولة ويترك الكبيرة، التي يتم تطعيمهم بسهولة المتبعة وتحليلها بسهولة بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل].
  3. نمو النبات
    1. أ. بينثاميانا بذور النباتات في التربة الرطبة في كثافة عالية. الاحتفاظ بها في دائرة بيئة التي تسيطر عليها في 20-25 ˚C تحت 16 ح الضوء في ~ 75 µmol الفوتونات m-2 s-1 و 8 ح الظلام. بعد قطر يوفيل تصل إلى 0.5 سم، بعناية نقل الشتلات إلى أواني أكبر ومواصلة النمو في الدائرة نفسها نفس الظروف.
    2. المحافظة على النباتات حتى تنمو إلى المرحلة 4-8-ليف في غضون 4 أسابيع عندما يترك أكبر 4-6 سم في القطر؛ وفي هذا الوقت، يمكن استخدامها أجروينفيلتريشن (راجع الخطوة 3).
      ملاحظة: الأهم من ذلك، ابدأ استخدام النباتات إذا بدأت زهرة لأنه، في هذه المرحلة الإنمائية، يختلف بنية ليف غالباً24،25، مما يؤدي أحياناً إلى نتائج غير متناسقة.

2-التعبير بناء ناقلات

  1. اختيار نظام التعبير
    1. اختر التعبير نظام أيوناقلات وناقلات أسلوب التسليم، الأكثر ملاءمة للتعبير عن بروتين الاهتمام بالأنواع النباتية التي شملتها الدراسة.
      ملاحظة: في بعض الأحيان، مثل مجموعات محددة من أنواع اختبار البروتين/النباتات قد تتطلب موجهات محددة وناقلات أسلوب التسليم للتعبير الأمثل ووظيفة البروتين للفائدة. للنباتات الأكثر فلقتين، ومع ذلك، حدد والبلازميدات ثنائي نواقل التعبير وأجروينفيلتريشن كنظام التسليم.
  2. علامات البروتين نيون
    1. فلوريسسينتلي الوسم كل البروتين أعرب للتحليل توزيع سوبسيلولار22، بما في ذلك الترجمة Pd.
      ملاحظة: تستخدم البروتينات أوتوفلوريسسينت، مثل الحركة و DsRed2، كالعلامات. العلامة البروتين تم اختبارها مع الحركة وكوكسبريس أنه مع DsRed2 حرة. وظائف الحراجية المعتمدة كعلامة وجزيء بضائع لا علاقة لها الفيروس. وظائف DsRed2 لمعايرة الكفاءة الإجمالية للتعبير عابرة، وأنها خلية مستقلة، لتحديد الخلية في البداية تحول؛ هذه الوظيفة الأخيرة المهم عند تقييم حركة الخلية للخلية البروتينات اختبار يحتمل أن تكون غير الخلية--المستقلة. كوكسبريسيون مع علامة Pd PDCB1، الذي أيضا خلية مستقلة، العلامة البروتين تم اختبارها مع الحركة و PDCB1 مع DsRed2.
    2. وكقاعدة عامة، صهر العلامة أوتوفلوريسسينت إلى الكربوكسيل-محطة البروتين المعرب عنها. ومع ذلك، إذا كانت المعروضات البروتين اختبار كامل طول المعلمة شبهة استهداف Pd، نقل العلامة إلى الأمينية تيرمينوس البروتين.
    3. استنساخ الترميز تسلسل البروتينات لفحصها في ناقل تعبير النباتات مناسبة.
      ملاحظة: هناك العديد من ناقلات التعبير النباتية المختلفة التي تسمح لوضع علامات مضيئة. نحن نستخدم مجموعة من pSAT والبلازميدات26 أو بعض من تلك المشتقات27،28، التي مناسبة لاستنساخ للتسلسل لمصلحة مباشرة في الإطار مع العلامات أوتوفلوريسسينت المقترحة (راجع الخطوة 2.2.1) في كلا الأمينية--و التوجهات الكربوكسيل الطرفية.
    4. نقل كل كاسيت التعبير إلى متجه ثنائي المتبعة.
      ملاحظة: على الرغم من أن يبني على أساس pSAT مناسبة لإيصال biolistic مباشرة إلى أنسجة النبات، أجروينفيلتريشن، وهو أسلوب التحويل الموصى بها هنا (راجع الخطوة 3)، يتطلب أن الكاسيت التعبير تقع بين تي-الحمض النووي حدود ثنائي ناقلات29.
      ملاحظة: جميع pSAT ناقلات مصممة للسماح بنقل هذه إلى26،ناقل ثنائي التعبير مولتيجيني بزب-RCS230 باستنساخ خطوة واحدة استخدام قطع نادرة nucleases الإداريين،--بوي،-اسوسﺗﻴﻚ، وأنا-سي، بي-بسبي وتلى PI 26-يمكن توظيف الباحثين الذين يفضلون استخدام الاستنساخ ريكومبيناتوريال، مثلاً، استخدام مواقع مغايرة لوكس 31، pSAT متجه المتغيرات26،27.
    5. كوكسبريشن، نقل كل شرائط التعبير، مثلاً، اختبار البروتين-الحراجية المعتمدة و DsRed2 أو اختبار البروتين-الحراجية المعتمدة و PDCB1-DsRed2 (انظر الخطوة 2، 1)، إلى نفس الموجه ثنائي بزب-RCS2.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، الثقافات المتبعة إيواء ثوابت ثنائي الفردية يمكن أن تكون مختلطة معا للتسلل إلى أ. بينثاميانا (راجع الخطوة 3.1).

3-أجروينفيلتريشن

  1. إضافة 1 ميكروغرام من بلازميد بزب-RCS2-تعتمد من الثقافة 2.2.5 إلى 100 ميليلتر خطوة من الخلايا المختصة من سلالة tumefaciens المتبعة EHA105 أو GV3101 التي أعدت ك وصف32، احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، وفلاش-التجميد في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة، و تبني في 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    1. ثم أضف 1 مل متوسطة رطل (تريبتوني 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر و 10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم) إلى خليط الخلية المختصة واحتضان عند 28 درجة مئوية ل 2 حاء تدور أسفل الخلايا في 3,000 × ز لمدة 1 دقيقة، وإعادة تعليق لهم في 0.2 مل رطل ، ولوحة لهم في أجار رطل وتستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (مثل، بالسبيكتينوميسين 100 مغ/لتر ووالريفامبيسين 50 مغ/لتر لناقلات المستندة إلى RSC2 بزب،من2630). تنمو عند 28 درجة مئوية عن 48 ساعة حتى مستعمرات فردية مرئية.
  2. بيك ولوحة عدة مستعمرات فردية على طبق أجار رطل طازجة (راجع الخطوة 3.1)، ينمو بمعدل 28 درجة مئوية ح 48، وأن كمية صغيرة من البكتيريا لتحليل بمستعمرة [بكر]33 تأكيد وجود بنيات ثنائية محددة.
  3. تنمو كل مستعمرة المتبعة مع بنية الفوائد بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في 5 مل من رطل المتوسطة وتستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (راجع الخطوة رقم 3.1.1). الطرد المركزي الخلايا في 3,000 × ز، وإعادة تعليق لهم للتطوير التنظيمي600= 0.5 في المخزن المؤقت أجروينفيلتريشن (مم 10 MgCl2، 10 مم مس (pH 5.6)، 150 ميكرون أسيتوسيرينجوني). احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    1. في حالة استخدام خليط من والبلازميدات ثنائي بدلاً من بلازميد تعبير مولتيجيني واحد للبروتين كوكسبريشن، خلط الثقافات الخلية المقابلة في نسبة 1:1 v/v قبل تسلل. ثم احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية ح 2.
  4. تحميل العدوى إلى 1 مل المحاقن البلاستيكية والصحافة يترك فوهة المحاقن (لا الإبرة) ضد البشرة (أباكسيال) أقل من النضج الكامل بينثاميانا أ . عقد طرفية مع إصبع القفاز على الوجه أداكسيال34،35.
    1. إدخال المتبعة في عمليات التسلل المتوسطة عن طريق الحقن البطيء. للأهمية الإحصائية، تسلل عدة أوراق في كل مصنع.
      ملاحظة: لاحظ أن يترك أقدم لا تستخدم كما أنها لا تؤدي إلى مستويات التعبير متسقا.
    2. تطعيم جميع الأوراق في الموقع. المحافظة على النباتات تسلل حتى المراقبة كما هو موضح في "الخطوة 1، 2".

4-[كنفوكل] مجهرية

  1. استخدام شفرة لقطع كل ورقة إلى شظايا بين العروق ح 24-48 بعد التسلل، (تبعاً لكفاءة التعبير عابرة من البروتين اختبار محددة)؛ ينبغي أن يكون حجم كل شريحة الأنسجة مثل الشريحة مغطى تماما بالزجاج غطاء (22 مم × 40 مم) المستخدمة للفحص المجهري.
  2. وضع قطره من الماء على الشريحة ليف مكان شرائح أوراق على الكائن الشريحة مع سطح أوراق أباكسيال التي تواجهها، وتغطية ذلك مع الزجاج غطاء. شل الزجاج غطاء مع قطع صغيرة من الشريط على كل جانب.
  3. مراقبة الأنسجة أجروينفيلتراتيد تحت ليزر [كنفوكل] مجهر مسح وتسجيل الصور الناتجة.
    1. أولاً، استخدام عدسة هدف X 10 لتحديد الخلايا مع الإشارة، وثم استخدم عدسة الهدف x 63 للملاحظات أكثر تفصيلاً.
    2. الطول الموجي نانومتر الاستخدام 458 من ليزر أيون أرجون تثير الحراجية المعتمدة، و 543 نانومتر لإثارة DsRed2. الاحتفاظ بكافة الإعدادات للحصول على الصور، و أي، وكثافة الليزر وضوئي أنبوب (PMT) الإعدادات، بين التجارب. وفي المتوسط، فحص خلايا 100-120 لكل حالة تجريبية.

5-تحديد الثابتة والمتنقلة

  1. تشخيص تعريب البروتين تم اختبارها باستخدام مجهر [كنفوكل] (القسم 4). تحقق إذا كان اختبار البروتين25،سمة نمط الشروريه الطرفية36،38،37،39،،من4041 وكولوكاليزيس مع علامة Pd PDCB123. يشير هذا إلى أن البروتين اختبار يحتوي على الأرجح على تسلسل الثابتة والمتنقلة.
  2. بعد تأكيد النشاط الثابتة والمتنقلة لاختبار البروتين، تدريجيا بتقسيم إطاره القراءة المفتوحة (ORF) (بنك الجينات انضمام عدد BAF93925.1) إلى أجزاء أصغر، أوتوفلوريسسينتلي، (مثلاً، الحراجية المعتمدة،) علامة كل منها، وتحليل ما سوبسيلولار الترجمة كما هو موضح في الخطوة 4. وفي البداية، يوصي بحجم المخلفات من الأحماض الأمينية 100 لكل جزء ينقسم.
  3. كذلك تقسيم الأجزاء المقطوعة التي لها نشاط الثابتة والمتنقلة وتحقق بها التعريب سوبسيلولار كما هو موضح في الخطوة 4 حتى الجزء الأصغر التي لا تزال يموضع إلى Pd، أي ما يكفي لنقل البضائع العلامة أوتوفلوريسسينت إلى Pd، يتم تعريف. ويفترض هذا الجزء لتمثيل تسلسل الثابتة والمتنقلة.
  4. حذف الثابتة والمتنقلة المفترضة من البروتين اختبار كامل طول، أي فتيل الجزء المتبقي من البروتين الاختبار دون الثابتة والمتنقلة المفترضة للعلامة أوتوفلوريسسينت، وتحديد التعريب سوبسيلولار من البروتين متحولة الناتجة كما هو موضح في الخطوة 4. إذا فشل هذا البروتين المسخ الذي يفتقر الثابتة والمتنقلة المفترضة لتعريب إلى Pd، هذا سوف تشير إلى أن المحددة الثابتة والمتنقلة لا فقط كافية (انظر الخطوة 5.3)، لكنها ضرورية أيضا لنقل Pd البروتين تم اختبارها.
  5. أجروينفيلتراتي أوراق بخليط ثقافات المتبعة إيواء التعبير بناء لمعلم الحراجية المعتمدة الثابتة والمتنقلة و DsRed2 الحرة (راجع الخطوة 3، 3). مراقبة تسلل الأنسجة باستخدام مجهر [كنفوكل] مع عدسة الهدف 10 x باستخدام نفس الإعدادات كما هو الحال في "الخطوة 4، 3".
  6. نقاط الخلايا التي تحتوي على إشارات الحراجية المعتمدة و DsRed2 كخلايا تسلل في البداية، ونقاط الخلايا المجاورة التي تتضمن فقط إشارة الحراجية المعتمدة كتلك أن حركة المعرض.
    ملاحظة: هذه الخطوة يدرس الثابتة والمتنقلة التي تم تحديدها لقدرته خلية إلى الحركة المحتملة؛ وهذا لأن العديد من البروتينات التي تستهدف Pd (بما في ذلك معظم النباتات الفيروسية MPs) أيضا نقل عن طريق المشتريات إلى الخلايا المجاورة. تركيز المتبعة المستخدمة لتسلل يعتمد على كفاءة هياكل مختلفة التعبير على التوالي. أجروينفيلتريشن، تأكد من استخدام تمييع الثقافة الخلية التي تضمن (ط) تحول الخلايا المفردة، ترك الخلايا المتجاورة تناظري، (ثانيا) أن يحقق كفاءة مماثلة للتعبير. على سبيل المثال، تستخدم تجاربنا OD600 من 0.01 و 0.005 للتعبير عن معلم الحراجية المعتمدة الثابتة والمتنقلة والحرة DsRed2، على التوالي.

6-تحديد المخلفات "الرئيسية الثابتة والمتنقلة" باستخدام "المسح ألانين"42

  1. استخدام البروتوكولات القياسية PCR لتضخيم الثابتة والمتنقلة الترميز تسلسل استخدام زوج من أجهزة الإشعال مصممة لتحتوي الطفرة المرجوة، أي، والاستعاضة عن بقايا الأحماض الأمينية المستهدفة مع ألانين، حول المنطقة الوسطى من كل التمهيدي كما هو موضح 21-القيام بالتصميم التمهيدي واستخدام طقم الطفرات موقع الموجه للطفرات موقع الموجهة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. تنقية منتجات PCR الناتجة عن استخدام أي أدوات تنقية الحمض النووي القياسية، ويستوعبها في 37 درجة مئوية مع دبني للقضاء على الوالدية (أيغير المتحولة) ميثليته وهيميميثيلاتيد الحمض النووي. يبرد هذا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (وليس على الجليد). ثم تحويل المزيج مباشرة إلى الخلايا المختصة كولاي 43، وتحديد المستعمرات مع بنيات المسخ المطلوبة كما هو موضح في "الخطوة 3-2".
  3. إدخال بنيات متحولة إلى ناقل ثنائي كما هو موضح في الخطوة 2.2.4 وتنفيذ أجروينفيلتريشن كما هو موضح في الخطوة 3، وتقييم Pd استهداف كما هو موضح في الخطوات 4 و 5، 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بيانات تمثيلية، إخلاص توضح النتائج المتوقعة من البروتوكولات وصف وتحديد "النائب تمف المتنقلة"، مقتبسة من يوان et al. 21-ويوجز الشكل 1A أولاً ثوابت رئيسية معربا عن كامل طول "تمف النائب" (1-268)، تمف النائب الثابتة والمتنقلة (التي تضم بقايا الأحماض الأمينية أول 50 من البروتين، 1-50)، والأنين المسح مشتقات V4A تنصهر فيها الحركة (التي تم إنشاؤها ك ووصف في "الخطوات 2-2"، 5-2 و 6) حين يلخص الشكل 1B ويوضحها توطين هذه البروتينات المعلمة سوبسيلولار. ويوضح الشكل 1 مميزة الطرفية الشروريه Pd التعريب أنماط لاحظ للنائب تمف-الحراجية المعتمدة وعن تمف النائب الثابتة والمتنقلة-الحراجية المعتمدة، وكذلك فيما يتعلق بعلامة Pd كويكسبريسيد، PDCB1-DsRed2 (راجع الخطوة 5، 1). يوضح الشكل 2 ألف Pd استهداف تمف النائب-الحراجية المعتمدة وتوزيع تمف النائب الثابتة والمتنقلة-الحراجية المعتمدة ونوكليوسيتوبلاسميك كويكسبريسيد DeRed2 الحرة (راجع الخطوة 5، 1). وأخيراً، يوضح الشكل 2B فقدان Pd استهداف "النائب تمف" و "تمف النائب الثابتة والمتنقلة" مع استبدال ألانين واحد V4A، مشيراً إلى أن هذه البقايا هامة للبنية الثابتة والمتنقلة أو وظيفة؛ في نفس الخلايا علامة Pd كويكسبريسيد PDCB1 لا يزال يموضع إلى Pd (راجع الخطوة 6).

وتوضح هذه البيانات أن هذا الإجراء بسيطة نظرياً وتقنياً للإنتاج المنتظم لشظايا البروتين، والانصهار إلى بروتين علامة شحن أوتوفلوريسسينت، واختبار للقدرة على ترجمة إلى Pd يمكن تحديد تسلسل بروتين الحد الأدنى ضرورية وكافية لشعبة المشتريات الاستهداف، أي، الثابتة والمتنقلة. للحصول على التفسير الصحيح لهذه البيانات ومسلم، من الأهمية بمكان القيام بتجارب كولوكاليزيشن مع بروتين Pd معروفة، مثلاً، ريماند أو بدكب أفراد الأسرة16،23 أو واحدة من المصنع النواب الفيروسي هذا النوع إلى Pd44 . ومن الواضح أن ليس لديه كولوكاليزيشن أن تكون كاملة، لا جميع البروتينات إضفاء الطابع المحلي ف قد تستهدف Pd نفس، ولكن درجة يعتد بها إحصائيا من كولوكاليزيشن مع واحد على الأقل من البروتينات ماركر Pd ضروري لتحديد النشاط الثابتة والمتنقلة.

Figure 1
رقم 1: تحديد النائب تمف مخولين (أ) موجز بنيات الحراجية المعتمدة-الانصهار الرئيسية المستخدمة لتحديد مربعات متواليات، الأخضر "تمف النائب مخولين تمف النائب"؛ الحراجية المعتمدة، مربعات زرقاء؛ ف، والمروج؛ T, فاصل. تشير الأرقام على اليسار إلى مخلفات الأحماض الأمينية المدرجة في كل جزء "تمف النائب". (ب) ملخص للتعريب سوبسيلولار البروتينات الانصهار المبينة في (أ). Pd الترجمة أو التعريب نوكليوسيتوبلاسميك مصممة استناداً إلى إضفاء الطابع المحلي على علامات المقابلة سوبسيلولار، PDCB1-DsRed2 والحرة DsRed2، على التوالي. ويبين النسبة المئوية للخلايا العارضة كل نمط التعريب استناداً إلى سجل خلايا تعرب عن 100 الواحدة في ثلاث تجارب مستقلة بناء. البيانات هي ± يعني الأخطاء المعيارية (جنوب شرق). (ج) Pd استهداف تمف النائب-الحراجية المعتمدة والثابتة والمتنقلة النائب تمف-الحراجية المعتمدة، وعلامة Pd PDCB1-DsRed2. إشارة الحراجية المعتمدة باللون الأزرق؛ إشارة DsRed2 في الأرجواني؛ وقد تخرج البلاستيديه أوتوفلوريسسينسي. الصور هي واحدة من الأقسام [كنفوكل]. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. DIC، تدخل فرق تباين صورة مجهرية. وهذا الرقم مقتبس من يوان et al. 21- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: Pd استهداف النائب تمف تمف النائب الثابتة والمتنقلة وبهم طفرات المسح ألانين. (أ) الترجمة سوبسيلولار تمف النائب-الحراجية المعتمدة، والنائب تمف الثابتة والمتنقلة-الحراجية المعتمدة، وعلامة نوكليوسيتوبلاسميك DsRed2. (ب) الخسارة من Pd تستهدف قدرة طفرات المسح ألانين V4A تمف النائب-الحراجية المعتمدة والثابتة والمتنقلة النائب تمف-الحراجية المعتمدة. وقد تصور Pd من كوكسبريشن علامة Pd PDCB1-DsRed2. إشارة الحراجية المعتمدة باللون الأزرق؛ إشارة DsRed2 في الأرجواني؛ وقد تخرج البلاستيديه أوتوفلوريسسينسي. الصور هي واحدة من الأقسام [كنفوكل]. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. DIC، تدخل فرق تباين صورة مجهرية. وهذا الرقم مقتبس من يوان et al. 21- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول له أربعة مكونات أساسية: مفهوم تحديد تسلسل ضروري وكاف لاستهداف Pd، تقسيم منهجي من بروتين الفائدة إلى الشظايا التي تنخفض تدريجيا في الطول، والصمامات تم اختبارها الشظايا إلى بروتين أوتوفلوريسسينت الذي يخدم كعلامة وشحن الجزيئات، والتحليل الوظيفي لاستهداف Pd في المعيشة زرع الأنسجة بعد تعبير عابر من البروتينات الانصهار اختبارها. لاحظ أن التعبير عابر المتبعة بوساطة يولد البيانات خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن، أي، عدة أيام، بالمقارنة مع الأشهر المطلوبة لإنتاج النباتات المعدلة وراثيا التي غالباً ما تستخدم في دراسات مماثلة15.

كوكسبريسيون من بروتين الاهتمام مع علامات التعريب سوبسيلولار، مثلاً، PDCB1 أو DsRed2 الحرة، عادة ما يتم تنفيذ من ناقل تعبير مولتيجيني. ومع ذلك، إذا كان تحويل العديد من أشرطة الكاسيت التعبير إلى ناقل واحد إشكالية من الناحية الفنية، كوكسبريشن يمكن أيضا إجراء بنقل كل كاسيت إلى بنية ثنائية منفصلة، والجمع بين كميات تعادل الثقافات السائل من سلالات المتبعة الناتجة عن أجروينفيلتريشن. ناقل ثنائي لأن هذا البروتوكول يستخدم تعبير عابر، حاجة لا تحمل علامات التحديد للتحول مستقرة، على الرغم من أن وجودها لا يضر بكفاءة التعبير.

هذا البروتوكول الأمثل للتعبير البروتين والاستهداف في بينثاميانا أ؛ ومع ذلك، يمكن استخدامه في سائر الأنواع النباتية، بما في ذلك أعطيت45،46، قابلة للتحول الوراثي المتبعة. للأنواع النباتية الأخرى، أو إذا رغبت في ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها للاستفادة من بيوليستيك تسليم41 للتعبير عابرة من ناقلات المستندة إلى pSAT، وتجنب الحاجة إلى نقل شرائط التعبير إلى متجهات ثنائية مباشرة.

نقطة حرجة في هذا البروتوكول هو الشرط الفسيولوجية وإنمائية متسقة من المواد النباتية. على وجه التحديد، يجب أن تكون كافة منشآت صحية في جميع أنحاء كامل التجربة، والنباتات بينثاميانا أ أجروينفيلتريشن، يجب أن يكون أقل من 4 أسابيع القديمة وفي المرحلة 4-8-ليف مع ورقة أكبر حاليا 4-6 سم في القطر. إذا كانت النباتات صغيراً جداً، ستكون قاسية للغاية، التدخل في التعبير والترجمة من البروتينات المعلمة آثار أجروينفيلتريشن. من ناحية أخرى، النباتات الأكبر سنا غالباً ما يحمل بنية متغير Pd24،25، تؤثر أيضا على الاتساق بين أنماط استهداف Pd.

لا يزال، نظراً لاختلاف الظروف الفسيولوجية للمصنع ككل، والخلايا المحولة خاصة، إلى حد ما قد تختلف كفاءة Pd الاستهداف في كل تجربة. وبالتالي، من المهم تحليل عدد كبير نسبيا من الخلايا (> 100) كل تجربة، وأداء replicates البيولوجية ثلاثة على الأقل من كل تجربة. عموما، نحن نعتبر جزء تم اختبارها لاحتواء Pd تستهدف النشاط، إذا أنه يسلك التعريب Pd في 70 في المائة على الأقل من الخلايا المحولة. يجب أن يتم تحليل الاختلافات في Pd استهداف الكفاءة لكل جزء، مثلاً، في المئة من تحول الخلايا تظهر نمط التراكم الشروريه الخاصة بالمشتريات، باختبار t للطالب، وقيم p < 0.05-0.01، المقابلة الاحتمالات الإحصائية لأكثر من 95-99%.

مسألة هامة أخرى هي موضع العلامة نيون/الشحنة في جزيء الانصهار. بعض البروتينات المستهدفة لشعبة المشتريات أيضا إقران هيولى (ER)، وقد تتطلب هذه الرابطة بالتسلسل الأمينية الطرفية دون عائق. وفي هذه الحالات، اندماج الأمينية الطرفية، التي تنصهر الكربوكسيل-المحطة جزء البروتين من الفائدة هو فيها الأمينية تيرمينوس علامة نيون، مثلاً، الحراجية المعتمدة أو DsRed2، ينبغي أن تستخدم. ويمكن تغيير هذا الموضع الافتراضي للعلامة في الحالات التالية. (ط) في حالة اندماج الأمينية الطرفية غير قابل للاستخدام – أيأنها لا معرض أنماط ذات معنى التعريب سوبسيلولار، ويعبر عن سوء، أو لا تولد الفلورسنت إشارة كافية لكشف موثوق بها – وإذا كان البروتين للفائدة لا تحتوي على تسلسلات إشارة الأمينية الطرفية أو اندماج الكربوكسيل الطرفية التي تنصهر الأمينية تيرمينوس جزء اختبار هو فيها الكربوكسيل-محطة العلامة، ينبغي محاولة. (الثاني كما يجب استخدام الأنشطار الكربوكسيل الطرفية) إذا بروتين الفائدة يحتوي على تسلسل إشارة في نهايته الكربوكسيل. (ثالثا) إذا كان البروتين لمصلحة كلا إشارات الأمينية والكربوكسيل الطرفية، مثل تلك الموجودة في البروتينات GPI رأسية، أو إذا كان يحتوي على ببتيد إشارة الأمينية الطرفية الانصهار الأمينية الطرفية غير قابلة للاستخدام بعد، العلامة ينبغي أن توضع داخليا، ( أما المصب إشارة الأمينية الطرفية أو المنبع إشارة الكربوكسيل الطرفية). وصف بعض إجراءات مفيدة لوضع علامات مضيئة الداخلية من البروتينات لدينا47،المنشورات السابقة48.

وفي الوقت الحاضر، هناك لا تسلسل الآراء المعروفة الثابتة والمتنقلة. على هذا النحو (في الخطوة 5، 2) نوصي، في البداية تقسيم البروتين في مجاورة ~شظايا بقايا طوله 100-200. يمكن ثم يتم إجراء هذه أقصر تدريجيا استناداً إلى النشاط استهداف Pd ملاحظتها أو عدمه. يجب أن يكون أحد إدراكا منها لإمكانات أخرى تستهدف إشارات موجودة في البروتين (مثلاً، NLS، الببتيدات إشارة، إلخ). ومع ذلك، كمسألة التداخل المحتمل بين هذه التسلسلات مع تسلسل الثابتة والمتنقلة غير معروف، ينبغي إدراج هذه المناطق البروتين في هذا التحليل حيث.

حتى الآن، تم استخدام هذا البروتوكول للتعرف واحد الثابتة والمتنقلة في جزيء بروتين21. يحتمل أن تكون، مع ذلك، بروتين يمكن أن تحتوي تسلسل إشارة أكثر من واحد؛ وقد وصف الواقع نلس متعددة في العديد من البروتينات النووية، بما في ذلك عوامل النسخ غاتا49. وهكذا، عند تحليل الأجزاء المختلفة من البروتين تم اختبارها لاستهداف Pd، فمن الممكن أن يتم تحديد واحد أو أكثر مثل هذه الشظايا، مما يشير إلى وجود PLSs المتعددة التي يمكن أن تعمل بشكل مستقل أو تآزر.

القيد الرئيسي من هذا البروتوكول أنه، بعد أجروينفيلتريشن، التصور لتوطين سوبسيلولار عابر البروتينات أعرب عن اهتمام يتحقق على أفضل وجه في خلايا البشرة ومرحلة النمو ضيقة نسبيا. عند الضرورة، يمكن التغلب على هذا القيد بإنتاج النباتات المعدلة وراثيا ستابلي تعبر عن كل من البروتينات تم اختبارها في معظم أنواع الخلايا والأنسجة. أيضا، هذا البروتوكول غير المفيد للدراسات الفيروسية أعضاء البرلمان أو غيرها من البروتينات Pd المستهدفة التي تعمل فقط في أنواع النباتات التي ليست قابلة للتحول الوراثي عابرة.

بينما قمنا بتطوير هذه التقنية للتعرف الثابتة والمتنقلة "النائب تمف"، يمكن استخدامه لاكتشاف PLSs في أي مصنع النواب الفيروسي أو في مصنع البروتينات الذاتية التي ترجمة إلى Pd، عابر أو بشكل دائم. وعلاوة على ذلك، إذا اقترن ب علامات مناسبة التعريب سوبسيلولار47، هذا البروتوكول مناسبة للتعرف على العديد من إشارات أخرى تستهدف ضمن البروتينات للاهتمام بالنباتات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

لعدم وجود مساحة، استشهدنا الغالب استعراض المواد، ونعتذر لزملائنا واستشهد بعدم عملها الأصلي. العمل في مختبر لالح معتمد من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وجبهة الخلاص الوطني، ووزارة الزراعة/NIFA، بارد، وقوات حرس الحدود إلى الخامس، ومختبر S.G.L. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة والأموال من أقسام أمراض النبات والأحياء النباتية-ميكروب S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics