Planta में प्रोटीन में Plasmodesmal स्थानीयकरण अनुक्रम की पहचान

Immunology and Infection

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Summary

संयंत्र सेलुलर कनेक्शन, plasmodesmata (पीडी), संयंत्र शरीर क्रिया विज्ञान और संयंत्र-वायरस बातचीत में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । पीडी परिवहन के लिए महत्वपूर्ण संकेत है कि पीडी के लिए सीधे प्रोटीन छंटाई कर रहे हैं । हालांकि, इन दृश्यों के बारे में हमारी जानकारी अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है । हम पीडी-लक्षित प्रोटीन में पीडी स्थानीयकरण संकेतों की पहचान करने के लिए एक रणनीति का वर्णन.

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Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).

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Abstract

Plasmodesmata (पीडी) कक्ष के लिए सेल कनेक्शन है कि गेटवे के माध्यम से जो छोटे और बड़े अणुओं संयंत्र कोशिकाओं के बीच पहुंचाया जाता है के रूप में कार्य कर रहे हैं । ऐसे आयनों और पानी के रूप में छोटे अणुओं के पीडी परिवहन जबकि, निष्क्रिय होने के लिए माना है, कोशिका से कोशिका परिवहन जैविक अणुओं की, ऐसे प्रोटीन, सबसे अधिक संभावना एक सक्रिय तंत्र है कि पर विशिष्ट लक्ष्यीकरण संकेतों शामिल है के माध्यम से होता है उत्पात अणु. पहचान plasmodesmata (पीडी) स्थानीयकरण संकेतों (PLSs) की किल्लत गंभीर रूप से संयंत्र सेल-टू-सेल macromolecular परिवहन और संचार में शामिल प्रोटीन छँटाई रास्ते की समझ को प्रतिबंधित किया है । पीडी के माध्यम से यातायात के लिए जाना जाता संयंत्र अंतर्जात और वायरल प्रोटीन के एक धन से, केवल तीन PLSs तिथि करने के लिए सूचित किया गया है, उन सभी अंतर्जात संयंत्र प्रोटीन से । इस प्रकार, यह एक कार्यात्मक PLS अनुक्रम की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय और व्यवस्थित प्रयोगात्मक रणनीति विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, कि दोनों आवश्यक है और पीडी लक्ष्यीकरण के लिए पर्याप्त है, सीधे रहने वाले संयंत्र कोशिकाओं में. यहां, हम एक ऐसी रणनीति का वर्णन एक प्रतिमान सेल के रूप में उपयोग करने वाली सेल आंदोलन प्रोटीन (सांसद) के तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) । इन प्रयोगों, कि पहचान और पहली संयंत्र वायरल pls विशेषता, सबसे पीडी-लक्षित प्रोटीन में PLS दृश्यों की खोज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

Plasmodesmata (पीडी) संयंत्र विकास और morphogenesis के प्रमुख नियामकों के सेलुलर परिवहन के लिए नाली के रूप में कार्य, प्रतिलेखन कारकों से mRNA और छोटे आरएनए अणुओं को लेकर. इसके अलावा, पीडी के इस macromolecular परिवहन क्षमता संक्रमण के दौरान उनके सेलुलर प्रसार के लिए सबसे संयंत्र वायरस द्वारा उपयोग किया जाता है; पीडी के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए, संयंत्र वायरस विशेष प्रोटीन विकसित किया है, आंदोलन प्रोटीन (सांसदों), कि विशेष रूप से पीडी को लक्ष्य1,2,3,4,5,6 , 7. पीडी परिवहन के आण्विक रास्ते सबसे अधिक संभावना परिचित विशिष्ट अनुक्रम है कि इन रास्ते में परिवहन प्रोटीन लक्ष्य के साथ जुड़े हुए हैं । इस प्रकार, इन पीडी स्थानीयकरण संकेतों की पहचान (PLSs) इसी पीडी परिवहन मार्ग का निदान हो सकता है. यह पीडी परिवहन8के सादृश्य से है, उदाहरण के लिए, विभिन्न परमाणु आयात रास्ते, जो अलग परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) अनुक्रम9,10के लिए विशिष्ट किया जा सकता है । वैचारिक रूप से, NLSs और PLSs, दोनों ही लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक और पर्याप्त गैर-सट उपसेलुलर लक्ष्यीकरण अनुक्रम दर्शाते हैं. हालांकि, NLSs11के विपरीत, PLSs के बारे में अनुक्रम जानकारी गंभीर रूप से सीमित है । विशेष रूप से, पीडी लक्ष्यीकरण में शामिल केवल चार प्रोटीन अनुक्रम रिपोर्ट किया गया है, उन सभी के साथ अंतर्जात संयंत्र प्रोटीन से व्युत्पंन । पहले एक KN112 के एक homeobox डोमेन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है-एक प्रतिलेखन कारक है कि भीतरी कोशिका परतों से संयंत्र पत्ती13 के एपिडर्मिस के लिए चलता है-और उसके KNOX homologs14। दूसरा एक भी एक प्रतिलेखन कारक है, Dof, जो एक ख्यात के रूप में वर्णित है PLS से है सेलुलर तस्करी (यह) आकृति15। तीसरा अनुक्रम PDLP1 plasmodesmata-निवासी प्रकार 1 झिल्ली प्रोटीन से है, और यह एक transmembrane डोमेन16द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । अंत में, चौथे पीडी लक्ष्यीकरण अनुक्रम हाल ही में glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई)-लंगर प्रोटीन के लिए रिपोर्ट किया गया था और यह glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई) संशोधन संकेत17द्वारा प्रतिनिधित्व है ।

दिलचस्प है, जब तक बहुत हाल ही में, कोई PLSs वायरल सांसदों के लिए सूचित किया गया है । पिछले अध्ययन संयंत्र वायरल सांसद18,19में ख्यात PLS दृश्यों की उपस्थिति का संकेत दिया है, लेकिन कोई सच PLS, यानी, एक ंयूनतम एमिनो एसिड अनुक्रम दोनों आवश्यक और एक असंबंधित कार्गो अणु के पीडी लक्ष्यीकरण के लिए पर्याप्त ( उदाहरणके लिए, एक वायरल सांसद की पहचान की गई है । अभी तक इन प्रोटीनों में से एक, तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) के सांसद, सबसे पहले के लिए पीडी स्थानीयकरण और परिवहन20प्रदर्शन किया गया है ।

इस अंतर को संबोधित करने के लिए, हम एक प्रयोगात्मक रणनीति TMV सांसद PLS की पहचान विकसित की है । यह रणनीति तीन अवधारणाओं पर आधारित थी । (i) हम एक ंयूनतम एमिनो एसिड अनुक्रम है कि दोनों आवश्यक है और पर्याप्त है पीडी21को लक्षित प्रोटीन के लिए के रूप में PLS परिभाषित । (ii) क्योंकि TMV MP पहले पीडी को टारगेट करता है और फिर इन22चैनलों के माध्यम से translocates, हम इन दो गतिविधियों को युग्मित करने के उद्देश्य से और सदाशई की पहचान PLS, जो केवल पीडी लक्ष्यीकरण के लिए कार्य करता है, और बाद में परिवहन के लिए नहीं. (iii) हम अपने पीडी लक्ष्यीकरण गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण एमिनो एसिड अवशेषों के लिए पहचान PLS का विश्लेषण, चाहे संरचनात्मक या कार्यात्मक । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम delineated एक ५० अमीनो एसिड अवशेष अनुक्रम में एमिनो-TMV सांसद के टर्मिनस कि सदाशई के रूप में कार्य करता है PLS । यह TMV सांसद टुकड़े की एक श्रृंखला है कि प्रोटीन की पूरी लंबाई संतृप्त द्वारा किया गया था, उनके carboxyl-टर्मिनी के साथ टैगिंग और क्षणिक उंहें संयंत्र के ऊतकों में व्यक्त । प्रत्येक परीक्षण अंशों के पीडी स्थानीयकरण उन्हें एक पीडी मार्कर प्रोटीन के साथ coexpressing द्वारा निर्धारित किया गया था, PDCB1 (पीडी callose बाइंडिंग प्रोटीन 1)23. सबसे छोटा टुकड़ा अभी भी पीडी के लिए स्थानीयकृत, लेकिन पीडी पार नहीं किया, PLS का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता था. अंत में, PLS alanine था-कुंजी एमिनो एसिड अपनी संरचना और/या समारोह के लिए आवश्यक अवशेषों का निर्धारण करने के लिए स्कैन ।

यहां हम TMV सांसद PLS की पहचान का वर्णन करके इस दृष्टिकोण उदाहरण देकर स्पष्ट करना, यह किसी भी अंय पीडी में PLSs की खोज के लिए नियोजित किया जा सकता है प्रोटीन लक्षित, कि संयंत्र रोगजनकों द्वारा या पौधों को खुद द्वारा इनकोडिंग; इसका कारण यह है कि हमारी विधि के साथ वायरल सांसदों के किसी भी अनूठी विशेषताओं का लाभ नहीं ले पीडी को लक्ष्य करने के लिए उनकी क्षमता के संबंध है ।

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Protocol

1. पौध सामग्री

  1. पादप प्रजातियों के विकल्प
  2. संयंत्र ब्याज के प्रोटीन के लिए देशी प्रजातियों का प्रयोग करें, यानी, एक हैजो अंतर्जात प्रोटीन के लिए इस प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना या जो वायरल प्रोटीन के लिए रोगज़नक़ के लिए प्राकृतिक मेजबान का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, चयनित संयंत्र प्रजातियों क्षणिक आनुवंशिक परिवर्तन की चुनी विधि के लिए उत्तरदायी होना चाहिए.
    नोट: अध्ययन नियमित रूप से निकोटियाना benthamianaहै, जो TMV के लिए एक अच्छा मेजबान का प्रतिनिधित्व करता है और कुशलतापूर्वक एग्रोबेक्टीरियम द्वारा रूपांतरित-मध्यस्थता आनुवंशिक परिवर्तन तकनीक, अर्थात्, agroinfiltration (चरण 3 देखें) को रोजगार । N. benthamiana पौधों को भी आसानी से हो रहे है और बड़े पत्ते, जो आसानी से एग्रोबेक्टीरियम द्वारा inoculated और आसानी से फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं ।
  3. पौध वृद्धि
    1. उच्च घनत्व पर गीली मिट्टी में संयंत्र N. benthamiana बीज । उंहें एक नियंत्रित वातावरण चैंबर में 20-25 ˚ सी पर 16 प्रकाश के एच के तहत रख ~ ७५ µmol फोटॉनों एम-2 एस-1 और अंधेरे के 8 एच । euphyll के व्यास ०.५ सेमी तक पहुँच जाता है के बाद, ध्यान से अंकुर बड़े बर्तन करने के लिए स्थानांतरण और एक ही स्थिति के तहत एक ही चैंबर में वृद्धि जारी है.
    2. पौधों को बनाए रखें जब तक वे 4 सप्ताह के भीतर 4-8-पत्ती चरण बढ़ने जब सबसे बड़ी पत्तियों व्यास में 4-6 सेमी कर रहे हैं; इस समय, वे agroinfiltration के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चरण 3 देखें) ।
      नोट: महत्वपूर्ण बात, पौधों का उपयोग करें अगर वे फूल के लिए शुरू किया, क्योंकि, इस विकास की अवस्था में, पत्ती वास्तुकला अक्सर24,25बदलता है, कई बार असंगत परिणाम के लिए अग्रणी ।

2. अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण

  1. अभिव्यक्ति प्रणाली का चुनाव
    1. चुनें अभिव्यक्ति प्रणाली, यानी, वैक्टर और वेक्टर वितरण विधि, सबसे अच्छा संयंत्र प्रजातियों में रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल का अध्ययन किया ।
      नोट: कभी-कभार, इस तरह के विशिष्ट संयोजन का परीक्षण किया प्रोटीन/संयंत्र प्रजातियों विशिष्ट वैक्टर और इष्टतम अभिव्यक्ति और ब्याज की प्रोटीन के समारोह के लिए वेक्टर वितरण विधि की आवश्यकता हो सकती है । अधिकांश फूल संयंत्रों के लिए, तथापि, बाइनरी plasmids अभिव्यक्ति वैक्टर और agroinfiltration वितरण प्रणाली के रूप में का चयन करें ।
  2. प्रोटीन फ्लोरोसेंट टैगिंग
    1. फ्लोरोसेंट अपने उपसेलुलर वितरण के विश्लेषण के लिए एक व्यक्त प्रोटीन टैग22, पीडी स्थानीयकरण सहित ।
      नोट: ऐसे और DsRed2 के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन रोजगार, टैग के रूप में । परीक्षण प्रोटीन के साथ और coexpress टैग एक मुक्त DsRed2 । दोनों टैग के रूप में और एक वायरस असंबंधित कार्गो अणु के रूप में । DsRed2 क्षणिक अभिव्यक्ति की समग्र दक्षता जांचने के लिए कार्य करता है और, क्योंकि यह सेल-स्वायत्त है, शुरू में रूपांतरित सेल की पहचान करने के लिए; यह बाद समारोह महत्वपूर्ण है जब सेल के लिए संभावित गैर सेल-स्वायत्त परीक्षण प्रोटीन के सेल आंदोलन का आकलन है । पीडी मार्कर PDCB1, जो भी सेल स्वायत्त है के साथ coexpression के लिए, DsRed2 के साथ और PDCB1 के साथ साथ परीक्षण प्रोटीन टैग ।
    2. अंगूठे का एक नियम के रूप में, carboxyl के लिए फ्लोरोसेंट टैग फ्यूज-व्यक्त प्रोटीन की टर्मिनस । हालांकि, यदि टैग की गई पूर्ण लंबाई परीक्षण प्रोटीन प्रदर्शन पीडी लक्ष्यीकरण समझौता, अमीनो के लिए टैग हस्तांतरण-प्रोटीन की टर्मिनस ।
    3. क्लोन प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रम एक उपयुक्त संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर में परीक्षण किया जाएगा ।
      नोट: कई अलग संयंत्र अभिव्यक्ति वैक्टर कि फ्लोरोसेंट टैगिंग की अनुमति है । हम pSAT plasmids की एक श्रृंखला का उपयोग करें26 या उनके डेरिवेटिव27,28, जो ब्याज के अनुक्रम का सुझाव दिया फ्लोरोसेंट टैग के साथ फ्रेम में सीधे क्लोनिंग के लिए उपयुक्त है में से कुछ (चरण 2.2.1 देखें) दोनों अमीनो में-और carboxyl-टर्मिनल झुकाव ।
    4. एक एग्रोबेक्टीरियम बाइनरी वेक्टर में प्रत्येक अभिव्यक्ति कैसेट स्थानांतरण ।
      नोट: हालांकि pSAT-आधारित निर्माण संयंत्र के ऊतकों, agroinfiltration, जो परिवर्तन विधि यहां की सिफारिश की है में प्रत्यक्ष सूची वितरण के लिए उपयुक्त है (चरण 3 देखें), की आवश्यकता है कि अभिव्यक्ति कैसेट टी डीएनए के बीच स्थित होना एक द्विआधारी सदिश की सीमाओं29
      नोट: सभी pSAT वैक्टर pPZP-RCS2 multigene अभिव्यक्ति बाइनरी वेक्टर के लिए इस तरह के हस्तांतरण की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है26,30 एक एकल कदम क्लोनिंग दुर्लभ काटने nucleases एएससीआई, मैं-PpoI, मैं-SceI, मैं-CeuI, पीआई-PspI और पीआई-TliI का उपयोग करके 26. शोधकर्ताओं जो recombinatorial क्लोनिंग का उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं, उदाहरणके लिए, heterologous लोक्स साइटों31का उपयोग कर, pSAT वेक्टर वेरिएंट को रोजगार कर सकते हैं26,27.
    5. coexpression के लिए, दोनों अभिव्यक्ति कैसेट हस्तांतरण, उदाहरणके लिए, परीक्षण प्रोटीन-------------और DsRed2 या प्रोटीन-------PDCB1 DsRed2 (२.१ कदम देखें) एक ही pPZP-RCS2 द्विआधारी वेक्टर ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एग्रोबेक्टीरियम संस्कृतियों व्यक्ति द्विआधारी constructs बंदरगाह एक साथ घुसपैठ के लिए N. benthamiana में मिलाया जा सकता है (३.१ कदम देखें) ।

3. Agroinfiltration

  1. जोड़ने के लिए एक pPZP-RCS2-प्लाज्मिड के कदम 2.2.5 से १०० µ एल के सक्षम कोशिकाओं की संस्कृति के 1 µ g जोड़ें एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens तनाव EHA105 या GV3101 के रूप में तैयार किया३२वर्णित है, 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन, फ्लैश-1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज, और 15 मिनट के लिए 28 ° c पर मशीन ।
    1. फिर, 1 मिलीलीटर पौंड मध्यम जोड़ें (10 g/L tryptone, 5 जी/एल खमीर निकालने, और 10 जी/एल NaCl) सक्षम सेल मिश्रण करने के लिए और 2 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के लिए 1 मिनट के लिए ३,००० × जी में कोशिकाओं नीचे स्पिन, फिर से उंहें ०.२ मिलीलीटर में निलंबित पौंड , और उंहें पौंड पर प्लेट उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक आगर (जैसे, १०० mg/l spectinomycin और ५० mg/l रिफैंपिसिन के लिए pPZP-RSC2-आधारित वैक्टर26,30). ४८ घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस से अधिक हो जाना जब तक व्यक्तिगत कालोनियों दिखाई दे रहे हैं ।
  2. उठाओ और एक ताजा पौंड आगर प्लेट पर कई व्यक्तिगत कॉलोनियों थाली (३.१ कदम देखें), ४८ एच के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने, और विश्लेषण के लिए कॉलोनी पीसीआर द्वारा बैक्टीरिया की एक छोटी राशि लेने के लिए३३ की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए विशिष्ट द्विआधारी constructs ।
  3. पौंड मध्यम उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक के 5 मिलीलीटर में 28 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात ब्याज के निर्माण के साथ प्रत्येक एग्रोबेक्टीरियम कॉलोनी बढ़ने (कदम 3.1.1 देखें) । ३,००० × जी पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, और उंहें फिर से निलंबित आयुध डिपो के लिए६००= ०.५ agroinfiltration बफर में (10 मिमी MgCl2, 10 मिमी एमईएस (पीएच ५.६), १५० µ एम acetosyringone) । कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
    1. अगर एक एकल multigene अभिव्यक्ति प्लाज्मिड प्रोटीन coexpression के बजाय बाइनरी plasmids के मिश्रण का उपयोग कर, घुसपैठ से पहले 1:1 वी/v अनुपात पर इसी सेल संस्कृतियों मिश्रण । फिर 2 एच के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
  4. एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज में इनोक्युलम लोड और पूरी तरह से परिपक्व N. benthamiana पत्तियों के निचले (abaxial) एपिडर्मिस के खिलाफ सिरिंज (कोई सुई) के नोजल दबाएँ. adaxial चेहरा३४,३५पर एक दस्ताने उंगली के साथ पत्ती पकड़ो ।
    1. धीमी इंजेक्शन से घुसपैठ माध्यम में एग्रोबेक्टीरियम का परिचय । सांख्यिकीय महत्व के लिए, प्रत्येक संयंत्र पर कई पत्तियों में घुसपैठ ।
      नोट: ध्यान दें कि सबसे पुरानी पत्तियों का उपयोग नहीं किया जाता है क्योंकि वे संगत व्यंजक स्तर नहीं अर्जित करते हैं ।
    2. सीटू मेंसभी पत्ते लगाना । कदम १.२ में वर्णित के रूप में अवलोकन तक घुसपैठ संयंत्र बनाए रखें ।

4. फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. एक ब्लेड का प्रयोग करने के लिए घुसपैठ के बाद नसों 24-48 ज के बीच टुकड़ों में एक पत्ती में कटौती, (विशिष्ट परीक्षण प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति की क्षमता पर निर्भर करता है); प्रत्येक ऊतक टुकड़ा का आकार ऐसा है कि टुकड़ा पूरी तरह से कवर ग्लास (22 मिमी x ४० मिमी) माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल द्वारा कवर किया जाना चाहिए ।
  2. abaxial पत्ती की सतह का सामना करना पड़ के साथ वस्तु स्लाइड पर पत्ती स्लाइस प्लेस, पत्ती स्लाइस पर पानी की एक बूंद जगह है और यह कवर ग्लास के साथ कवर । प्रत्येक पक्ष पर टेप के छोटे टुकड़े के साथ कवर ग्लास मैटीरियल ।
  3. एक लेजर फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग के तहत agroinfiltrated ऊतकों का निरीक्षण और जिसके परिणामस्वरूप छवियों को रिकॉर्ड ।
    1. पहले, संकेत के साथ कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग करें, और फिर अधिक विस्तृत टिप्पणियों के लिए 63x उद्देश्य लेंस का उपयोग करें ।
    2. DsRed2 को उत्तेजित करने के लिए एक आर्गन आयन लेजर से ४५८ एनएम तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें, और ५४३ एनएम को उत्साहित करने के लिए । प्रयोगों के बीच, छवि अधिग्रहण, यानी, लेजर तीव्रता और photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) सेटिंग्स के लिए सभी सेटिंग्स को बनाए रखने. औसतन, प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए 100-120 कक्षों की जांच करें ।

5. PLS की पहचान

  1. फोकल माइक्रोस्कोप (धारा 4) का उपयोग कर परीक्षण प्रोटीन के स्थानीयकरण का निदान. परीक्षण प्रोटीन विशेषता परिधीय कबरा पैटर्न25,३६,३७,३८,३९,४०,४१ और colocalizes है की जाँच करें पीडी मार्कर के साथ23PDCB1. यह इंगित करता है कि परीक्षण प्रोटीन सबसे अधिक संभावना है PLS अनुक्रम शामिल हैं ।
  2. परीक्षण प्रोटीन के PLS गतिविधि की पुष्टि के बाद, उत्तरोत्तर अपने खुले पढ़ने के फ्रेम (ओआरएफ) (genbank का उपयोग संख्या बाफ 93925.1) छोटे टुकड़ों में प्रतिभाग, (जैसे,,,,) फ्लोरोसेंट, उनमें से प्रत्येक टैग, और विश्लेषण उनके चरण 4 में वर्णित के रूप में उपसेलुलर स्थानीयकरण । शुरू में, प्रत्येक विभाजित टुकड़ा के लिए १०० अमीनो एसिड अवशेषों के आकार की सिफारिश की है ।
  3. आगे कटा हुआ टुकड़े जो PLS गतिविधि है और उनके सेलुलर स्थानीयकरण की जांच के रूप में चरण 4 में वर्णित के रूप में सबसे छोटा टुकड़ा है जो अभी भी पीडी के लिए स्थानीयकरण, अर्थात् करने के लिए पर्याप्त है फ्लोरोसेंट टैग कार्गो परिवहन पीडी को, पहचाना जाता है । इस अंश को PLS अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना है ।
  4. पूर्ण लंबाई से ख्यात pls नष्ट प्रोटीन का परीक्षण किया, यानी ख्यात PLS के बिना परीक्षण प्रोटीन के शेष भाग को फ्लोरोसेंट टैग के लिए फ्यूज, और परिणामस्वरूप उत्परिवर्ती प्रोटीन के रूप में कदम में वर्णित की उपसेलुलर स्थानीयकरण का निर्धारण 4. यदि इस उत्परिवर्ती प्रोटीन है कि ख्यात pls की कमी के लिए पीडी स्थानीयकरण विफल रहता है, यह संकेत मिलता है कि पहचान PLS केवल पर्याप्त नहीं है (५.३ कदम देखें), लेकिन यह भी आवश्यक परीक्षण प्रोटीन के पीडी परिवहन के लिए ।
  5. Agroinfiltrate एग्रोबेक्टीरियम अभिव्यक्ति बंदरगाह के लिए निर्माण संस्कृतियों का एक मिश्रण के साथ पत्ते के लिए तैयार-PLS टैग और मुक्त DsRed2 (३.३ कदम देखें) । घुसपैठ के लिए ४.३ चरण के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग 10x के उद्देश्य लेंस के साथ फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ऊतक निरीक्षण ।
  6. प्रारंभिक रूप से घुसपैठ की कोशिकाओं के रूप में दोनों और DsRed2 संकेत शामिल है कि कोशिकाओं स्कोर, और आसंन कोशिकाओं है कि उन है कि प्रदर्शन आंदोलन के रूप में केवल इस प्रकार का संकेत निहित स्कोर ।
    नोट: यह चरण अपने संभावित सेल-टू-सेल आंदोलन की क्षमता के लिए पहचाने गए PLS की जांच करता है; यह है क्योंकि कई प्रोटीन है कि लक्ष्य पीडी (अधिकांश संयंत्र वायरल सांसदों सहित) भी पीडी के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं को स्थानांतरित. घुसपैठ के लिए इस्तेमाल एग्रोबेक्टीरियम की एकाग्रता क्रमशः विभिन्न संरचनाओं की अभिव्यक्ति दक्षता पर निर्भर करता है । agroinfiltration के लिए, कोशिका संस्कृति कमजोर पड़ने कि सुनिश्चित करता है का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें (i) एकल कोशिकाओं के परिवर्तन, आसंन कोशिकाओं unट्रांस्फ़ॉर्म छोड़कर, (ii) अभिव्यक्ति की इसी तरह की दक्षता प्राप्त । उदाहरण के लिए, हमारे प्रयोगों के आयुध डिपो ०.०१ और ०.००५ की अभिव्यक्ति के लिए६०० -टैग PLS और मुक्त DsRed2, क्रमशः का उपयोग ।

6. कुंजी PLS Alanine स्कैनिंग का उपयोग अवशेषों की पहचान४२

  1. का प्रयोग करें मानक पीसीआर प्रोटोकॉल को बढ़ाना PLS के लिए वांछित उत्परिवर्तन, यानी, alanine के साथ लक्ष्य अमीनो एसिड अवशेषों के प्रतिस्थापन, शामिल डिजाइन प्राइमरों की एक जोड़ी को रोजगार अनुक्रम कोडिंग प्रत्येक पुस्तक के मध्य क्षेत्र के आसपास के रूप में वर्णित 21. प्राइमर डिजाइन बाहर ले और साइट के लिए साइट निर्देशित mutagenesis किट का उपयोग करें-निर्माता के निर्देश के अनुसार mutagenesis निर्देशित ।
  2. किसी भी मानक डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके परिणामी पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें, और माता-पिता (यानी, गैर-रूपांतरित) मिथाइलयुक्त और hemimethylated डीएनए को समाप्त करने के लिए DpnI के साथ ३७ ° c पर उन्हें पचा दें. शांत कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नीचे (बर्फ पर नहीं) । फिर मिश्रण को सीधे ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं४३में बदलने, और वांछित उत्परिवर्ती निर्माण के साथ कालोनियों की पहचान के रूप में ३.२ कदम में वर्णित है ।
  3. परिचय के रूप में कदम 2.2.4 में वर्णित है, के रूप में बाइनरी वेक्टर में उत्परिवर्ती constructs agroinfiltration प्रदर्शन चरण 3 में वर्णित है, और पीडी लक्ष्यीकरण का आकलन के रूप में चरण 4 और ५.१ में वर्णित है ।

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Representative Results

प्रतिनिधि डेटा, जो ईमानदारी से वर्णित प्रोटोकॉल से अपेक्षित परिणाम वर्णन और TMV सांसद PLS की पहचान, युआन एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं । 21. चित्र 1a सबसे पहले प्रमुख constructs पूर्ण लंबाई TMV सांसद (1-268), TMV सांसद PLS (पहली ५० अमीनो प्रोटीन, 1-50 के अवशेषों शामिल), और उसके alanine स्कैनिंग V4A डेरिवेटिव (के रूप में उत्पंन से जुड़े चरण २.२, ५.२ और 6) में वर्णित है, जबकि चित्र 1b संक्षेप और इन टैग किए गए प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण quantifies । चित्रा 1C विशेषता परिधीय कबरा पीडी स्थानीयकरण पैटर्न TMV सांसद--और TMV सांसद PLS के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में coexpressed पीडी मार्कर के लिए, PDCB1-DsRed2 (५.१ कदम देखें) के लिए मनाया पैटर्ंस दिखाता है । चित्रा 2a TMV सांसद--और TMV सांसद PLS के लिए--और coexpressed मुक्त DeRed2 के nucleocytoplasmic वितरण के पीडी लक्ष्यीकरण दिखाता है (५.१ कदम देखें) । अंत में, चित्रा बी एक दोनों TMV सांसद और TMV सांसद PLS द्वारा पीडी लक्ष्यीकरण के नुकसान दिखाता है एक एकल alanine प्रतिस्थापन V4A के साथ, यह दर्शाता है कि इस अवशेषों PLS संरचना या समारोह के लिए महत्वपूर्ण है; एक ही कक्ष में coexpressed पीडी मार्कर PDCB1 अभी भी पीडी को स्थानीयकरण (चरण 6 देखें).

इन आंकड़ों से पता चलता है कि यह धारणा और तकनीकी रूप से सरल प्रक्रिया प्रोटीन अंशों के व्यवस्थित उत्पादन, एक फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए उनके फ्यूजन-कार्गो प्रोटीन, और पीडी के लिए स्थानीयकरण करने की क्षमता के लिए परीक्षण एक न्यूनतम प्रोटीन अनुक्रम की पहचान कर सकते हैं पीडी लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक और पर्याप्त है, यानी, PLS. इन स्थानीयकरण डेटा की सही व्याख्या के लिए, यह एक ज्ञात पीडी प्रोटीन के साथ colocalization प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे, PDLP या PDCB परिवार के सदस्यों को16,23 या संयंत्र वायरल सांसदों में से एक है कि पीडी को क्रमबद्ध४४ . जाहिर है, colocalization पूरा होने की जरूरत नहीं है, के रूप में नहीं सभी पी स्थानीयकरण प्रोटीन एक ही पीडी को लक्षित किया जा सकता है, लेकिन पीडी मार्कर प्रोटीन के कम से एक के साथ colocalization के एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डिग्री PLS गतिविधि को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है.

Figure 1
चित्रा 1: TMV सांसद PLS की पहचान । () मुख्य का सार--संलयन TMV सांसद PLS की पहचान के लिए इस्तेमाल किया फ्यूजन constructs TMV सांसद दृश्यों, हरे बक्से; , नीले रंग के बक्से; P, प्रवर्तक; टी, टर्मिनेटर । बाईं ओर संख्या अमीनो एसिड प्रत्येक TMV सांसद टुकड़ा में शामिल अवशेषों से संकेत मिलता है । () में दर्शाए गए फ्यूजन प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का सारांश । पीडी स्थानीयकरण या nucleocytoplasmic स्थानीयकरण संगत उपसेलुलर मार्करों, PDCB1-DsRed2 और मुक्त DsRed2, क्रमशः के स्थानीयकरण के आधार पर निर्धारित किया गया था । प्रत्येक स्थानीयकरण पैटर्न का प्रदर्शन कोशिकाओं का प्रतिशत तीन स्वतंत्र प्रयोगों में निर्माण प्रति १०० स्कोरिंग व्यक्त कोशिकाओं के आधार पर दिखाया गया है. डेटा मतलब है ± मानक त्रुटियां (एसई) । () TMV mp के पीडी लक्ष्यीकरण---------TMV सांसद PLS------और पीडी मार्कर PDCB1-DsRed2 । रंग में DsRed2 संकेत बैंगनी में है; plastid autofluorescence बाहर फ़िल्टर्ड था । छवियां एकल फोकल खंड हैं । स्केल पट्टियां = 10 µm., अवकलन हस्तक्षेप कंट्रास्ट micrograph । यह आंकड़ा युआन एट अल से अनुकूलित है । 21. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: TMV सांसद, TMV सांसद PLS और उनके alanine-स्कैनिंग म्यूटेंट के पीडी लक्ष्यीकरण । () TMV सांसद का उपसेलुलर स्थानीयकरण--, TMV सांसद PLS------ () TMV mp के V4A alanine-स्कैनिंग म्यूटेंट की पीडी लक्ष्यीकरण क्षमता की हानि------और TMV सांसद PLS-। पीडी पीडी मार्कर PDCB1-DsRed2 के coexpression द्वारा visualized थे । रंग में DsRed2 संकेत बैंगनी में है; plastid autofluorescence बाहर फ़िल्टर्ड था । छवियां एकल फोकल खंड हैं । स्केल पट्टियां = 10 µm., अवकलन हस्तक्षेप कंट्रास्ट micrograph । यह आंकड़ा युआन एट अल से अनुकूलित है । 21. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल चार मुख्य घटक है: एक अनुक्रम है कि दोनों आवश्यक है और पीडी को लक्षित करने के लिए पर्याप्त है, जो उत्तरोत्तर लंबाई में कम कर रहे है कि टुकड़ों में ब्याज की प्रोटीन की व्यवस्थित विभाजन की पहचान करने की अवधारणा, परीक्षण से इनकार एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि दोनों टैग के रूप में और macromolecular कार्गो के रूप में कार्य करता है के लिए टुकड़े, और संयंत्र के ऊतकों में रहने वाले परीक्षण फ्यूजन प्रोटीन के क्षणिक अभिव्यक्ति के बाद पीडी लक्ष्यीकरण के लिए कार्यात्मक परख । ध्यान दें कि एग्रोबेक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक अभिव्यक्ति एक अपेक्षाकृत कम समय के भीतर डेटा उत्पन्न करता है, यानी, कई दिनों, ट्रांसजेनिक पौधों के उत्पादन के लिए आवश्यक महीनों की तुलना में अक्सर इसी तरह के अध्ययन में15इस्तेमाल किया.

Coexpression उपसेलुलर स्थानीयकरण मार्करों के साथ ब्याज की प्रोटीन की, जैसे, PDCB1 या मुक्त DsRed2, आमतौर पर एक multigene अभिव्यक्ति वेक्टर से किया जाता है । हालांकि, अगर एक सदिश में कई अभिव्यक्ति कैसेट का हस्तांतरण तकनीकी रूप से समस्याग्रस्त है, coexpression भी एक अलग द्विआधारी निर्माण और तरल संस्कृतियों के समकक्ष संस्करणों के संयोजन में प्रत्येक कैसेट स्थानांतरित द्वारा किया जा सकता है परिणामस्वरूप agroinfiltration के लिए एग्रोबेक्टीरियम उपभेदों । क्योंकि इस प्रोटोकॉल क्षणिक अभिव्यक्ति का इस्तेमाल करता है, बाइनरी वेक्टर स्थिर परिवर्तन के लिए चयन मार्करों ले जाने की जरूरत नहीं है, हालांकि उनकी उपस्थिति अभिव्यक्ति दक्षता के लिए हानिकारक नहीं है ।

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है और N. benthamianaमें टार्गेट कर रहा है; हालांकि, यह Arabidopsis४५,४६, एग्रोबेक्टीरियम द्वारा आनुवंशिक परिवर्तन के लिए उत्तरदायी सहित अन्य प्रजातियों के पौधे, में इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय प्रजातियों के पौधे, या यदि अंयथा वांछित के लिए, इस प्रोटोकॉल pSAT आधारित वैक्टर से सीधे क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए४१ की सूची वितरण का उपयोग अनुकूलित किया जा सकता है, के लिए द्विआधारी वैक्टर अभिव्यक्ति कैसेट स्थानांतरण की जरूरत से परहेज ।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण बिंदु संयंत्र सामग्री के अनुरूप शारीरिक और विकासात्मक स्थिति है । विशेष रूप से, सभी पौधों पूरे प्रयोग के दौरान स्वस्थ होना चाहिए, और, agroinfiltration के लिए, N. benthamiana संयंत्रों से कम 4 सप्ताह की उंर और सबसे बड़ा पत्ता के साथ 4-8-पत्ती चरण में होना चाहिए व्यास में 4-6 सेमी जा रहा है । यदि पौधों को भी युवा हैं, agroinfiltration के प्रभाव भी गंभीर हो जाएगा, अभिव्यक्ति और टैग प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप । दूसरी ओर, पुराने पौधों अक्सर पीडी24,25के चर वास्तुकला का प्रदर्शन, भी पीडी लक्ष्यीकरण पैटर्न की निरंतरता को प्रभावित.

फिर भी, एक पूरे के रूप में संयंत्र की शारीरिक स्थितियों बदलती के कारण, और विशेष रूप से अपने रूपांतरित कोशिकाओं के, प्रत्येक प्रयोग में पीडी लक्ष्यीकरण की दक्षता कुछ हद तक भिन्न हो सकते हैं. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है के लिए कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या का विश्लेषण (> 100) प्रयोग के अनुसार, और प्रत्येक प्रयोग के कम से तीन जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन करते हैं । सामान्यत:, हम एक परीक्षण किए गए अंश पीडी लक्ष्यीकरण गतिविधि को शामिल करने पर विचार करते हैं, तो यह रूपांतरित कक्षों के कम से ७०% में पीडी स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है. प्रत्येक अंश की पीडी लक्ष्यीकरण कुशलता में अंतर, उदा., पीडी-विशिष्ट कबरा संचय प्रतिमान दिखाने वाले रूपांतरित कक्षों का प्रतिशत, छात्र के t-परीक्षण, और p-मान < 0.05-0.01, के संगत द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए सांख्यिकीय संभाव्यता 95-99% से अधिक है ।

एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा है फ्लोरोसेंट टैग की स्थिति/संलयन अणु में कार्गो । कुछ पीडी-लक्षित प्रोटीन भी endoplasmic जालिका (एर) के साथ संबद्ध है, और इस संबंध में अबाधित अमीनो-टर्मिनल अनुक्रम की आवश्यकता हो सकती है । इन मामलों में, एमिनो-टर्मिनल फ्यूजन, जिसमें ब्याज की प्रोटीन टुकड़ा के carboxyl-टर्मिनस फ्लोरोसेंट टैग के अमीनो-टर्मिनस से जुड़े हुए है, जैसे, या DsRed2, इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इस टैग की डिफ़ॉल्ट स्थान निंनलिखित मामलों में बदला जा सकता है । (i) यदि अमीनो-टर्मिनल संलयन प्रयोग करने योग्य नहीं हैं- यानी, वे सार्थक उपसेलुलर स्थानीयकरण पैटर्न प्रदर्शित नहीं करते हैं, खराब व्यक्त कर रहे हैं, या फ्लोरोसेंट विश्वसनीय पता लगाने के लिए पर्याप्त संकेत उत्पंन नहीं-और अगर ब्याज की प्रोटीन करता है शामिल नहीं अमीनो-टर्मिनल सिग्नल अनुक्रम या carboxyl-टर्मिनल फ्यूजन जिसमें अमीनो-परीक्षण टुकड़ा के टर्मिनस टैग की carboxyl-टर्मिनस से जुड़े हुए है, वे प्रयास किया जाना चाहिए । (ii) carboxyl-टर्मिनल फ्यूजन भी इस्तेमाल किया जाना चाहिए अगर ब्याज के प्रोटीन अपने carboxyl-टर्मिनस पर संकेत अनुक्रम शामिल हैं. (iii) यदि ब्याज के प्रोटीन दोनों अमीनो-और carboxyl-टर्मिनल संकेतों, ऐसे जीपीआई में पाया उन के रूप में-लंगर प्रोटीन, या यदि यह एक अमीनो-टर्मिनल संकेत पेप्टाइड अभी तक अपने एमिनो-टर्मिनल फ्यूजन शामिल है प्रयोग करने योग्य नहीं है, टैग आंतरिक रखा जाना चाहिए, ( या तो अमीनो के बहाव-टर्मिनल संकेत या carboxyl-टर्मिनल संकेत के ऊपर) । प्रोटीन की आंतरिक फ्लोरोसेंट टैगिंग के लिए कुछ उपयोगी प्रक्रियाओं हमारे पहले प्रकाशन४७,४८में वर्णित हैं ।

वर्तमान में, PLS के लिए कोई ज्ञात आम सहमति अनुक्रम है । इस तरह के रूप में (५.२ कदम में) हम अनुशंसा करते हैं, शुरू में निरंतर ~100-200 अवशेषों-लंबे टुकड़े में प्रोटीन विभाजित । ये तो मनाया पीडी लक्ष्यीकरण गतिविधि या उसके अभाव के आधार पर उत्तरोत्तर कम किया जा सकता है । प्रोटीन (उदा., एनएलएस, सिग्नल पेप्टाइड्स, आदि) में मौजूद अन्य संभावित लक्ष्यीकरण संकेतों को ध्यान में रखना चाहिए. हालांकि, PLS अनुक्रम के साथ इस तरह के दृश्यों की क्षमता ओवरलैप के रूप में अज्ञात है, इन प्रोटीन क्षेत्रों में इस उत्परिवर्तन विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए ।

अब तक, इस प्रोटोकॉल के लिए एक प्रोटीन अणु21में एक एकल PLS की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । संभावित, तथापि, एक प्रोटीन एक से अधिक संकेत अनुक्रम शामिल कर सकते हैं; दरअसल मल्टीपल NLSs कई नाभिकीय प्रोटीन में वर्णित किया गया है, जिनमें गता प्रतिलेखन कारक४९हैं. इस प्रकार, जब पीडी लक्ष्यीकरण के लिए परीक्षण प्रोटीन के विभिंन टुकड़ों का विश्लेषण, यह संभव है कि एक से अधिक ऐसे टुकड़े की पहचान की जाएगी, एकाधिक PLSs जो स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकते है या synergistically की उपस्थिति का संकेत है ।

इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा है कि, निंनलिखित agroinfiltration, क्षणिक व्यक्त प्रोटीन ब्याज की उपसेलुलर स्थानीयकरण के दृश्य एपिडर्मल कोशिकाओं में सबसे अच्छा और अपेक्षाकृत संकीर्ण विकास के स्तर पर हासिल की है । जब आवश्यक हो, इस सीमा ट्रांसजेनिक पौधों है कि छुरा अपने ऊतकों और कोशिका प्रकार के अधिकांश में परीक्षण प्रोटीन के प्रत्येक व्यक्त उत्पादन से दूर किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल वायरल सांसदों या अंय पीडी-लक्षित प्रोटीन है कि केवल पौधों की प्रजातियों है कि क्षणिक आनुवंशिक परिवर्तन के लिए उत्तरदाई नहीं है में समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं होगा ।

जब तक हम TMV सांसद के एक PLS की पहचान के लिए इस तकनीक विकसित की है, यह किसी भी अंय संयंत्र वायरल सांसदों में या संयंत्र अंतर्जात प्रोटीन कि पीडी, क्षणिक या स्थाई रूप से स्थानीयकरण में PLSs की खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, यदि उपयुक्त उपसेलुलर स्थानीयकरण मार्करों के साथ संयुक्त४७, इस प्रोटोकॉल पौधों में ब्याज की प्रोटीन के भीतर कई अंय लक्ष्यीकरण संकेतों की पहचान के लिए उपयुक्त है ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

अंतरिक्ष की कमी के लिए, हम ज्यादातर समीक्षा लेख उद्धृत, और हम अपने सहयोगियों के लिए माफी मांगता हूं जिसका मूल काम उद्धृत नहीं किया गया । विद्याचरण प्रयोगशाला में काम NIH, NSF, USDA/निफा, भाट, और बीएसएफ से विद्याचरण के लिए अनुदान द्वारा समर्थित है, और S.G.L. प्रयोगशाला NIH और संयंत्र विकृति विज्ञान और संयंत्र के विभागों से धन का समर्थन किया है-सूक्ष्म जीवविज्ञान S.G.L. के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166

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