Выявление Plasmodesmal локализации последовательностей белков в Planta

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Завод межклеточных соединений, plasmodesmata (Pd), играют центральную роль в заводе физиологии и завод вирус взаимодействий. Важнейшее значение для Pd транспорта производится сортировка сигналы, которые направляют белки для Pd. Однако, наши знания об этих последовательностей все еще находится в зачаточном состоянии. Мы описываем стратегию для выявления локализации сигналы Pd Pd целевых белков.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) являются соединения к ячейке, которые функционируют как шлюзы, через которые перевозятся мелких и крупных молекул между растительных клеток. Pd транспорта малых молекул, ионов и воды, предположительно происходит пассивно, в то время как к ячейке транспорт биологических макромолекул, такие белки, наиболее вероятно происходит через активный механизм, который включает в себя конкретные определения сигналов на перевозимых молекулы. Нехватка выявленных plasmodesmata (Pd) локализация сигналов (PLSs) строго ограниченных понимание белка сортировка пути, участвующие в завод в ячейке макромолекулярных транспорта и связи. С обилием растений эндогенного и вирусные белки, известный трафик через Pd, только три PLSs поступили на сегодняшний день, все из них от эндогенных растительных белков. Таким образом, она имеет важное значение для разработки надежных и систематических экспериментальной стратегии для выявления функциональных PLS последовательности, что является необходимым и достаточным для Pd ориентации, непосредственно в живых растительных клеток. Здесь мы описываем одной такой стратегии, используя в качестве парадигмы к ячейке движение белка (МП) вирус мозаики табака (ПДЦ). Эти эксперименты, которые выявлены и охарактеризованы первый завод вирусный PLS, могут быть приспособлены для обнаружения последовательностей PLS в наиболее Pd целевых белков.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) функционировать в качестве каналов для межклеточных транспорта ключевых регуляторов развития растений и морфогенеза, начиная от факторов транскрипции мРНК и малых молекул РНК. Кроме того этот макромолекулярных транспортного потенциала Pd используется большинство вирусов растений для их межклеточных распространения во время инфекции; для перемещения по Pd, вирусов растений развивались специализированные белки, называются движения белки (MPs), которые специально направлены Pd1,,2,3,4,5,,6 , 7. молекулярные пути переноса Pd скорее тесно взаимосвязана с специфических последовательностей, которые предназначены перевозимые белков в эти пути. Таким образом идентификация этих сигналов локализации Pd (PLSs) может быть диагностических соответствующего пути транспорта Pd. Это по аналогии Pd транспорта8, например, различных ядерных импорт путей, которые могут быть специфическими для различных ядерной локализации сигнала (NLS) последовательности9,10. Концептуально ОУЖН и PLSs представления не горные субцеллюлярные таргетинга последовательностей, которые являются необходимыми и достаточными для ориентации. Однако в отличие от ОУЖН11, последовательностью информацию о PLSs крайне ограничена. В частности были зарегистрированы только четыре белковых последовательностей, участвующих в Pd ориентации, со всеми из них производные от эндогенных растительных белков. Первый из них представляет гомеобокс домен KN112 – транскрипционный фактор, который перемещается из внутренней ячейки слоев эпидермиса листа растений13 – и его Нокс гомолог14. Второй тоже от транскрипционный фактор, глубина резкости, который содержит предполагаемый PLS, описывается как межклеточных людьми, (она) мотив15. Третьего последовательности от PDLP1 plasmodesmata резидентов типа 1 Мембранный белок, и оно представлено трансмембранных доменов16. Наконец, четвертый Pd, ориентация последовательность недавно сообщалось за glycosylphosphatidylinositol (GPI)-якорь белков и он представлен сигнала модификации glycosylphosphatidylinositol (GPI)17.

Интересно, что до совсем недавнего времени, были зарегистрированы не PLSs для вирусных депутатов. Предыдущие исследования показали наличие предполагаемого PLS последовательностей в завод вирусных м/с18,19, но не верно PLS, т.е., минимальный аминокислотная последовательность необходимых и достаточных для Pd ориентации молекулы (не связанных грузовые например., CFP) была обнаружена в Вирусный MP. Еще один из этих белков, депутат вирус мозаики табака (ПДЦ), был первым, для которых Pd локализации и транспорта были показали20.

Чтобы устранить этот разрыв, мы разработали экспериментальный стратегию для выявления TMV MP PLS. Эта стратегия основана на трех концепций. (i) мы определили PLS как минимальный аминокислотной последовательности, которая является необходимым и достаточным для белка ориентации Pd21. (ii) потому что TMV MP впервые предназначено Pd и затем translocates через эти каналы22, мы нацелены на расцеплять эти два вида деятельности и выявления добросовестных PLS, который работает только для Pd ориентации и не для последующей перевозки. (iii) мы проанализировали выявленных PLS для аминокислотных остатков важное для его Pd, ориентация деятельности, будь то структурно и функционально. Используя этот подход, мы определены последовательность 50-амино кислоты вычетов в амино terminus TMV MP, который действует как bona fide PLS. Это было сделано путем подготовки серии TMV MP фрагментов, которые насыщенных по всей длине белка, пометки их карбоксильные Термини с CFP и временно выражая их в тканях растений. PD локализации каждого из протестированных фрагментов определяется coexpressing их с белками маркер Pd, PDCB1 (Pd callose белок, связывающий 1)23. Считается, что маленький фрагмент, который по-прежнему локализованы для Pd, но не передаются Pd, представляют PLS. Наконец PLS был аланин сканирования для определения ключевых аминокислотных остатков, необходимых для его структуры или функции.

Тогда как здесь мы иллюстрируют этот подход, описывая идентификации TMV MP PLS, он может использоваться для обнаружения PLSs в любой другой Pd целевых белков, ли закодированные патогенов растений или растения сами; Это потому, что наш метод не воспользоваться любой уникальные особенности вирусных депутатов в отношении их способности целевой Pd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. растительный материал

  1. Выбор растений
  2. Используйте видов растений, родной белка интерес, то есть, один, который кодирует этот белок для эндогенного белки или которое представляет естественный хост для патогенных вирусных белков. Кроме того выбранные растения должны поддаваться выбранного метода переходных генетической трансформации.
    Примечание: Исследования обычно используют Nicotiana benthamiana, который представляет собой хороший хозяин для ВТМ и эффективно трансформируется Agrobacterium опосредованной генетической трансформации техники, т.е., agroinfiltration (см. шаг 3). N. benthamiana растения также легко выращиваются и имеют большие листья, которые легко прививку Agrobacterium и легко анализируемой confocal микроскопии.
  3. Рост растений
    1. Н. benthamiana семена растений в влажной почве при высокой плотности. Держите их в камере контролируемой среды на 20-25 градусов до 16 h света ~ 75 мкмоль фотоны м-2 s-1 и 8 h тьмы. После того, как диаметр euphyll достигает 0,5 см, тщательно перевести саженцы в больших горшках и продолжить рост в той же камере на тех же условиях.
    2. Сохранять растения до тех пор, пока они растут в 4-8-лист стадии в течение 4 недель, когда больших листьев, 4-6 см в диаметре; в это время, они могут использоваться для agroinfiltration (см. шаг 3).
      Примечание: Важно, никогда не использовать растения, если они начали цвести потому, что на этой стадии развития, лист архитектура часто меняется24,25, иногда приводит к непоследовательным результатам.

2. выражение вектор строительства

  1. Выбор системы выражения
    1. Выберите выражение системы, т.е., векторы и Векторный метод доставки, лучше всего подходит для выражения протеина интереса в изученных видов растений.
      Примечание: Иногда такие конкретные комбинации протестированных белка/растений может потребовать определенных векторов и Векторный метод доставки для оптимального выражения и функции протеина интереса. Для наиболее двудольных растений однако, выберите двоичный плазмид как векторы выражения и agroinfiltration как системы доставки.
  2. Белка флуоресцентных меток
    1. Дневно тег каждого выраженной белка для анализа его субцеллюлярные распределения22, включая Pd локализации.
      Примечание: Использовать autofluorescent белков, таких как CFP и DsRed2, как теги. Тег протестированных белка с CFP и коэкспрессируют с бесплатным DsRed2. CFP функции как тег, так и грузов, не связанных с вирусом молекулы. DsRed2 функции для калибровки общей эффективности переходных выражения и, потому что это ячейка автономное, определить первоначально трансформированных клеток; Эта последняя функция имеет важное значение при оценке движение к ячейке потенциально клеток неавтономной протестированных белков. Для ИССЛЕДОВАНИџ с маркером Pd PDCB1, который также клетки автономная, тег протестированных белка с CFP и PDCB1 с DsRed2.
    2. Как правило предохранитель autofluorescent тег к карбоксильной конечная выраженной белка. Однако если тегами полнометражного протестированных белка экспонатов взломан Pd ориентации, передать тег амино terminus белка.
    3. Клон кодирования последовательностей белков, испытываемого в подходящий завод вектор выражения.
      Примечание: Существует много векторы выражения различных растений, которые позволяют флуоресцентных меток. Мы используем целый ряд pSAT плазмид26 или некоторые из их производных27,28, которые подходят для клонирования последовательность интереса непосредственно в рамке с предложил autofluorescent Теги (см. шаг 2.2.1) в обоих амино- и карбоксильной терминал ориентации.
    4. Перевод каждого выражения кассеты на Agrobacterium бинарный вектор.
      Примечание: Хотя на основе pSAT конструкции подходят для прямых баллистической доставки в растительных тканей, agroinfiltration, который является метод преобразования рекомендуется здесь (см. шаг 3), требует, чтобы выражение кассета будет расположен между T-ДНК границы бинарных векторных29.
      Примечание: Все векторы pSAT призваны разрешить такие передачи26,мультигенных выражение бинарный вектор pPZP-"RCS2"30 одноступенчатых клонирование с использованием редких резки nucleases AscI, -PpoI, -SceI, CeuI, Пи-PspI и PI-TliI 26. исследователи, которые предпочитают использовать recombinatorial клонирования, например, с помощью гетерологичных lox сайты31, могут использовать pSAT вектор варианты,2627.
    5. Для ИССЛЕДОВАНИџ, передачи обе кассеты выражение, например, протестированных белка CFP и DsRed2 или протестированных белка CFP и PDCB1-DsRed2 (см. шаг 2.1), чтобы же бинарный вектор pPZP-"RCS2".
      Примечание: в качестве альтернативы, Agrobacterium культур, укрывает отдельные двоичные конструкции могут быть смешаны вместе для проникновения в н. benthamiana (см. шаг 3.1).

3. Agroinfiltration

  1. Добавить 1 мкг на основе pPZP-"RCS2" плазмида с шагом 2.2.5 до 100 мкл культуры компетентных клеток штамма Agrobacterium tumefaciens EHA105 или GV3101, подготовленных как описано32, инкубировать на льду в течение 30 мин, флэш замораживание в жидком азоте за 1 мин, и Инкубируйте на 28 ° C в течение 15 мин.
    1. Затем добавить 1 мл среды фунтов (10 г/Л Триптон, экстракт дрожжей 5 г/Л и 10 г/Л NaCl) в смеси компетентным ячеек и Инкубируйте на 28 ° C в течение 2 ч. спин вниз клетки на 3000 × г за 1 мин, вновь приостановить их в 0,2 мл LB и пластины их на агаре LB дополнить соответствующие антибиотики (например, 100 мг/Л спектиномицин и рифампицин 50 мг/Л для pPZP-RSC2 основе векторов26,30). Растут на 28 ° C в течение 48 часов, до тех пор, пока отдельные колонии являются видимыми.
  2. Выбрать и тарелка несколько отдельных колоний на свежие пластину агар фунтов (см. шаг 3.1), растут на 28 ° C в течение 48 часов и взять небольшое количество бактерий для анализа колонии PCR33 подтвердить наличие конкретных двоичные конструкций.
  3. Расти каждый Agrobacterium колонии с конструкцией интерес на ночь на 28 ° C в 5 мл LB среды дополняют соответствующие антибиотики (см. шаг 3.1.1). Центрифуга клетки на 3000 × g и вновь приостановить их ОД600= 0,5 agroinfiltration буфера (10 мм MgCl2, 10 мес (рН 5,6), 150 мкм acetosyringone). Проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре.
    1. При использовании смесь бинарных плазмид, вместо того, чтобы одно выражение градиентный плазмида для белка ИССЛЕДОВАНИџ, смесь соответствующих культур клеток в соотношении 1:1 v/v до проникновения. Затем она подогревает клетки на 28 ° C в течение 2 ч.
  4. Загрузите посевным материалом в пластиковый шприц 1 мл и нажмите сопло шприц (без иглы) против Нижняя (abaxial) эпидермис полностью зрелые N. benthamiana листья. Держите лист с пальца в перчатке на adaxial лице34,35.
    1. Ввести Agrobacterium в среде инфильтрат медленной инъекции. Для статистической значимости проникнуть несколько листьев на каждом заводе.
      Примечание: Обратите внимание, что старые листья не используются, они не дают последовательное выражение уровня.
    2. Прививать все листья в situ. Сохраняйте до наблюдения проникли завод, как описано в шаге 1.2.

4. конфокальная микроскопия

  1. Используйте лезвия разрезать каждый лист на фрагменты между венами 24-48 ч после проникновения, (в зависимости от эффективности переходных выражения конкретных протестированных белка); Размер каждого среза ткани должен быть таким, чтобы срез полностью покрыта стеклом (22 мм x 40 мм) используется для микроскопии.
  2. Место, где кусочки листьев на объекте слайд с abaxial листовой поверхности, обращенной вверх, поместите каплю воды на срез листа и покрыть ее с покровным стеклом. Иммобилизации Стекло покровное маленькие кусочки ленты на каждой стороне.
  3. Соблюдать agroinfiltrated тканей под лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп и записывать полученные изображения.
    1. Во-первых использовать для идентификации ячейки с сигналом 10 X объектив, а затем использовать 63 x объектив для более подробные замечания.
    2. Использование 458 Нм длины волны от Аргоновый лазер иона возбудить СЛП и 543 Нм для возбуждения DsRed2. Сохранить все настройки для захвата изображений, т.е., лазерной интенсивности и фотоэлектронный умножитель трубки (ПЛТ) параметров, между экспериментов. В среднем изучите 100-120 клетки для каждого экспериментальные условия.

5. выявление PLS

  1. Диагностика локализации протестированных белка, с использованием конфокального микроскопа (раздел 4). Проверьте, если протестированных белка имеет характерные периферийных пунктата шаблон25,36,37,,3839,40,41 и colocalizes маркером Pd PDCB123. Это означает, что испытания белка скорее содержит PLS последовательности.
  2. После подтверждения PLS деятельности протестированных белка, постепенно подразделяют его рамка чтения открытая (ORF) (genbank присоединения номер BAF93925.1) на более мелкие фрагменты, autofluorescently, (например, СЛП,) тег каждого из них и анализировать их субцеллюлярные локализации как описано в шаге 4. Первоначально рекомендуется использовать размер 100 аминокислотных остатков для каждого подразделяется на фрагмент.
  3. Дробить усеченного фрагменты, которые PLS деятельности и проверить их субцеллюлярные локализации, как описано в шаге 4 до маленький фрагмент, который по-прежнему локализует Pd, т.е. достаточно для перевозки грузов тег autofluorescent для Pd идентифицируется. Предполагается, что этот фрагмент представляют последовательность PLS.
  4. Удалить предполагаемого PLS из полнометражных протестированных белка, т.е. предохранитель на оставшуюся часть теста белка без предполагаемого PLS тег autofluorescent и определить субцеллюлярные локализации результате Мутантный белок, как описано в шаге 4. Если этот мутантный белок, что не хватает предполагаемого PLS не удается локализовать Pd, это будет указано, что выявленные PLS является не только достаточно (см. шаг 5.3), но также необходимым для перевозки Pd протестированных белка.
  5. Agroinfiltrate листья с смесь культур Agrobacterium, укрывательство выражение построить за СЛП тегами PLS и бесплатные DsRed2 (см. шаг 3.3). Соблюдайте проникли тканей, с использованием Конфокальный микроскоп с объектива 10 x с теми же параметрами, как шаг 4.3.
  6. Оценка клеток, которые содержат CFP и DsRed2 сигналы как первоначально проникли клетки и оценка смежных ячеек, которые содержали только CFP сигнал как те, что выставка движения.
    Примечание: Этот шаг рассматриваются выявленные PLS для своей потенциальной способности клеток к движению; Это потому, что многие белки, которые нацелены Pd (включая большинство растений вирусных м/с) также перемещаться по ПД в соседние клетки. Концентрация Agrobacterium, используемые для проникновения зависит эффективность выражения различных структур соответственно. Для agroinfiltration не забудьте использовать разрежения культуры клеток, что обеспечивает (i) преобразования единичных клеток, оставляя смежные ячейки непреобразованной, (ii) достигает аналогичные эффективности выражения. Например наши эксперименты используют ОД600 0,01 и 0,005 для выражения СЛП тегами PLS и бесплатные DsRed2, соответственно.

6. Идентификация ключ PLS остатков с помощью сканирования аланина42

  1. Использовать стандартные протоколы PCR усиливает PLS кодирования последовательность, используя пары праймеров, предназначенных для размещения желаемого мутации, т.е., замена целевого аминокислотных остатков с аланина, вокруг центральной части каждого праймера как описано 21. конструкция праймера и использования сайта Направленный мутагенез комплект для сайта Направленный мутагенез согласно инструкциям производителя.
  2. Очистить результате продукты PCR, используя любой стандартный комплект очистки ДНК и дайджест их при 37 ° C с ДПНИ для ликвидации родителей (т.е., не мутировал) метилирован и hemimethylated ДНК. Прохладный это на 5 мин при комнатной температуре (не на льду). Затем превратить смесь непосредственно в E. coli сведущие клетки43и определить колоний с желаемой мутант конструкции, как описано в шаге 3.2.
  3. Внедрить мутант конструкции в бинарный вектор, как описано в пункте 2.2.4, выполните agroinfiltration, как описано в шаге 3 и оценить Pd ориентации, как описано в шагах 4 и 5.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативных данных, которые добросовестно иллюстрируют результаты, ожидаемые от описанные протоколы и идентифицировать TMV MP PLS, взяты из Юань и др. 21. на рисунке 1A сначала кратко основные конструкции, выражая полнометражного TMV MP (1-268), ВТМ MP PLS (включая первые 50 аминокислотных остатков белка, 1-50), и его сканирование V4A производные аланина сливается с CFP (генерируется как описанные шаги 2.2, 5.2 и 6) тогда как Рисунок 1B обобщаются и количественно субцеллюлярные локализации этих тегами белков. Рисунок 1 c иллюстрирует характерный периферийных пунктата Pd локализации шаблонов наблюдается для MP-CFP ВТМ и для TMV MP PLS-CFP также как маркер coexpressed Pd, PDCB1-DsRed2 (см. шаг 5.1). Рисунок 2A иллюстрирует Pd ориентации TMV MP-CFP и TMV MP PLS-CFP и nucleocytoplasmic распределения coexpressed бесплатные DeRed2 (см. шаг 5.1). Наконец Рисунок 2B показывает потерю Pd ориентации TMV MP и TMV MP PLS с заменой одного аланина V4A, указав, что это остаток имеет важное значение для PLS структуры или функции; в том же клетки coexpressed Pd маркер, PDCB1 по-прежнему локализуется для Pd (см. шаг 6).

Эти данные показывают, что это концептуально и технически простая процедура систематического производства белковых фрагментов, их синтез белка маркера грузовой autofluorescent и тестирования для обеспечения возможности локализации для Pd может определить минимальный белка последовательности необходимых и достаточных для Pd, ориентации, то есть, PLS. Для правильной интерпретации этих данных локализации, важно выполнять colocalization экспериментов с известным Pd белка, например, PDLP или PDCB членов семьи16,23 или один из завода вирусных м/с, которые выполняют сортировку для Pd44 . Очевидно colocalization не должны быть полными, поскольку не все P-локализация белки могут быть направлены на же Pd, но статистически значимой степени colocalization с по крайней мере один из белков маркер Pd необходим для определения активности PLS.

Figure 1
Рисунок 1: выявление TMV MP PLS. (A) краткое изложение основных конструкций СЛП фьюжн, используется для идентификации TMV MP PLS. TMV MP последовательностей, зеленый коробки; СЛТ, синие; P, промоутер; T, Терминатор. Цифры слева показывают аминокислотных остатков, включены в каждом фрагменте TMV MP. (Б) краткое изложение субцеллюлярные локализации синтез белков в (A). PD локализации или nucleocytoplasmic локализация была определена на основании локализации соответствующего внутриклеточных маркеров, PDCB1-DsRed2 и бесплатные DsRed2, соответственно. Процент клеток, выставке каждый шаблон локализации показано основе скоринга 100 выражая клеток на конструкцию в трех независимых экспериментах. Данные являются среднее ± стандартные ошибки (SE). (C) Pd ориентации TMV MP-CFP, ВТМ MP PLS-CFP и Pd маркер PDCB1-DsRed2. CFP сигнал является синим цветом; DsRed2 сигнал находится в порфиру; Пластидно аутофлюоресценция были отфильтрованы. Изображения являются одной конфокальный секций. Масштаб баров = 10 мкм. ОПК, контраст Микрофотография дифференциальной помехи. Эта цифра приспособлен от Юань и др. 21. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Pd ориентации TMV MP, ВТМ MP PLS и их аланин сканирование мутантов. (A) субцеллюлярные локализация TMV MP-CFP, ВТМ MP PLS-CFP и маркер nucleocytoplasmic DsRed2. (B) потеря Pd ориентации способность аланин сканирование мутантов V4A TMV MP-CFP и TMV MP PLS-СЛП. PD были визуализированное ИССЛЕДОВАНИџ Pd маркера PDCB1-DsRed2. CFP сигнал является синим цветом; DsRed2 сигнал находится в порфиру; Пластидно аутофлюоресценция были отфильтрованы. Изображения являются одной конфокальный секций. Масштаб баров = 10 мкм. ОПК, контраст Микрофотография дифференциальной помехи. Эта цифра приспособлен от Юань и др. 21. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол имеет четыре основных составляющих: концепция определения последовательности, которая является необходимым и достаточным для ориентации Pd, систематическое разделение протеина интереса на фрагменты, которые постепенно сокращается в длину, фьюзинг испытанные фрагменты autofluorescent белок, который служит как тег и высокомолекулярных груза и функционального анализа для Pd ориентации в жизни растений тканей после переходных выражение протестированных синтеза белков. Обратите внимание, что Agrobacterium опосредованной переходных выражение создает данные в течение относительно короткого периода времени, то есть, несколько дней, по сравнению с месяцев, необходимых для производства трансгенных растений, часто используется в аналогичных исследований15.

ИССЛЕДОВАНИџ протеина интереса с локализация внутриклеточных маркеров, например, PDCB1 или свободный DsRed2, обычно выполняется из вектора мультигенных выражение. Однако, если передача нескольких выражений кассет в единый вектор является технически проблематичным, ИССЛЕДОВАНИџ может также производиться путем передачи каждой кассеты в конструкцию отдельные двоичные и объединения эквивалентных объемов жидкого культур результате Agrobacterium штаммов для agroinfiltration. Потому что этот протокол использует временные выражения, бинарный вектор не нужно нести маркеры выделения для стабильной преобразования, хотя их присутствие не вредно для выражения эффективности.

Этот протокол, оптимизированный для выражения протеина и ориентации в с. benthamiana; Однако она может использоваться в других видов растений, в том числе Arabidopsis45,46, поддается генетической трансформации Agrobacterium. Для других видов растений или если в противном случае, этот протокол может быть адаптирована к использовать баллистической доставки41 для переходных выражение непосредственно от pSAT основе векторов, избегая необходимости передать бинарных векторов выражения кассеты.

Критической точки в этот протокол является последовательное физиологические и развития состояния растительного материала. В частности, все растения должны быть здоровым на протяжении всего эксперимента, и, для agroinfiltration, н. benthamiana растения должны быть меньше, чем 4-х недель старые и на стадии 4-8-лист с большой лист, 4-6 см в диаметре. Если растения слишком молоды, эффекты agroinfiltration будет слишком тяжелой, мешая выражение и локализации тегами белков. С другой стороны старые растения часто exhibit переменной архитектуры Pd24,25, также затрагивают последовательность Pd ориентация моделей.

Тем не менее из-за различных физиологических условиях завода в целом и его трансформированных клеток в частности, эффективность Pd ориентации в каждом эксперименте может несколько отличаться. Таким образом, важно анализировать относительно большое количество клеток (> 100) за эксперимент и выполнить по крайней мере три биологических реплицирует каждого эксперимента. Вообще мы рассмотрим протестированных фрагмент содержит Pd ориентации деятельности, если она проявит Pd локализации в по меньшей мере 70% трансформированных клеток. Различия в Pd ориентации эффективность каждого фрагмента, например, процент трансформированных клеток, показаны Pd конкретных пунктата накопления шаблон, должны быть проанализированы t тест Стьюдента и p значения < 0,05-0.01, соответствующий статистическая вероятность более чем 95-99%.

Еще одним важным вопросом является положение флуоресцентные метки/грузов в молекуле фьюжн. Некоторые белки, Pd целевой также связать с эндоплазменный ретикулум (ER), и эта ассоциация может потребовать беспрепятственный последовательность аминокислот терминал. В этих случаях, амино терминал слияния, в которые карбоксильной конечная фрагмента протеин интереса сливается с амино terminus флуоресцентные метки, например, СЛП или DsRed2, следует использовать. Это по умолчанию размещение тега может быть изменен в следующих случаях. (i) Если сплавливания амино терминал не годятся – то есть, они не демонстрируют значимые локализация внутриклеточных структур, слабо выражены или не создавать флуоресцентного сигнала достаточно для надежного обнаружения – и если протеин интереса не содержат последовательности аминокислот терминал сигнала или карбоксильных терминал слияния, в которые амино terminus протестированных фрагмент сливается с карбоксильной конечная тег, они должны выполняться. (ii) карбоксильной терминал сплавливания также должны использоваться если протеин интереса содержит сигнальные последовательности в ее карбоксильной terminus. (iii) если протеина интереса имеет оба амино - и карбоксильной терминал сигналов, таких как те, нашли в GPI-якорь белков, или если он содержит пептид амино терминал сигнала еще его амино терминал fusion-это не полезная, тег должен быть помещен внутри,) или вниз по течению амино терминал сигнала вверх по течению от сигнала карбоксильной терминал). Некоторые полезные процедуры для внутреннего флуоресцентные Мечение белков описаны в нашей предыдущей публикации47,48.

В настоящее время существует последовательность не известных консенсуса для PLS. Как таковой (в шаге 5.2) мы рекомендуем, первоначально дробление белка в смежных ~фрагменты остатков длиной 100-200. Они затем могут быть сделаны постепенно короче на основе наблюдаемых Pd ориентация деятельности или отсутствие таковых. Следует помнить о других потенциальных ориентации сигналы присутствуют в белков (например, NLS, сигнал пептидов и т.д.). Однако как потенциального дублирования таких последовательностей с последовательностями PLS неизвестна, эти регионы белка должны включаться в этот мутационного анализ.

До настоящего времени этот протокол использовался для определения единого PLS в молекулу белка21. Потенциально однако, белок может содержать более одного последовательность сигнала; в многих ядерных белков, включая факторы транскрипции Гата49были описаны действительно несколько ОУЖН. Таким образом при анализе различных фрагментов протестированных белка для Pd ориентации, вполне возможно, что будут определены более чем одной такой фрагмент, указывающих на наличие нескольких PLSs, которые могут действовать независимо или синергически.

Основным ограничением этого протокола является, что, после agroinfiltration, Визуализация субцеллюлярные локализации временно выраженной протеинов интереса лучше всего достигается в эпидермальных клеток и на стадии роста относительно узкий. При необходимости, это ограничение можно преодолеть путем производства трансгенных растений, которые стабильно Экспресс каждого из протестированных белков в большинстве тканей и типов клеток. Кроме того этот протокол не будет полезным для исследований вирусных м/с или других Pd целевых белков, которые функционируют только в видов растений, которые не поддаются переходных генетической трансформации.

В то время как мы разработали эту технику для идентификации PLS TMV MP, она может использоваться для обнаружения PLSs в любой другой завод вирусных м/с или в завод эндогенных белки, которые локализации для Pd, временно или постоянно. Кроме того если в сочетании с соответствующей локализация внутриклеточных маркеров47, этот протокол предназначен для идентификации многих других таргетинга сигналов в пределах протеинов интереса в растениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Acknowledgments

За неимением места мы упоминали главным образом обзор статей, и мы приносим извинения нашим коллегам, чьи оригинальные работы не упоминалась. Работа в лаборатории V.C. поддерживается грантов из низ, NSF, USDA/НИФА, Бард и ФСБ V.C., и S.G.L. Лаборатория поддерживается низ и средств от департаментов растений патологии и биологии растений-микробных S.G.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15, (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42, (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley-Interscience. New York. (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics