זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.

Introduction

הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינטימית עם הרצפים ספציפי שמכוון את החלבונים מועבר לתוך המסלולים הללו. לפיכך, זיהוי אותות לוקליזציה אלה Pd (PLSs) ייתכן אבחון של מסלול התחבורה Pd המתאימים. זאת על ידי השוואה של משטרת התעבורה8, לדוגמה, מסלולים שונים ייבוא גרעינית, אשר יכול להיות ספציפיות עבור שונה לוקליזציה גרעיני אות (שקל) רצפים9,10. מבחינה מושגית, הן NLSs והן PLSs מייצגים רצפים מיקוד subcellular-cleavable הכרחי ובלתי מספיק עבור מיקוד. אולם, בניגוד NLSs11, המידע רצף על PLSs היא מוגבלות מאוד. באופן ספציפי, רק ארבעה רצפים חלבון מעורב Pd מיקוד דווחו, עם כולן נגזר פרוטאינים צמחיים אנדוגני. הראשון מיוצג על ידי תחום גנים homeobox של KN112 – גורם שעתוק שזז משכבות התא הפנימי כדי אפידרמיס של עלה צמח13 – ו שלו homologs נוקס14. . השני גם הוא מפקטור שעתוק, Dof, אשר מכיל PLS בשם תיאר את הסחר המערכת (IT) מוטיב15. הרצף השלישי של החלבון ממברנה PDLP1 plasmodesmata תושב סוג 1, הוא מיוצג על ידי תחום transmembrane16. לבסוף, המשטרה הרביעי מיקוד רצף דווח לאחרונה על glycosylphosphatidylinositol (GPI)-חלבונים מעוגן וזה מיוצג על ידי האות השינוי17glycosylphosphatidylinositol (GPI).

מעניין, עד ממש לאחרונה, דווחו PLSs אין עבור MPs ויראלי. מחקרים קודמים מצביעות על הימצאות בשם רצפים PLS צמח-18,MPs-ויראלי-19, אך אין PLS אמיתי, דהיינו, רצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי והן מספיקות עבור משטרת פילוח של (מולקולה מטענים לא קשורים למשל., CFP) זוהתה ב MP נגיפי. עוד אחד החלבונים האלה, MP של נגיף פסיפס הטבק (TMV), היה הראשון אשר Pd לוקליזציה ותעבורה כבר הפגינו20.

כדי לטפל פער זה, פיתחנו אסטרטגיית ניסיוני לזהות TMV MP PLS. אסטרטגיה זו התבססה על שלושה מושגים. (i) אנחנו מוגדרים PLS כרצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי ולא מספיק חלבון המיקוד Pd21. (ii) כי TMV MP תחילה מטרות Pd, ואז translocates דרך ערוצים אלה22, אנחנו מכוונים uncoupling שתי פעילויות וזיהוי ביסקוויטים בתום לב, אשר מתפקד רק עבור משטרת מיקוד, ולא על הטרנספורט עוקבות. (iii). ניתחנו ביסקוויטים מזוהה עבור שאריות חומצה אמינית חשובה עבור שלה Pd מיקוד פעילות, בין אם מבחינה מבנית או פונקציונלית. באמצעות גישה זו, מאפשרת לנו רצף שאריות חומצה אמינו 50 התחנה הסופית-אמינו של MP TMV שפועל PLS בתום-לב. זה נעשה על ידי הפקת סדרת שברי TMV MP כי רווי לכל אורכה של החלבון, תיוג שלהם carboxyl-termini עם CFP transiently לבטא אותם ברקמות הצמח. משטרת לוקליזציה של כל אחד מהשברים שנבדקו נקבע על-ידי coexpressing אותם עם משטרת סמן חלבון, PDCB1 (משטרת callose מחייב חלבון 1)23. השבר הקטן עדיין מקומי לתחנת משטרה, אך לא לחצות Pd, נחשב לייצוג PLS. לבסוף, ביסקוויטים היה אלנין-סריקה כדי לקבוע את שאריות מפתח חומצת אמינו הדרושות עבור מבנה ו/או הפונקציה שלה.

ואילו כאן אנחנו להמחיש את גישה זו על-ידי תיאור זיהוי של MP TMV PLS, זה עשוי להיות מועסק לגלות PLSs בחלבונים כל אחרים, ממוקדות Pd, אם מקודד על ידי פתוגנים צמח או את הצמחים עצמם; זה בגלל השיטה שלנו לא לנצל את כל תכונות ייחודיות של MPs ויראלי לגבי יכולתם היעד לתחנת משטרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חומר צמחי

  1. הבחירה של מיני צמחים
  2. השתמש המין צמח ילידי החלבון של עניין, דהיינו, אחד אשר מקודד חלבון זה חלבונים אנדוגני, או המייצג המארחת הטבעי של המחלה חלבונים נגיפיים. בנוסף, המין הצמח הנבחר חייב להיות נוטה? בשיטה של שינוי גנטי ארעית.
    הערה: המחקרים באופן שגרתי להעסיק טבק benthamiana, אשר מייצג מארח טוב עבור TMV, עובר טרנספורמציה ביעילות על ידי טכניקת בתיווך Agrobacterium שינוי גנטי, קרי, agroinfiltration (ראה שלב 3). צמחים benthamiana (ש ע) גם הם מגדלים בקלות, יש עלים גדולים, מחוסן בקלות על-ידי Agrobacterium ומותאמים בקלות נותחו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
  3. צימוח
    1. צמח benthamiana (ש ע) זרעים באדמה רטובה-צפיפות גבוהה. לשמור אותם בתוך תא בסביבה מבוקרת הלעפה תרוטרפמט 20-25 מתחת לגיל 16 h של אור ~ 75 µmol פוטונים ז-2 s-1 ו- 8 שעות החושך. לאחר הקוטר של euphyll מגיע ל- 0.5 ס מ, בזהירות להעביר את השתילים סירים גדולים והמשך הצמיחה בבית הבליעה אותה תחת באותם התנאים.
    2. לשמור על הצמחים עד שהם גדלים לשלב 4-8-עלה תוך 4 שבועות כאשר העלים הגדולים הם 4-6 ס מ קוטר; בשלב זה, הם יכולים לשמש עבור agroinfiltration (ראה שלב 3).
      הערה: חשוב, אף פעם לא השתמש הצמחים אם הם החלו פרח, כי בשלב התפתחותי זה, הארכיטקטורה עלה משתנה לעיתים קרובות24,25, שמוביל לפעמים תוצאות לא עקביות.

2. הביטוי וקטור בנייה

  1. בחירה של מערכת ביטוי
    1. לבחור את הביטוי מערכת, קרי, וקטורים ו וקטור משלוח השיטה, המיטביות עבור ביטוי של החלבון עניין במין הצמח למד.
      הערה: לעיתים, כזה שילובים מסוימים של מיני נבדק חלבון/צמחים עשויים לדרוש וקטורים ספציפיים, וקטור שיטת מסירה עבור הביטוי מיטביים ותפקוד של החלבון עניין. לצמחים dicotyledonous ביותר, עם זאת, בחר פלסמידים בינאריים כמו הביטוי וקטורים ו agroinfiltration כמערכת משלוח.
  2. תיוג פלורסנט חלבון
    1. Fluorescently לתייג כל חלבון ביטוי לניתוח של הפצה subcellular22, לרבות משטרת לוקליזציה.
      הערה: מעסיקים חלבונים autofluorescent, כגון CFP ו- DsRed2, כמו תגיות. תג החלבון שנבדקו עם CFP, coexpress זה עם DsRed2 חינם. פונקציות CFP כתג והן בתור מולקולה לא קשור וירוס מטענים. DsRed2 פונקציות כדי לכייל את היעילות הכוללת של הביטוי ארעי, ובגלל זה תא-אוטונומי, כדי לזהות את התא טרנספורמציה בתחילה; פונקציה זו האחרון חשוב בעת הערכת תנועה לתא של חלבונים שנבדקו שעשויות להיות הלא-תא-אוטונומי. עבור coexpression עם הסמן משטרת PDCB1, אשר גם הוא התא-אוטונומי, לתייג את החלבון שנבדקו עם CFP, PDCB1 עם DsRed2.
    2. כלל אצבע, הפתיל תג autofluorescent carboxyl-הסופית של החלבון ביטוי. עם זאת, אם המוצגים מתויג באורך מלא חלבונים נבדק נחשף Pd מיקוד, העברת התג אמינו-הסופית של החלבון.
    3. לשכפל את רצפי קידוד של החלבונים להיבדק לתוך וקטור הביטוי צמח מתאים.
      הערה: ישנם רבים וקטורים הביטוי צמח שונות המאפשרות תיוג פלורסנט. אנו משתמשים סדרה של קדם-פסיכומטרי פלסמידים26 או חלק שלהם נגזרים27,28, אשר מתאימים עבור שכפול של הרצף של עניין ישירות מסגרת עם התגים autofluorescent המוצע (ראה שלב 2.2.1) בשני אמינו- ו carboxyl-מסוף כיוונים.
    4. להעביר קלטת ביטוי לכל וקטור Agrobacterium בינארי.
      הערה: למרות בונה מבוסס-קדם-פסיכומטרי מתאימים למשלוח biolistic ישירה לרקמות הצמח, agroinfiltration, אשר היא השיטה השינוי המומלץ כאן (ראה שלב 3), מחייב הקלטת ביטוי כדי להיות ממוקם בין T-DNA גבולותיה של קובץ בינארי וקטור29.
      הערה: כל כיווני קדם-פסיכומטרי נועדו לאפשר העברת כזו26,30 וקטור בינארי ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים pPZP-RCS2 על-ידי צעד אחר צעד שיבוט באמצעות חיתוך נדיר nucleases AscI-PpoI, -SceI,. CeuI, פאי-PspI ו- PI-TliI 26. חוקרים שמעדיפים לנצל שיבוט recombinatorial, למשל, באמצעות אתרי heterologous לקס 31, יכול להעסיק קדם-פסיכומטרי וקטור משתנים26,27.
    5. עבור coexpression, העברת קלטות ביטוי הן, למשל, נבדק חלבון-CFP, DsRed2 או חלבון שנבדקו-CFP, PDCB1-DsRed2 (ראה צעד 2.1), כדי הווקטור בינארי זהה pPZP-RCS2.
      הערה: לחלופין, תרבויות Agrobacterium מחסה מבנים בינאריים בודדים ניתן לערבב ביחד חדירה לתוך benthamiana ש (ראה צעד 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. להוסיף 1 µg של פלסמיד pPZP-RCS2 מבוססי מתרבות 2.2.5 ל- 100 µL שלב של תאים המוסמכים של זן Agrobacterium tumefaciens EHA105 או GV3101 מוכנים כמו שמתואר32, דגירה על קרח למשך 30 דקות, הקפאה של חנקן נוזלי עבור 1 דקות, ואני דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    1. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מדיום ליברות (טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L ו- 10 גרם/L NaCl) לתערובת תא המוסמכת, דגירה ב 28 ° C עבור 2 ה ספין למטה התאים ב g × 3,000 עבור 1 דקות, מחדש להשעות אותם ב- 0.2 מ ל LB , לוח אותם על אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה המתאים (למשל, spectinomycin 100 מ ג/ליטר ו- 50 מ"ג/ליטר ריפאמפיצין ל26,pPZP-RSC2 מבוססי וקטורים30). לגדול-28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות עד מושבות בודדות גלויים.
  2. לאסוף ואת לוחית רישוי מספר מושבות בודדות על צלחת אגר טריים ליברות (ראה צעד 3.1), לגדול ב 28 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ולא לקחת כמות קטנה של חיידקים לניתוח על ידי המושבה PCR33 לאשר הנוכחות של המבנה בינארי ספציפי.
  3. לגדול כל המושבה Agrobacterium עם הבונה עניין בן לילה ב 28 ° C ב- 5 מ ל LB בינוני בתוספת אנטיביוטיקה המתאימים (ראה שלב 3.1.1). Centrifuge התאים ב 3,000 × g, וכן מחדש להשעות אותם כדי OD600= 0.5 במאגר agroinfiltration (10 מ"מ MgCl2, 10 מ מ MES (pH 5.6), 150 acetosyringone מיקרומטר). תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר.
    1. אם משתמש תערובת של פלסמידים בינאריים ולא של פלסמיד ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים יחיד עבור חלבון coexpression, מערבבים את תרביות תאים המתאימים ביחס 1:1 v/v לפני חדירה. ואז דגירה התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
  4. טען את inoculum לתוך מזרק פלסטיק 1 מ"ל ואת העיתונות שהצינור של המזרק (ללא מחט) נגד האפידרמיס (abaxial) נמוך של בוגרים לגמרי benthamiana ש עלים. חכה העלה עם אצבע בכפפה34,פניה adaxial35.
    1. מציגים את Agrobacterium חדירה בינוני על ידי הזרקה איטית. מובהקות סטטיסטית, לחדור מספר עלים על כל צמח.
      הערה: שימו לב כי העלים העתיקים משמשים לא כפי שהם לא תשואה רמות הביטוי עקבית.
    2. לחסן כל העלים בתוך באתרו. לשמור על המפעל הסתנן עד תצפית כפי שמתואר בשלב 1.2.

4. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. השימוש להב לחתוך כל עלה לחלקים בין הורידים 24-48 שעות לאחר החדירה, (תלוי היעילות של הביטוי ארעית של החלבון נבדק ספציפי); הגודל של כל פרוסה רקמות צריך להיות כזה כי הפרוסה מכוסה לגמרי על ידי הזכוכית המכסה (22 מ"מ x 40 מ"מ) המשמש מיקרוסקופ.
  2. המקום הפרוסות עלה על האובייקט שקופית עם פני העלים abaxial פונה כלפי מעלה, הניחו טיפת מים על הפרוסה עלה, לכסות את זה עם כיסוי זכוכית. לשתק את הזכוכית המכסה עם חתיכות קטנות של נייר דבק בכל צד.
  3. להתבונן הרקמות agroinfiltrated תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר ולהקליט את התמונות המתקבלות.
    1. תחילה, השתמש בעדשה המטרה X 10 כדי לזהות תאים עם האות, ולאחר מכן להשתמש 63 x עדשה המטרה עבור תצפיות מפורט יותר.
    2. שימוש 458 גל nm מ יון ללייזר לגרות CFP, 543 nm כדי לעורר DsRed2. שומרים על כל הגדרות עבור ייבוא תמונות, קרי, לייזר בעוצמה והגדרות האופטיקה צינור (PMT), בין ניסויים. בממוצע, בדוק 100-120 תאים עבור כל תנאי הניסוי.

5. זיהוי של PLS

  1. לאבחן הלוקליזציה של החלבון נבדק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (סעיף 4). בדוק אם החלבון שנבדקו יש את תבנית punctate היקפי אופיינית25,36,37,38,39,40,41 colocalizes עם הסמן משטרת PDCB123. אפשרות זו מציינת כי החלבון שנבדקו מכילים קרוב לוודאי רצפי PLS.
  2. לאחר אישור לפעילות PLS נבדק חלבון, בהדרגה לסעף את מסגרת קריאה פתוחה (ORF) (מספר גישה genbank BAF93925.1) שברים קטנים יותר, autofluorescently, (למשל, CFP,) לתייג כל אחד מהם, ולנתח שלהם לוקליזציה subcellular כפי שמתואר בשלב 4. בתחילה, בגודל של 100 שאריות חומצה אמינית עבור כל שבר המתפרשות מומלץ.
  3. בהמשך לסעף השברים קטום אשר הפעילות PLS לבדוק לוקליזציה subcellular שלהם כפי שמתואר בשלב 4 עד השבר הקטן ביותר זה עדיין רגישה לתחנת משטרה, כלומר מספיקה להעביר את המטען תג autofluorescent לתחנת משטרה, מזוהה. קטע זה יש להניח לייצג את רצף PLS.
  4. מחיקת ביסקוויטים בשם החלבון שנבדקו באורך מלא, קרי נתיך את החלק הנותר של החלבון מבחן ללא PLS בשם autofluorescent תג, לקבוע לוקליזציה subcellular של החלבון המוטנטי וכתוצאה מכך כפי שמתואר בשלב 4. אם זו מוטציה בחלבון חסר ביסקוויטים בשם נכשל להתאים לשפה לתחנת משטרה, יציין כי מזוהה PLS אינה רק מספיק (ראה צעד 5.3), אבל גם הכרחי עבור הובלה Pd של החלבון שנבדקו.
  5. Agroinfiltrate העלים עם תערובת של תרבויות Agrobacterium מסתירים את הביטוי לבנות עבור PLS מתויג CFP ו DsRed2 חינם (ראה צעד 3.3). להתבונן הסתנן רקמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה המטרה של 10 x באמצעות אותן הגדרות כמו שלב 4.3.
  6. ציון התאים מכילים אותות CFP והן DsRed2 כתאי הסתנן בתחילה, ולא את נספח תנועה ניקוד התאים הסמוכים שהכיל רק האות CFP כמו אלה.
    הערה: שלב זה בוחן ביסקוויטים מזוהה בשל יכולתו-לתא התנועה פוטנציאליים; זה בגלל חלבונים רבים המטרה Pd (כולל רוב לשתול MPs ויראלי) גם לעבור Pd לתאים שכנים. הריכוז של Agrobacterium המשמש עבור הסתננות תלוי היעילות ביטוי של מבנים שונים בהתאמה. עבור agroinfiltration, הקפד להשתמש דילול תרבות תא מבטיח (i) טרנספורמציה של תאים בודדים, עוזב את התאים הסמוכים untransformed, (ii) משיגה יעילות דומה לביטוי. לדוגמה, הניסויים שלנו לנצל OD600 של 0.01 ו 0.005 עבור ביטוי מתויג CFP PLS חופשי DsRed2, בהתאמה.

6. זיהוי של מפתח PLS שאריות באמצעות סריקה אלנין42

  1. השתמש פרוטוקולים סטנדרטיים PCR כדי להגביר ביסקוויטים קידוד רצף העסקת זוג תחל עוצבו כך שיכילו את המוטציה הרצוי, קרי, החלפה של השאריות חומצת אמינו היעד עם אלנין, סביב האזור המרכזי של כל פריימר כמתואר 21. לבצע פריימר עיצוב, ערכת מוטגנזה לשימוש מוטגנזה בהתאם להוראות היצרן.
  2. לטהר את המוצרים PCR הנוצרת באמצעות כל ערכת טיהור DNA סטנדרטי, ולעכל אותם ב 37 ° C עם DpnI לחסל את ההורים (כלומר, ללא-מוטציה) מפוגל ו hemimethylated ה-DNA. יירגעו זה 5 דקות בטמפרטורת החדר (לא על הקרח). ואז להפוך את התערובת ישירות לתוך תאים המוסמכת e. coli 43וזהה מושבות עם מוטציה המבנה הרצוי כפי שמתואר בשלב 3.2.
  3. להציג את בונה מוטציה לתוך הווקטור בינארי כפי שמתואר בשלב 2.2.4 לבצע agroinfiltration כפי שמתואר בשלב 3, להעריך Pd מיקוד כפי שמתואר ב 4 שלבים ו- 5.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתונים נציג, בנאמנות להמחיש את התוצאות צפוי מן הפרוטוקולים שתואר ולזהות את TMV MP PLS, המותאמים מ יואן. et al. 21. איור 1A מסכם ראשון המבנים העיקריים לבטא את באורך מלא TMV MP (1-268), TMV MP PLS (הכוללת את שאריות חומצה אמינית קודם 50 של החלבון, 1-50), ו שלה אלנין סריקה V4A נגזרים דבוקה CFP (נוצר כמו שמתואר 2.2 השלבים, 5.2 ו- 6) ואילו איור 1B והשוואה מכמתת לוקליזציה subcellular של חלבונים אלה מתויגות. איור 1C מתארת אופייני היקפיים punctate Pd לוקליזציה הדפוסים שנצפו עבור TMV MP-CFP, עבור TMV MP PLS-CFP גם באשר דה מרקר משטרת coexpressed, PDCB1-DsRed2 (ראה צעד 5.1). איור 2A מדגים Pd פילוח של TMV MP-CFP ועבור TMV MP PLS-CFP והפצה nucleocytoplasmic של coexpressed DeRed2 חינם (ראה צעד 5.1). לבסוף, איור 2B מדגים האובדן של משטרת מיקוד על ידי TMV MP והן TMV MP PLS עם החלפה יחיד אלנין V4A, המציין כי שאריות זה חשוב עבור מבנה PLS או פונקציה; אותו דבר תאים דה מרקר משטרת coexpressed PDCB1. עדיין רגישה לתחנת משטרה (ראה שלב 6).

נתונים אלה מראים כי הליך מושגית, טכנית פשוטה של ייצור שיטתית של שברי חלבון שלהם פיוז'ן לחלבון סמן-מטען autofluorescent, בדיקות על היכולת להתאים לשפה לתחנת משטרה יכול לזהות רצף מינימלי חלבון חיוני ומספיק עבור משטרת מיקוד, קרי, PLS. על פרשנות נכונה של נתונים אלה לוקליזציה, חיוני לבצע ניסויים colocalization עם חלבון Pd ידוע, למשל, PDLP או PDCB בני המשפחה16,23 או אחד של הצמח MPs ויראלי דברים לתחנה44 . ללא ספק, colocalization לא קיימת למען השלמות, לא כל החלבונים P-לוקליזציה עשויות להיות ממוקדות כדי המשטרה אותו, אך מידה סטטיסטית של colocalization לפחות אחד החלבונים סמן Pd הכרחית להגדרת הפעילות PLS.

Figure 1
איור 1: זיהוי של TMV MP מסילות בשימוש, קניינים (א) סיכום של בונה CFP-fusion העיקרי המשמש לזיהוי תיבות רצפים, ירוק TMV MP מסילות בשימוש, קניינים TMV MP; CFP, הקופסאות הכחולות; P, יזם; T, שליחות קטלנית. המספרים בצד השמאל מציינים את שאריות חומצה אמינית כלולים כל שבר TMV MP. (B) סיכום של לוקליזציה subcellular של חלבונים פיוז'ן המוצגים ב (א). משטרת לוקליזציה או nucleocytoplasmic לוקליזציה נקבע בהתבסס על הלוקליזציה של הסמנים subcellular המתאימים, PDCB1-DsRed2 ו- DsRed2 חינם, בהתאמה. אחוז תאים מפגין לכל דפוס לוקליזציה מוצג בהתאם הבקיע 100 תאי לביטוי הבונה בשנת 3 ניסויים עצמאית. הנתונים הם לשגיאות תקן זאת אומרת ± (SE). (ג) Pd פילוח של TMV MP-CFP TMV MP PLS-CFP, דה מרקר משטרת PDCB1-DsRed2. CFP שהאותות בכחול; DsRed2 שהאותות בסגול; פלסטידה autofluorescence היה מסונן. התמונות הן מקטעים קונאפוקלית יחיד. גודל ברים = 10 מיקרומטר. DIC, התערבות דיפרנציאלית חדות micrograph. נתון זה ממאמרו של יואן. et al. 21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Pd פילוח של TMV MP, TMV MP PLS שלהם מוטציות לסריקת אלנין- (א) Subcellular לוקליזציה של TMV MP-CFP TMV MP PLS-CFP, דה מרקר nucleocytoplasmic DsRed2. (B) אובדן של משטרת מיקוד היכולת של המוטציות לסריקת אלנין V4A TMV MP-CFP, TMV MP PLS-CFP.... משטרת היו דמיינו ידי coexpression של דה מרקר משטרת PDCB1-DsRed2. CFP שהאותות בכחול; DsRed2 שהאותות בסגול; פלסטידה autofluorescence היה מסונן. התמונות הן מקטעים קונאפוקלית יחיד. גודל ברים = 10 מיקרומטר. DIC, התערבות דיפרנציאלית חדות micrograph. נתון זה ממאמרו של יואן. et al. 21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ארעית של החלבונים פיוז'ן שנבדקו. שימו לב כי הביטוי ארעי בתיווך Agrobacterium יוצר נתונים בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן, קרי, מספר ימים, לעומת הנדרש לייצור של הצמחים הטרנסגניים משמש לעתים קרובות מחקרים דומים15חודשים.

Coexpression של החלבון עניין עם סמנים לוקליזציה subcellular, למשל, PDCB1 או DsRed2 חינם, בדרך כלל מבוצעת בין וקטור ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים. אולם, אם העברת קלטות ביטוי מספר לתוך וקטור יחידה הוא בעייתי מבחינה טכנית, coexpression יכול גם להתבצע על ידי העברת כל קלטת לתוך מבנה בינארי נפרד ושילוב כרכים המקבילה של תרבויות נוזלי זני Agrobacterium שנוצר עבור agroinfiltration. כי פרוטוקול זה מנצל ביטוי ארעי, הווקטור בינארי צריך נושא הבחירה סמני לטרנספורמציה יציב, למרות נוכחותם אינה פוגעת היעילות הביטוי.

פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור ביטוי חלבון המטרה ב- benthamiana (ש ע); עם זאת, זה יכול לשמש מינים אחרים של הצמח, כולל תודרנית45,46, לבצע שינוי גנטי על ידי Agrobacterium. עבור מינים אחרים של הצמח, או אחרת, אם פרוטוקול זה ניתן להתאים לנצל את משלוח biolistic41 לביטוי ארעי ישירות מוקטורים מבוסס-קדם-פסיכומטרי, ולהימנע מהצורך להעביר הקלטות ביטוי וקטורים בינארי.

איזה נקודה קריטית של פרוטוקול זה הוא מצב פיזיולוגי והפיתוחים עקבית של חומר צמחי. באופן ספציפי, כל הצמחים להיות בריאים לאורך הניסוי כולו, ועל, עבור agroinfiltration, הצמחים benthamiana (ש ע) חייב להיות פחות מ- 4-שבועות וישן בשלב 4-8-עלה עם העלה הגדול להיות 4-6 ס מ קוטר. אם הצמחים הם צעירים מדי, ההשפעות של agroinfiltration יהיה חמור מדי, מתנגש עם ביטוי ולוקליזציה של החלבונים מתויגות. מצד שני, הצמחים בוגרים לעיתים קרובות התערוכה ארכיטקטורה משתנה של משטרת24,25, גם להשפיע על מרקם של דפוסי פילוח Pd.

עדיין, עקב שינוי בתנאים פיזיולוגיים של הצמח בכללותו, ואת התאים טרנספורמציה בפרט, היעילות של משטרת מיקוד ניסוי עשוי במידת מה להשתנות. לכן חשוב לנתח מספר גדול יחסית של תאים (> 100) לכל ניסוי, ולבצע לפחות שלושה משכפל הביולוגי של כל ניסוי. בדרך כלל, אנו רואים קטע שנבדקו יכיל Pd מיקוד פעילות, אם זה מוצגים Pd לוקליזציה לפחות 70% של תאים טרנספורמציה. הבדלי פילוח היעילות של כל קטע, למשל, אחוז תאי טרנספורמציה מציג, התבנית הצטברות punctate ספציפיים Pd Pd צריך להיות מנותח על ידי הסטודנט מבחן t, p-ערכים < 0.05-0.01, המייצגים הסתברות סטטיסטית של יותר מ 95-99%.

נושא חשוב נוסף הוא המיקום של המטען/התגית פלורסנט בתוך המולקולה פיוז'ן. כמה חלבונים, ממוקדות Pd גם לשייך תוך-פלזמית (ER), עמותה זו עשוי לדרוש את רצף אמינו-מסוף בלא הפרעה. במקרים אלה, אמינו-מסוף fusions, שבו הוא carboxyl-הסופית של השבר חלבון עניין דבוקה אמינו-הסופית של התג פלורסנט, למשל, CFP או DsRed2, אמור לשמש. ניתן לשנות את מיקום ברירת המחדל של התג במקרים הבאים. (i) אם fusions אמינו-מסוף אינם שמישים – כלומר, הם אינם מפגינים דפוסי לוקליזציה subcellular משמעותית, באים לידי ביטוי לקוי או אינם מפיקים מספיק עבור זיהוי אמין – ניאון האות ואם החלבון עניין אינה מכיל רצפים אמינו-מסוף האות או carboxyl-מסוף fusions שבו אמינו-הסופית של השבר שנבדקו היא דבוקה carboxyl-הסופית של התג, הם שכדאי לנסות. (ii) fusions carboxyl-מסוף צריך לשמש גם אם החלבון עניין מכילים רצפי אות ב carboxyl-לתחנתו הסופית. (iii) אם החלבון של עניין יש שני אותות אמינו - ו carboxyl-מסוף, כגון אלה שנמצאו המעוגנת GPI חלבונים, או אם הוא מכיל של פפטיד אמינו-מסוף האות עדיין מיזוגה אמינו-מסוף אינו שמיש, התג יוצבו באופן פנימי ( או במורד הזרם של האות אמינו-מסוף במעלה הזרם של האות carboxyl-terminal). כמה הליכים שימושי עבור תיוג פלורסנט פנימי של חלבונים מתוארים שלנו47,מוקדמת יותר פרסומים48.

בזמן הנוכחי, יש אין רצף קונצנזוס ידוע עבור PLS. בתור שכזה (בשלב 5.2) אנו ממליצים, בתחילה סוגייה משפטית החלבון לתוך רציף ~שברי שאריות באורך 100-200. אלה מכן שניתן יהיה בהדרגה קצר יותר בהתבסס על הפעילות פילוח Pd שנצפו או החוסר בו. אחד צריך להיות מודע אחרים פוטנציאל מיקוד אותות נוכח החלבון (למשל, NLS, אות פפטידים, וכו '). עם זאת, כמו החפיפה פוטנציאלי של רצפים כאלה עם רצפי PLS אינו ידוע, אזורי חלבונים אלה ייכללו בניתוח mutational.

עד כה, פרוטוקול זה שימש לזיהוי PLS יחיד מולקולה חלבון21. עם זאת, באופן פוטנציאלי, חלבון יכול להכיל רצף אות אחד או יותר; אכן מרובים NLSs תוארו בחלבונים גרעיני רבים, לרבות גורמי שעתוק גאטה49. לפיכך, בעת ניתוח שברים שונים של החלבון שנבדקו עבור משטרת מיקוד, זה אפשרי כי אחד או יותר קטע כזה יזוהו, המעידים על המצאות של מספר PLSs אשר עשויים לפעול באופן עצמאי או בסינרגיה.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא כי בעקבות agroinfiltration, ויזואליזציה של לוקליזציה subcellular של transiently חלבונים ביטוי של עניין היא מושגת בצורה הטובה ביותר תאים באפידרמיס, בשלב הצמיחה צר יחסית. בעת הצורך, מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי ייצור הטרנסגניים צמחים המבטאים כל אחד החלבונים נבדק ברוב הרקמות שלהם ואת סוגי תאים stably. בנוסף, פרוטוקול זה לא יהיה שימושי עבור מחקרים של MPs ויראלי או חלבונים אחרים ממוקדות Pd לתפקד רק במינים צמחים לא נתונות לשינוי גנטי ארעית.

בעוד אנחנו פיתחנו שיטה זו זיהוי PLS של TMV MP, זה יכול לשמש עבור גילוי PLSs בכל מקום לשתול MPs ויראלי או בחלבונים אנדוגני צמח זה בתרגום כדי Pd, transiently או לצמיתות. יתר על כן, אם בשילוב עם סמנים המתאים לוקליזציה subcellular47, פרוטוקול זה מתאים זיהוי של אחרים לאותות מיקוד בתוך חלבונים עניין בצמחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics