Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК

JoVE Journal
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hernandez, A. J., Richardson, C. C. Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins. J. Vis. Exp. (120), e55312, doi:10.3791/55312 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Репликация ДНК является сохраняющимся особенностью всех клеточной жизни. В то время как идентичность и количество компонентов репликации варьироваться в широких пределах, общие механизмы являются общими для эволюции 1. Здесь мы опишем гель на основе, разрывные кинетических экспериментов, с использованием радиоактивных субстратов, направленных на понимание кинетики отстающей нити синтеза ДНК в пробирке компонентами Т7 replisome. Механизм репликации бактериофага Т7 является очень простой, состоящий только из четырех белков (ДНК - полимеразы, GP5, а его коэффициент процессивности, E.coli тиоредоксин, бифункциональные праймаза-хеликаза GP4 и связывания одноцепочечной ДНК белка, GP2. 5) 2. Эта особенность делает его привлекательным модель системы для изучения биохимических консервативных механизмов, участвующих в репликации ДНК.

Особый акцент делается на формирование рибонуклеотид праймеров Т7 ДНК праймаза, а Criticaл шаг в инициации синтеза ДНК. Кроме того, можно также рассмотреть использование этих праймеров ДНК-полимеразы Т7 или другие белки репликации путем включения их в реакционной смеси. Т7 праймаза-хеликаза, gp4, катализирует образование праймеров для синтеза ДНК в специфических последовательностей ДНК, называемых праймаза сайты узнавания, или ССБ (5'-GTC-3 '). Цитозин в ССБ маскировочная, важно для распознавания сайта, но не копируется в продукт 3. Первым шагом в синтезе праймера GP4 предполагает формирование динуклеотиде pppAC, который затем распространяется на тример, и в конечном итоге к функциональным тетрануклеотидных праймеров pppACCC, pppACCA или pppACAC в зависимости от последовательности в шаблоне 4. Эти праймеры могут быть использованы с помощью ДНК - полимеразы Т7 для инициации синтеза ДНК, который также является процессом gp4 при содействии 5, 6. В связи с этим, праймазадомен стабилизирует чрезвычайно короткие tetraribonucleotides с шаблоном, предотвращая их диссоциации, входит в зацепление ДНК - полимеразы в форме , способствующей обеспечению праймера / шаблон в полимераза активного сайта 7. Эти шаги (синтез РНК праймера, праймера для передачи обслуживания полимеразы и расширения) повторяются в нескольких циклах, чтобы повторить отстающей нити и должны быть согласованы с репликацией ведущей нити.

Анализы, описанные здесь, обладают высокой чувствительностью и могут быть выполнены в умеренном сроки. Тем не менее, они являются относительно низкими пропускной способности и большое внимание должно быть осуществлено в использовании и утилизации радиоактивных материалов. В зависимости от скорости, при которой реакция протекает, можно было бы возможность использовать более быстрого резкого охлаждения инструмента для достижения пробы на временных масштабах, поддающихся для содержательного анализа времени реакции курсов в любом неуклонный или предварительно установившемся состоянии. В последнее время мы использовали анализы описанные здесь, чтобы обеспечить evidencе важности высвобождения праймера из праймаза домена GP4 в инициации Окадзаки фрагментов. Кроме того, мы нашли доказательства регуляторной роли Т7 одноцепочечной ДНК - связывающего белка, gp2.5, в содействии эффективному формированию и использованию 8 праймера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Соблюдайте все институциональные правила, касающиеся безопасного использования и утилизации радиоактивных материалов, в том числе, но не ограничиваясь этим, использование средств индивидуальной защиты, такие как перчатки, защитные очки, лабораторный халат, а также соответствующие акриловые щиты.

Примечание: Стандартный буфер состоит из 40 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 50 мМ глутамата калия, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА (этот буфер предварительно сделанный в концентрации 5х) и 0,3 мМ каждого из дНТФ. Белки репликации Т7 очищены , как описано 8, 9, 10. Одноцепочечной ДНК, содержащий единственный Т7 распознавания праймаза сайт (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') могут быть приобретены из различных синтеза ДНК компаний (длина оцДНК может зависеть от фермента выбора, для T7 праймаза, пентамер минимальная длина шаблона для синтеза полной длины праймера 11, так как зашифрованное С имеет важное значение, однако, если праймер должен быть расширен с помощью полимеразы, дополнительные нуклеотиды должны присутствовать на 3' - конце шаблона. Реакции инициировали добавлением конечной концентрации 10 мМ MgCl 2 и инкубировали при 25 ° С. Ручной отбор проб хорошо подходит для временных точек 5 секунд или больше. Если моменты времени короче, которые необходимы, рекомендуется использовать инструмент потока быстрого резкого охлаждения для получения точных данных.

1. множественным оборот Праймер реакции синтеза путем ручного отбора проб

  1. Перед началом эксперимента, аликвоту 2 мкл буфера формамиде красителя (93% (об / об) формамида, 50 мМ ЭДТА, 0,01% cyanol ксилол и 0,01% голубой бромфениловый) в 8 мл 1,5 полипропиленовые пробирки. В общем, количество трубок равно числу временных точках анализируемых.
  2. Готовят 20 мкл смеси в буфер , состоящий 1x, 0,1 мМ АТФ и CTP, 0,25 мКи / мл [α- 32 P] CTP, 0,1 мкМ ССДшаблон Н.А., и 0,1 мкМ gp4 (выраженное в виде концентрации гексамерной - 0,6 мкМ мономера).
  3. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Удалить 2 мкл смеси с использованием пипетки и смешивают с 2 мкл буфера формамид красителя в 1,5 мл трубки, полученного на стадии 1.1 для без контроля реакции (время ноль).
  5. Добавляют 2 мкл 0,1 М MgCl 2 в реакционной смеси (до конечной концентрации 10 мМ).
  6. Вручную вывести 2 мкл образцов реакционных смесей с использованием пипетки на 10 с интервалами и смешивают с формамиде красителем predispensed в 1,5 мл пробирки, приготовленным на стадии 1.1.
  7. Образцы тепла при 95 ° С в течение 5 мин в тепловом блоке.
  8. Загрузите аликвот образцов на денатурирующем геле. Мелкие продукты праймера tetraribonucleotide синтезированные Т7 праймаза разрешаются наилучшим образом на 0,4 мм толщиной 25% акриламид: бис-акриламид (19: 1), 3 М мочевины, 1x КЭ (100 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА).
  9. Поместите весь гель на хроматогPHY бумаги и накрыть полиэтиленовой пленкой. Сухой гель с использованием гель-осушитель.
  10. Готовят серии разведений на оставшуюся часть реакционной смеси и определить тот же объем загруженного на гель на хроматографическую бумагу, то есть, SPOT 4 мкл разведения , если были загружены 4 мкл образца.
    Примечание: Это будет служить в качестве стандартной кривой для определения концентрации продуктов , образующихся в ходе реакции. Например, пятикратных разведений с использованием буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) хорошо работают, охватывающих диапазон 1:25 до 1: 15625 (5 2 -5 6), но их разбавленные можно регулировать в зависимости от уровня активности.
  11. Expose сухой гель и стандарт, используя экран Phosphorimager. Количественно радиоактивность в серии разведений и построить калибровочную кривую , как описано 8, 12
    Примечание: Включение ДНК - полимеразы Т7 в реакционной смеси позволяет Exaмое использование tetraribonucleotide праймеров этим ферментом. Оптимально, концентрация полимераза должна быть насыщающей для упрощения интерпретации данных. Концентрация полимераза 0,4 мкМ или выше дает хорошие результаты. Кроме того, эффект от других белков, таких как одноцепочечных ДНК-связывающие белки, либо на праймером синтеза или отстающей нити инициации можно рассматривать таким образом.

2. множественным оборот Праймер реакции синтеза с помощью экспресс-закалке инструмента

  1. Приготовление реакционных смесей
    1. Подготовьте 400 мкл раствора А, содержащий 1х буфер, 0,2 мкМ gp4 гексамерный, 0,2 мкМ оцДНК шаблон, 0,6 мМ дНТФ, 0,2 мМ АТФ и СТР ( в том числе 0,5 мКи / мл [альфа- 32 Р] CTP.
    2. Подготовьте 400 мкл раствора Б, содержащий 1x буфера и 20 мМ MgCl 2.
  2. Эксплуатация прибора потока быстрого резкого охлаждения
    1. Включите рэпинструмент потока ID-закалка; после того, как появится главное меню, тип 7 ​​на приборной клавиатуре для перемещения водителя шприца в исходное положение.
    2. Открыть буфер позиции шприц "ГРУЗ".
  3. Загрузка буфера шприцы
    1. Приложить 10 мл шприц, содержащий буфер к порту привода шприца. Изменение шприца положение ручки, чтобы "ГРУЗ".
    2. Используя 10 мл шприцы, заполнить инструмент буферного резервуара А и В с 10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и заполнить шприц C с раствором быстрого охлаждения (250 мМ ЭДТА и 0,2% ДСН). Удалите пузырьки воздуха, нажав плунжеры и выход.
    3. Изменение положения ручки к "FIRE". Тип 2 для регулировки положения панели водителя шприц. Нажмите "ADJUST DOWN" кнопку, чтобы опустить шприц, пока буфер не выходит из цикла выхода: (7-идет вниз непрерывно; 8-большой шаг вниз; 9-маленький шаг вниз). Введите "ESC" для возврата в главное меню.
  4. Мытье трубки
    1. AttACH выхода линии вакуума. Изменение образца ручек "FLUSH". Закрыть буфер шприц, установив ручки в горизонтальное положение. Включите вакуум и опустите петли 2 заподлицо в H 2 O в течение 10 секунд, а затем окунуть в MeOH в течение 10 с. Сухие петли путем всасывания воздуха в течение ~ 15 секунд, или до полного высыхания.
  5. Загрузка образцов
    1. Изменить образец положение ручки "ГРУЗ". Поместите раствор А в шприц емкостью 1 мл. Вставьте шприц в один из портов образца нагрузки. Повторите эти действия для раствора Б, и поместите в противоположном порту образца нагрузки.
  6. Сборник временных точках
    1. В главном меню введите 1 для запуска быстрого охлаждения потока. Введите время реакции (ы) и нажмите "ENTER". Номер цикла реакции на использование будет отображаться. Переход к требуемой реакции петли. Повторите процедуру промывки на этапе 2.2.4.
    2. Включите образцы ручек "Load". Реакция Нагрузка смешивается в циклах выборки пока только за пределами центральной смесительной камере. Включите все ручки, чтобы "FIRE ". Убедитесь, что все ручки находятся в правильном положении.
    3. Поместите 1,5 мл трубки на конце цикла выхода. Нажмите кнопку "GO", чтобы запустить реакцию. Повторите процедуру промывки на этапе 2.2.4. Обновить буфер шприцы А и В, пока они не попали в водителя.
    4. Повторите шаги 2.2.6.2-2.2.6.3 для каждой нужной точке времени. Исключение: Не загружать раствор , содержащий стартовый реагент (т.е., MgCl 2 в данном случае) , когда гашение контроль нулевого момента времени.
    5. По окончании сбора образцов, введите "ESC" для возврата в главное меню. Нажмите "7" для возврата драйвера буфера шприца в исходное положение.
  7. Инструмент очистки
    1. Удалить реакционные шприцы смеси. Поверните ручку загрузки образца в положение "LOAD". Под вакуумом, промойте каждую петлю образца с 10 мл 0,2 N NaOH, а затем 10 мл 0,3 NH 3 PO 4 и 10 мл метанола.
    2. Поверните шприц ручки в положение "LOAD". Надавите на всех 3 СыраИнге плунжеры для получения реакции и утолить буферов. Вымойте шприцы 5 мл H 2 O , по крайней мере в два раза.
    3. Заполните шприцы снова с 5 мл H 2 O и поверните ручки в положение "FIRE". Изменение позиции ручки и включите вакуум для удаления H 2 O. Flush как на этапе 2.2.4. Выключите прибор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты анализируют , как описано в пунктах 1.7-1.12. Кроме того, ДНК-полимеразы Т7 и другие белки репликации могут быть добавлены в реакционную смесь, чтобы проанализировать их влияние на синтез праймера или расширения.

3. Single-оборот Праймер реакции синтеза

Примечание: Single-оборот праймера синтез / расширения анализы проводят аналогично множественным оборота реакций, с помощью нескольких основных отличий: эти анализы следуют преобразование меченного АТФ в грунтовке или продуктов удлинения, однако концентрация субстратов и белки являются consideraБлай выше. Кроме того, для достижения точностью до миллисекунд проведения анализа реакции синтеза праймер, необходимо использовать машину потока быстрого резкого охлаждения.

  1. Приготовление реакционных смесей.
    1. Подготовить 400 мкл раствора А, содержащий 1x буфер, 3 мкМ gp4 гексамер, 6 мкМ оцДНК шаблон, 0,6 мМ дНТФ, 1 мМ CTP и 2 нМ [γ- 32 P] ATP. Подготовьте 400 мкл раствора Б, содержащий 1x буфера и 20 мМ MgCl 2.
  2. Операция потока Rapid-закалка
    1. Проведение реакций, как описано в шаге 2.2. При желании добавить ДНК-полимеразы Т7 или Т7 одноцепочечной ДНК-связывающий белок в концентрации 15 мкМ и 20 мкМ, соответственно. В этом случае расширение продукты накапливаются в режиме времени, который позволяет для ручного отбора пробы реакции.

Анализ 4. Данные

  1. Fit кривые прогресса продукт нелинейными наименьшихМодели квадратов с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, способных наименьших квадратов припадки и / или численного интегрирования. Подробности операции будут изменяться в зависимости от программного обеспечения, используемого, но ниже, являются генерализованные формы уравнений, используемых для подгонки данных.
  2. Определить скорость образования продукта множественных реакций синтеза праймера оборот путем подгонки кривых прогрессировать к линейному уравнению. Если существует значительная кривизна, используют метод начальной скорости 13, 14 путем подгонки данных к одной-экспоненциальной функции: у = А (е - к т), где Y представляет собой концентрацию продукта, амплитуда реакции, к- константа наблюдаемая скорость, т время, в секундах. Наклон касательной линии в момент времени = 0 начальная скорость.
    Примечание: Установить предварительно установившегося синтез состояния праймера реакции на линейное уравнение или к предварительно установившегося состояния лопнуть уравнения у = А (е - к BUпервый т) + скорость сс т, где А амплитуда реакции, к серийной съемки наблюдаемая константа скорости до стационарного состояния всплеска, сс скорость является Стационарная скорость сс = к кот [Фермент]), т время , в считанные секунды. Fit одного оборота реакции синтеза праймера кривые на одной-экспоненциальной функции у = прогресс (е - к т). В случае GP4, соответствует данным численным интегрированием 15, в модели с тремя шагами конденсации NTP, где каждый промежуточный находится в равновесии с ферментом, с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты , показанные на рисунке 1А , были получены , как описано в шаге 1 протокола, т.е. вручную путем выборки реакции синтеза праймера , катализируемый GP4 в условиях множественного оборота. Здесь целый ряд продуктов , после того, как гель - электрофореза можно наблюдать с помощью CTP , меченного 32 P в a-положении в реакциях синтеза праймера (Рис . 1А) Меченый предшественник, CTP, показывает самую высокую подвижность и мигрирует в сторону нижней части геля, с последующим медленным мигрирующие видов, соответствующих ди-, три- и tetraribonucleotides синтезируемых GP4. В зависимости от продолжительности инкубации и контекста последовательности матрицы, можно наблюдать дополнительные меченые продукты , соответствующие высших олигомеров (pentaribonucleotides и т.д.). Кривая Протекание реакции изображаться с первого определения концентрации полной длины праймеров (то есть, тетра-и pentaribonucleotides) в каждой временной точке и графика концентрации праймеров, синтезированных в зависимости от времени.

При получении данных от стационарного состояния, множественным оборот экспериментов относительно легко, информационное содержание данных несколько ограничена, так как данные в значительной степени определяется связывания субстрата и события высвобождения продукта, то есть., Эти события , как правило , доминируют или в значительной степени определяют K M и K кошки 16 значений. Если реакция наблюдается при достаточно коротких временных точках, до установления устойчивого состояния (другими словами, до установившегося состояния) гораздо большее содержание информации может быть получена из кинетических экспериментов. Исследование реакций в предварительно установившемся состоянии может обеспечить кладезь информации. Например, если "предварительно устойчивое состояние взрыв" образования продукта наблюдается, то хорошим показателем того, что выпуск продукта является лимитирующей стадией Iп реакции. Кроме того, можно выделить скорость образования продукта (или шаг химии) из предварительно установившегося состояния фазы реакции. В отличие от этого, если взрыв образования продукта не наблюдается, то это свидетельствует о том, что установившейся скорости ограничивается либо химической стадии или на стадии предшествующего ему, и что высвобождение продукта является быстрым по сравнению.

Когда быстрого резкого охлаждения инструмента используется для изучения реакции , катализируемой GP4 в масштабах времени в диапазоне от секунд до нескольких миллисекунд (шаг 2 из протокола), то очевидно , что накопление праймера не является линейным, но отображает двухфазный профиль (рис 1B, сплошная линия). Это диагностический результат демонстрирует доказательства для предварительного стационарного состояния всплеску накопления продукта, который наводит на мысль, что образование продукта является быстрым и релиз ограничивающим скорость в стационарном состоянии. Другие ферментные системы не могут показать этоповедение. Например, гипотетическая кривая прогресса представляется что приведет , если образование праймера GP4 не протекало с предварительно установившемся режиме серийной съемки (Фиг.1В, пунктирная линия). В таких случаях, толкование было бы, что образование продукта, или шаг предшествующий ему, является стадией, лимитирующей скорость.

Другой вариант осуществления предварительного устойчивого состояния кинетики является одним оборот эксперимент, в котором низкая концентрация меченого субстрата связывается с насыщением количество фермента (а также ДНК и CTP, в случае GP4). Этот тип эксперимента уникально подходит для предоставления информации о формировании и распаде промежуточных частиц в процессе превращения субстрата в продукт. В GP4 катализируемой реакции (этап 3 протокола), образование праймера является результатом трех nucleotidyl реакций переноса. В последнее время мы использовали одного оборота реакций синтеза праймера раскрыть информациюо промежуточных праймеров 8 (рис 1C) путем подгонки зависящих от времени накопления и исчезновения ди-, три- и продуктов tetraribonucleotide к последовательной модели трех nucleotidyl шагов передачи, где рибонуклеотид промежуточные находятся в равновесии с GP4.

Рисунок 1
Рисунок 1: Кинетический анализ синтеза праймера Т7 праймаза-геликазы. (A) Временной ход формирования праймера GP4 на оцДНК с одним ССБ. Образцы были удалены перед добавлением MgCl 2 (время = 0) и пробы с интервалами после его добавления. Продукты указаны слева от изображения геля. (B) Сплошная линия: Грунтовка образование по GP4 демонстрирует предварительно устойчивое состояние взрыв. Значения представляют собой среднее значение по крайней мере, в трех независимых экспериментах. Пунктирная лине: Представление кривой хода реакции , если gp4 катализируемой реакция протекает без предварительного стационарного состояния пакета. Модифицированный от 8. (C) Single-оборот синтеза праймера GP4. Слева: временной ход формирования тетрамера. Справа: участок промежуточного образования в зависимости от времени. Значения представляют собой среднее значение по крайней мере, в трех независимых экспериментах. Данные соответствуют численным интегрированием; сплошные линии показывают подгонку. Модифицированный от 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Самым важным фактором при проведении этих экспериментов является наличие высокой активности очищенного фермента. В ходе работы с GP4, например, мы обнаружили, что хранение очищенного фермента в буфере (20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), содержащей 50% глицерина при температуре от -20 & deg; С приводит к уменьшению удельная активность препарата в течение нескольких месяцев. Поэтому мы теперь флэш-замораживающие небольшие аликвоты очищенного GP4 в 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ TCEP, и 10% глицерина с использованием жидкого азота и хранить их при температуре -80 ° С. При использовании прибора потока быстрого резкого охлаждения, особенно при приобретении нескольких первых образцов, важно, чтобы реагенты, чтобы достичь температуры реакции (при комнатной температуре) до начала реакции. Кроме того , большое внимание следует тщательно очистить трубы (этап 2.2.4 протокола) после каждой временной точке, а оставшаяся часть резкого охлаждения реагента влиния будет в значительной степени ингибировать активность фермента, что приводит к ошибочным результатам. Другое соображение включает в состав полиакриламидного геля и его обработку. Продукты в реакциях синтеза праймеров, катализируемые GP4 не решают хорошо гелей с менее чем по меньшей мере, 20% акриламид. На самом деле, в 15% гелей, нуклеотидная субстрат и все продукты реакции мигрируют в качестве нечеткого зоны радиоактивности. Поэтому крайне желательно, чтобы отрегулировать процент акриламид, соответственно, если малые рибонуклеотид продукты должны быть проанализированы. Основным недостатком использования гелей, содержащих высокий процент акриламида, что они не очень хорошо прилипают к бумаге; Поэтому большое внимание должно быть использован для передачи их на хроматографическую бумагу для сушки. И, наконец, гели, содержащие высокий процент акриламида, как правило, трещины в вакуумных сушилок с питанием от геля. Мы считаем, что понижение температуры сушки до 65 ° С приводит к менее растрескивание гелей. В качестве альтернативы, гели могут быть подвержены люминофорногоImager экраны без сушки.

Есть большое количество вариаций в условиях реакции и реагентов, которые могут быть проверены с помощью этого протокола, и которые мы проводим в наших исследованиях GP4, начиная от тестирования ферментативную поведение мутантных ферментов, исследуя влияние добавления предполагаемого мелко- молекулы ингибиторов или активаторов или альтернативные субстраты, такие как аналоги, нуклеотидные а также альтернативные ДНК-матриц, или ион металла кофакторов. Протокол, описанный выше, использует комнатной температуры в качестве температуры реакции. Если другая температура реакции желательно, большинство быстрого закалочные инструменты содержат клапан, который позволяет подключать прибор к водяной бане с тепловым контролем. В тех случаях, когда электрофоретического разделения продуктов не является удовлетворительным, в частности, если реакционный буфер содержит высокую концентрацию (> 200 мМ) соли, желательно, чтобы рассматривать образцы после закалки с 1-10 единиц щелочной фосфатазы и инкубировать при 37 ° С в течение по крайней мере 30 минут. Это приведет к удалению терминала трифосфатов из НПТ и рибонуклеотид продуктов и повышения их электрофоретического разделения. Тем не менее, это имеет смысл только если нуклеотидная маркирован в альфа-положении.

Использование быстродействующего закалочной инструмент не удобен для анализа с высокой пропускной способностью. Опытный пользователь может выполнить протокол потока быстрого резкого охлаждения, описанный здесь, начиная с подготовки проб, собирая около 18 временных точек, а также очистки прибора примерно через два часа. Дополнительное ограничение времени является время, необходимое для гель-электрофореза, подвергание геле и анализа данных. Другим ограничением является то, что типичный эксперимент требует от 500 до 1000 мкл реакционного объема, и получение достаточного фермента может быть сложной задачей в случае белков, которые не экспрессируются эффективно.

Существует большой интерес к разработке анализов, которые позволяют с высокой пропускной скрининг примаактивность С.Е., в частности , в разработке новых антибактериальных терапевтических средств 17, 18. Несмотря на достигнутые успехи в развитии нерадиоактивных, непрерывные анализы для праймаза активности, эти анализы страдают от двух основных ограничений и , таким образом , исключает их использование в быстрых кинетических исследований, то есть, не имеют достаточного временного разрешения и чувствительности продукта. Поэтому, радиоактивный, разрывная анализ, описанный здесь в настоящее время является золотым стандартом в кинетическом рассмотрении праймаза активности GP4 и primases ДНК в целом. Более сложные варианты осуществления протокола, описанного здесь, могут быть использованы при определении кинетического пути фермента катализируемой реакции с использованием прибора потока быстрого резкого охлаждения, например, в импульсно-чейз экспериментов, предназначенных для определения кинетической разбиение субстратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris pre-set crystals
pH 7.5
SIGMA T4128
Tris base SIGMA 93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate SIGMA G1501 
Magnesium chloride hexahydrate Mallinckrodt Chemicals 5958-04
1,4-Dithiothreitol J.T. Baker F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate MP Biomedicals 811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate Mallinckrodt Chemicals 4931-04
[α-32P] CTP PerkinElmer BLU508H radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP PerkinElmer BLU502A radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP  Affymetrix 77100 four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP Epicentre RN02825 part of NTP set
ssDNA constructs Integrated DNA Technologies N/A custom sequences 
methanol  Macron Fine Chemicals 3017-08
formamide Thermo Scientific 17899
bromophenol blue SIGMA B8026 
cylene xyanol  SIGMA X4126 
acrylamide SIGMA A9099 Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide SIGMA M7279  Toxic
Urea Boston Bioproducts P-940
Boric acid Mallinckrodt Chemicals 2549
Rapid Quench-Flow Instrument  Kintek Corp. RQF-3 
Kintek Explorer Kintek Corp. N/A
Kaleidagraph  Synergy Software N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. 2nd, W.H. Freeman. (1992).
  2. Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
  3. Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, (22), 10638-10642 (1992).
  4. Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25, (10), 2199-2208 (2006).
  5. Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11, (5), 1349-1360 (2003).
  6. Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272, (19), 12446-12453 (1997).
  7. Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38, (13), 4372-4383 (2010).
  8. Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (21), 5916-5921 (2016).
  9. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (14), 6339-6343 (1995).
  10. Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267, (21), 15022-15031 (1992).
  11. Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
  12. Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276, (52), 49419-49426 (2001).
  13. Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412, (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587, (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41, (4), e56 (2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, (4), 327-339 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics