अलग और प्रवाह cytometry द्वारा अग्न्याशय mesenchyme की कोशिकाओं का विश्लेषण

Developmental Biology
 

Summary

यहाँ, हम भ्रूण, नवजात और वयस्क माउस ऊतकों से अग्न्याशय microenvironment में कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन, mesenchymal कोशिकाओं के अलगाव पर ध्यान दे। इस विधि के आदेश बाह्य संकेत है कि अग्न्याशय विकास, समारोह, और tumorigenesis विनियमित स्पष्ट करने में सेल जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन का स्राव की प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है।

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Epshtein, A., Sakhneny, L., Landsman, L. Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55344, doi:10.3791/55344 (2017).

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Abstract

Introduction

ऊर्जा homeostasis और स्तनधारियों में भोजन पाचन उचित अग्नाशय समारोह पर निर्भर करते हैं। बहि और अंत: स्रावी: वयस्क अग्न्याशय दो मुख्य सेलुलर डिब्बों के शामिल है। बहि कोशिकाओं, कोष्ठकी कोशिकाओं है कि उत्पादन और, पाचक एंजाइम और डक्ट कोशिकाओं है कि पेट के लिए इन एंजाइमों परिवहन छिपाना कुल अग्नाशय बड़े पैमाने पर 1 से 80% से अधिक धरना भी शामिल है। अंत: स्रावी कोशिकाओं है, जो इंसुलिन के उत्पादन बीटा कोशिकाओं और ग्लूकागन उत्पादक अल्फा कोशिकाओं में शामिल हैं, Langerhans की islets कि बहि ऊतक में एम्बेडेड और हार्मोन स्रावित रक्त शर्करा की मात्रा 2 विनियमित करने के लिए कर रहे हैं में आयोजित कर रहे हैं।

अग्नाशय कोशिकाओं को एक अत्यधिक विनियमित, multistep प्रक्रिया 3 के माध्यम से अपने विभेदित भाग्य का अधिग्रहण। सबूत बताते हैं कि न्यूरोनल, endothelial, और mesenchymal कोशिकाओं द्वारा प्रदान की बाह्य संकेतों अग्नाशय सेल भेदभाव और टी में प्रसार मार्गदर्शनवह भ्रूण 3, 4, 5। एक उदाहरण जल्दी अग्नाशय व्यापारियों 6 के विनिर्देश के लिए महाधमनी की आवश्यकता है। विकास में बाद में, endothelial कोशिकाओं दोनों अग्नाशय अंत: स्रावी और बहि कोशिकाओं के विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए और बीटा सेल भेदभाव 4, 6, 7 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। Mesenchymal कोशिकाओं मुख्य रूप से वृद्धि कारक Fgf10 8, 9 के स्राव के माध्यम से, अस्तित्व और आम अग्नाशय progenitors के विस्तार का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है। हम आगे कहा कि इन कोशिकाओं को भ्रूण अग्न्याशय 5 में अंत: स्रावी और बहि व्यापारियों के प्रसार के साथ-साथ की विभेदित कोशिकाओं (कोष्ठकी और बीटा कोशिकाओं सहित) का समर्थन दिखाया है। हाल ही में, mesenchymal कोशिकाओं आगे थेअंत: स्रावी कोशिकाओं भेदभाव 10 विनियमित करने के लिए दिखाया गया है।

वयस्क में, बीटा सेल समारोह और बड़े पैमाने पर उनकी microenvironment में कोशिकाओं, न्यूरोनल, प्रतिरक्षा, और endothelial कोशिकाओं, साथ ही pericytes 11, 12, 13 सहित पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है। चोट के दौरान, endothelial कोशिकाओं अग्न्याशय के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भर्ती करने के लिए बीटा सेल प्रतिकृति 13 बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। Endothelial कोशिकाओं आगे इंसुलिन अभिव्यक्ति और बीटा सेल समारोह 14 समर्थन करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है। हमने हाल ही में बीटा सेल समारोह 11 के लिए आइलेट pericytes की आवश्यकता का प्रदर्शन किया। अन्त में, अग्नाशय स्ट्रोमा की कोशिकाओं अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता (PDAC) 15, 16 की प्रगति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, आईडीकि मार्गदर्शन अग्न्याशय विकास, समारोह, और tumorigenesis बाह्य संकेतों की इकाई काफी हद तक अनजान रहे हैं।

अग्न्याशय microenvironment की कोशिकाओं द्वारा प्रदान संकेतों की पहचान जीन और प्रोटीन इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त निस्र्पक की आवश्यकता है। इस क्रम में और / या सेल लाइनों की स्थापना पर जीन अभिव्यक्ति और प्रोटिओमिक विश्लेषण प्रदर्शन करने में अग्न्याशय से इन कोशिकाओं को अलग करने पर निर्भर करता है। यहाँ, हम एक विधि का प्रस्ताव या तो immunofluorescently लेबल की कोशिकाओं या कोशिकाओं फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त की ऊतक enzymatic पाचन और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के उपयोग से अग्न्याशय microenvironment के mesenchymal कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अलग और, भ्रूण नवजात, और वयस्क अग्न्याशय 5, 17 की mesenchymal कोशिकाओं पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) -expressing विश्लेषण करने के लिए किया गया था।

Protocol

प्रयोगों से तेल अवीव विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान पर समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित की गई।

1. चूहे से अग्नाशय के ऊतक के अलगाव

  1. वयस्क चूहों के लिए:
    1. 0.4 मिलीग्राम / एमएल collagenase पी और 0.1 एनजी / एमएल DNase मैं हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HbSS) में भंग: पाचन बफर तैयार करें। हौसले से 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में माउस प्रति बफर के 5 एमएल तैयार करने और उपयोग करें जब तक बर्फ पर उन्हें रखने के लिए।
    2. संस्थागत दिशानिर्देश के अनुसार चूहों euthanize।
    3. अग्न्याशय दूर करने के लिए प्रत्येक माउस काटना (शिक्षा के लिए, कृपया संदर्भ 18 देखें); HBSS युक्त एक संस्कृति डिश में जगह है। 4 टुकड़े - यह एक stereomicroscope के तहत इस चरण में प्रदर्शन करने के लिए, और, पाचन दक्षता बढ़ाने 2 में ऊतक में कटौती संभव है।
    4. अग्नाशय के ऊतक एक ट्यूब पाचन बफर (कदम 1.1.1 में तैयार) युक्त में रखें। बर्फ पर ट्यूबों रखें जब तक सभी चूहों को विच्छेदित कर रहे हैं और अग्नाशय के ऊतकोंएकत्र किया हुआ।
    5. शेष चूहों के साथ 1.1.4 - दोहराएँ 1.1.2 कदम।
  2. भ्रूण और नवजात चूहों के लिए:
    1. 0.4 मिलीग्राम / एमएल collagenase पी और 0.1 एनजी / एमएल DNase मैं HBSS में भंग: पाचन बफर तैयार करें। एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में माउस प्रति बफर के 2 मिलीलीटर - प्रसव के बाद दिन 7 (P7) या छोटी पर भ्रूण और पिल्ले के लिए, हौसले से 1.5 तैयार करते हैं। एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में माउस प्रति बफर के 4 एमएल - P7 या पुराने पिल्ले के लिए, 3 तैयार करते हैं। बर्फ पर उपयोग करें जब तक रखें।
    2. संस्थागत दिशानिर्देश के अनुसार चूहों euthanize। भ्रूण के लिए, अपनी माँ के गर्भाशय से सभी भ्रूण को हटाने और उन्हें एक 10 मिमी संस्कृति पीबीएस युक्त पकवान में जगह है। एक समय में एक भ्रूण काटना।
    3. अपनी पीठ पर माउस रखना, अपने सिर अन्वेषक से दूर ओर इशारा करते हैं। ठीक संदंश का प्रयोग, माउस डायाफ्राम 18 अप करने के लिए उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए midline पर पेट की त्वचा और खुले खींच।
    4. ठीक संदंश का प्रयोग, जिगर शनिवार को अलगवापस पेट की दीवार ओम। माउस पूंछ की ओर एक सतत गति के साथ, (जिगर, पेट, तिल्ली, आंतों, गुर्दे, और अग्न्याशय सहित) आंतरिक अंगों को बाहर निकालना और उन्हें HBSS युक्त एक संस्कृति डिश में जगह है।
    5. एक stereomicroscope के तहत, यकृत और अग्न्याशय को बेनकाब करने के गुर्दे (चित्रा 1) को हटा दें। ठीक संदंश का प्रयोग, पेट, ग्रहणी से अग्न्याशय अलग है, और अंत में, तिल्ली से।
    6. अग्नाशय के ऊतक एक ट्यूब पाचन बफर (कदम 1.2.1 में तैयार) युक्त में रखें। P14 या पुराने पिल्ले के लिए, पाचन क्षमता बढ़ाने के लिए 2 टुकड़ों में ऊतक में कटौती। जब तक सभी चूहों को विच्छेदित कर रहे हैं और अग्नाशय के ऊतकों एकत्र बर्फ पर ट्यूबों रखें।
    7. शेष चूहों के साथ 1.2.6 - दोहराएँ 1.2.2 कदम।

2. अग्न्याशय पाचन

  1. agitat के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक में अग्नाशय के ऊतक (पाचन बफर में) युक्त ट्यूबों सेते700 rpm पर आयन। 15 मिनट के बाद, स्वयं उन्हें 3 inverting द्वारा नलियों हिला - 4 बार और उन्हें हीटिंग ब्लॉक में वापस जगह है।
    ध्यान दें: आंदोलन क्षमताओं के बिना एक हीटिंग ब्लॉक का उपयोग करते हैं, ट्यूब पलटना हर 5 - 10 मिनट। सुनिश्चित करें कि ऊतक ठीक से पच जाता है सुनिश्चित करें। यदि नहीं, ऊष्मायन से पहले छोटे टुकड़ों में ऊतक में कटौती या आंदोलन वृद्धि हुई है।
  2. ऊतक पाचन बंद करो, बर्फ पर ट्यूबों की जगह और प्रत्येक ट्यूब ठंड HBSS के 10 एमएल जोड़ने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और 5 मिनट के लिए 300 XG और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  3. फिर से निलंबन:
    1. वयस्क चूहों और P14 या पुराने पिल्ले के लिए, पीबीएस के 6 एमएल के साथ गोली फिर से निलंबित और एक 70 माइक्रोन सेल एक नया 15 एमएल शंक्वाकार संग्रह polypropylene ट्यूब के शीर्ष पर रखा झरनी के माध्यम से तनाव। अधिक से अधिक सेल वसूली सुनिश्चित करने के लिए, पीबीएस के एक अतिरिक्त 6 एमएल के साथ मूल ट्यूब धोने और संग्रह ट्यूब पर सेल झरनी के माध्यम से तनाव।
    2. भ्रूण और पिल्ले युवा टी के लिएहान P14, पीबीएस के 2 एमएल के साथ गोली फिर से निलंबित और एक 35 माइक्रोन सेल एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene संग्रह ट्यूब (FACS ट्यूब) के शीर्ष पर रखा झरनी के माध्यम से तनाव। अधिक से अधिक सेल वसूली सुनिश्चित करने के लिए, पीबीएस के एक अतिरिक्त 2 एमएल के साथ मूल ट्यूब धोने और संग्रह ट्यूब पर सेल झरनी के माध्यम से तनाव।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और 5 मिनट के लिए 300 XG और सतह पर तैरनेवाला aspirate। के रूप में कोशिकाओं शिथिल polystyrene ट्यूब से जुड़े होते हैं, ध्यान से तरल निकालें।

3. एकल लेबल कोशिकाओं की तैयारी

  1. बफर तैयारी: FACS द्वारा सेल अलगाव के लिए, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 5 मिमी EDTA (कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड के बिना) पीबीएस के मिश्रण से बफर छँटाई तैयार करते हैं। प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए, 0.05% सोडियम azide के साथ छँटाई बफर सप्लीमेंट द्वारा विश्लेषण बफर तैयार करते हैं। दोनों बफ़र्स अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. फिर से निलंबित छँटाई या एना में कोशिकाओंलिसेस बफ़र। प्रत्येक अग्न्याशय भ्रूण और 1 एमएल में P7 की तुलना में छोटी पिल्ले से अलग, P8 और 1.5 एमएल में एक महीने पुराने के बीच पिल्ले से पुनः निलंबित, और चूहों से 3 एमएल में एक महीने से अधिक पुराने। एक 35 माइक्रोन सेल एक दौर नीचे polystyrene ट्यूब (FACS ट्यूब) के शीर्ष पर रखा झरनी के माध्यम से कोशिकाओं तनाव।
  3. नियंत्रण धुंधला के लिए, पिछले चरण (न की कुल नमूना मात्रा का 5% से अधिक) में किए गए नमूनों से 100 μL aliquots करने के लिए 50 से बाहर रखना और उन्हें नए FACS ट्यूबों में जगह; इस्तेमाल प्रत्येक fluorophore के लिए एक ट्यूब, DAPI और फ्लोरोसेंट प्रोटीन सहित, साथ ही साथ के लिए एक अस्थिर नियंत्रण शामिल हैं।
    नोट: एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करते हैं, या जब सेल संख्या सीमित है, एक धुंधला नियंत्रण के रूप में एक गैर ट्रांसजेनिक ऊतक शामिल हैं। एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं आगे धुंधला के बिना उपयोग किया जाता है, तो चरण 3.8 आगे बढ़ें।
  4. 300 XG पर स्पिन नीचे कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  5. ब्लॉक के लिएराजा, अवरुद्ध समाधान के साथ कोशिकाओं (100 छँटाई μL या विश्लेषण बफर बकरी आईजीजी के 1 μL के साथ पूरक) फिर से निलंबित और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. कोशिका की सतह मार्करों दाग करने के लिए, एक मिश्रण है कि नमूना प्रति 100 μL के एक मात्रा में सभी वांछित fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी शामिल तैयार करते हैं। छँटाई या विश्लेषण बफर में 2x एंटीबॉडी dilutions तैयार (यानी, एंटीबॉडी डबल आवश्यक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पतला, अगर 1 की एक अंतिम कमजोर पड़ने: 100: 200 वांछित है, एंटीबॉडी 1 पतला)। अवरुद्ध समाधान धोने के बिना, 200 μL के अंतिम धुंधला मात्रा प्राप्त करने के लिए नमूना कोशिकाओं के मिश्रण के 100 μL जोड़ें। बर्फ पर 30-60 मिनट के लिए और अंधेरे में सेते हैं।
  7. विश्लेषण या छँटाई मानकों (कदम 4.3 और 5.2 देखें) सेट करने के लिए अतिरिक्त ट्यूबों कि इस्तेमाल किया (धुंधला नियंत्रण) एंटीबॉडी का केवल एक ही शामिल तैयार करते हैं। छँटाई या विश्लेषण बफर (3.6 कदम के रूप में वर्णित) में 2x एंटीबॉडी dilutions तैयार करें। बनाओ एक सी को शामिल कर लेंइस्तेमाल प्रत्येक fluorophore, साथ ही एक अस्थिर नियंत्रण के लिए ngle धुंधला नियंत्रण कमजोर पड़ने। अवरुद्ध समाधान धोने के बिना, कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी घोला जा सकता है (3.3 कदम में तैयार) 200 μL के अंतिम धुंधला मात्रा को प्राप्त करने के लिए 100 μL जोड़ें। बर्फ पर है और अंधेरे में 60 मिनट - 30 के लिए सेते हैं।
  8. विश्लेषण के साथ प्रत्येक ट्यूब भरने या 4 एमएल के एक अधिक से अधिक मात्रा में करने के लिए बफर छँटाई से धो लें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं एक 35 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से (3.2 चरण में वर्णित के रूप में) फिर से तनाव।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला ध्यान से हटा दें।
  10. विश्लेषण या बफर छँटाई में नमूने फिर से निलंबित। 1 मिलीलीटर में एक महीने से भी कम उम्र के पिल्ले से, 500 μL में भ्रूण से अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित 1 से - 2 एमएल में 3 महीने पुरानी है, और एमएल 3 में 3 महीने से अधिक पुराने चूहों से। धुंधला नियंत्रण बफर के 300 μL में फिर से निलंबित किया जा सकता है।
  11. 200 एनजी जोड़ें / DAPI एमएल फिर से निलंबित करने के लिए कोशिकाओं को मृत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। बनाओ एक ट्यूब सह अवश्य शामिल करेंकोशिकामापी सेटिंग्स के लिए DAPI बिना बेदाग कोशिकाओं ntaining। सेल छँटाई (चरण 4) या विश्लेषण (चरण 5) करने के लिए आगे बढ़ें।

4. सेल छंटनी

  1. तैयारी:
    1. सेल RNase के साथ शाही सेना निकासी के लिए पहले, कोट एक 1.5 एमएल एकत्रित ट्यूब छँटाई के लिए अवरोध तुरंत छँटाई करने से पहले। यह अंत करने के लिए, बफर छँटाई, 0.01 यू / एमएल RNase अवरोध युक्त एक बाँझ 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब के लिए, के 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के बाद, ट्यूब भंवर और तरल हटा दें।
    2. सेल सेल संस्कृति के लिए पहले से छंटाई के लिए, जोड़ने बाँझ संवर्धन मीडिया के 3 एमएल (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 20% FBS, 1% एल glutamine के साथ पूरक, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन) एक बाँझ 15 एमएल संग्रह ट्यूब में ।
  2. एक FACS सॉर्टर में एक ट्यूब लोड करने से पहले, भंवर इसे संक्षेप में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए। बर्फ पर शेष ट्यूबों रखें।
  3. धुंधला नियंत्रण का विश्लेषण छँटाई मापदंडों का निर्धारण करने के लिए (जैसे द्वारा शुरू करो, (जैसे, कुल सेल आबादी, जी DAPI नकारात्मक कोशिकाओं, और सेल आबादी हल किया जाना)।
  4. एक बार जब छँटाई मापदंडों और फाटक स्थापित कर रहे हैं, नमूने लोड और संग्रह ट्यूबों में छँटाई सेल आरंभ करें।
    नोट: छंटनी की स्थिति साधन पर अत्यधिक निर्भर हैं। हम 100 माइक्रोन की नोक चौड़ाई, 23.1 साई के दबाव, और 5 के एक अधिक से अधिक छँटाई गति का उपयोग करें।
  5. शाही सेना निष्कर्षण या हल कोशिकाओं का संवर्धन करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: शाही सेना निकासी के लिए, 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और एक मानक निकासी प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने से पहले अतिरिक्त तरल हटा दें। , संवर्धन कोशिकाओं अगर कोशिकाओं गैर बाँझ शर्तों के तहत हल किया गया के लिए, उन्हें संवर्धन के माध्यम के साथ ट्यूब भरने और उनके प्रदूषण को कम करने के संवर्धन से पहले 7 मिनट के लिए 300 XG पर यह centrifuging द्वारा दो बार धोने।

से फ्लो द्वारा 5. सेल विश्लेषण

  1. एल पहलेकोशिकामापी, भंवर में प्रत्येक ट्यूब oading इसे संक्षेप में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए। बर्फ पर शेष ट्यूबों रखें।
  2. आदेश विश्लेषण मानकों (जैसे, वोल्टेज और मुआवजा) निर्धारित करने में बेदाग और एकल दाग नमूनों का विश्लेषण द्वारा शुरू करो।
  3. एक बार जब विश्लेषण मानकों को स्थापित कर रहे हैं, धुंधला नियंत्रण सहित, प्रत्येक नमूना लोड, और परिणाम रिकॉर्ड है। विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग कर प्राप्त परिणामों का विश्लेषण।

Representative Results

अग्नाशय mesenchyme विकास और वयस्कता के दौरान आवश्यक है। विधि यहाँ वर्णित भ्रूण, नवजात, और वयस्क अग्न्याशय से mesenchymal कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। Mesenchymal कोशिकाओं, लेकिन कोई अन्य प्रकार की कोशिकाओं, Nkx3.2 -Cre के अग्न्याशय में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) एक्सप्रेस; R26R -YFP चूहों 5, 11, 17, 19। विकास के दौरान, Nkx3.2 (भी BapX1 के रूप में जाना जाता है) भ्रूण अग्नाशय, पेट, आंत और mesenchyme, साथ ही कंकाल somites 19, 20, 21 के एक सबसेट में से व्यक्त किया जाता है। इस जीन E11.5 तक E9.5 से अग्नाशय mesenchyme में व्यक्त की गई थी, E9.5 5 से Nkx3.2 -Cre के नियंत्रण में जीन अभिव्यक्ति की अनुमति, 19, 20। इस लेबलिंग के आधार पर, कोशिकाओं से फ्लो का उपयोग करके बल्क अग्नाशय के ऊतकों से शुद्ध किया जा सकता है। चित्रा 2, भ्रूण नवजात, और वयस्क अग्नाशय के ऊतकों, के रूप में यहाँ वर्णित पृथक से एकल कक्षों की एक प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता। जबकि गैर ट्रांसजेनिक अग्नाशय के ऊतकों फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को शामिल नहीं किया था, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP सभी का विश्लेषण उम्र से अग्नाशय के ऊतक एक अलग YFP लेबल सेल की आबादी (; फाटकों के साथ चिह्नित चित्रा 2) शामिल हैं।

विधि यहाँ वर्णित के बाद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं या तो शुद्ध या के साथ या अतिरिक्त immunostaining बिना प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया है, हो सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आधार पर छंटाई के बाद, mesenchymal कोशिकाओं (कम से कम पांच मार्ग के लिए) एक सेल लाइन स्थापित करने के लिए, के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया गया संवर्धित किया जा सकता। नोट टी वह संवर्धित कोशिकाओं, mesenchymal कोशिकाओं को ठेठ की आकृति विज्ञान fibrocytic। इसके अलावा, इस प्रणाली के हल कोशिकाओं द्वारा जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह अंत करने के लिए, आरएनए हल किया mesenchymal कोशिकाओं से निकाला गया था सीडीएनए के संश्लेषण के लिए, और जीन अभिव्यक्ति के स्तर qPCR द्वारा विश्लेषण किया गया। इस तरह के विश्लेषण से पता चला है कि हल कोशिकाओं अखिल mesenchymal मार्कर vimentin (चित्रा 3 बी) व्यक्त करते हैं। अन्त में, अग्नाशय कोशिकाओं द्वारा सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम Nkx3.2 -Cre के अग्नाशय के ऊतकों से कोशिकाओं को अलग; R26R -YFP विधि यहाँ वर्णित है और उन्हें कोशिका की सतह CD9 ग्लाइकोप्रोटीन, जो fibroblasts 22 से व्यक्त होने की सूचना दी गई थी के साथ दाग का उपयोग कर वयस्क चूहों। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है -3 सी, सभी fluorescently लेबल Nkx3.2 -Cre में कोशिकाओं; R26R -YFP अग्न्याशय CD9 व्यक्त करते हैं।

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चित्रा 1: भ्रूण और नवजात अग्नाशय के ऊतक। पृथक पूरे जठरांत्र संबंधी मार्ग, पेट, प्लीहा, आंत, और अग्न्याशय, एक E15.5 भ्रूण (ए) और एक पी 4 पिल्ला (बी) का भी शामिल है। अग्नाशय के ऊतक एक नीले रंग की लाइन के साथ सीमांकन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: mesenchymal कोशिकाओं fluorescently Nkx3.2 -Cre में चिह्नित कर रहे हैं; R26R -YFP अग्नाशय के ऊतक। गैर ट्रांसजेनिक (बाएं पैनल) और Nkx3.2 -Cre से अलग अग्नाशय कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण; R26R -YFP ट्रांसजेनिक (सही पैनल) विभिन्न युगों में चूहों: भ्रूण (ए), नवजात (बी), और विज्ञापनULT (सी)। प्रकोष्ठों पक्ष तितर बितर (शाफ़्ट) और पीले रंग की रोशनी (एक्स अक्ष) के लिए विश्लेषण किया गया। गेट्स ( "डी" के साथ चिह्नित) गैर ट्रांसजेनिक नियंत्रण में ट्रांसजेनिक चूहों में एक YFP + सेल की आबादी की उपस्थिति नहीं है लेकिन संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पृथक अग्नाशय कोशिकाओं का विश्लेषण। (ए) प्रकोष्ठों Nkx3.2 -Cre के अग्नाशय के ऊतकों से हल किया; R26R -YFP नवजात चूहों (चित्रा 2 बी में वर्णित के रूप में) एक सेल लाइन स्थापित करने के लिए सुसंस्कृत थे। (; दाएं और बाएं पैनलों हरा) और चरण विपरीत संवर्धित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के लिए imaged थे (ग्रे, सही पैनल)। (बी) बार दिखा Vimentin1 (Vim1) आरेखYFP + -sorted Nkx3.2 -Cre के अग्नाशय के ऊतकों से कोशिकाओं द्वारा अभिव्यक्ति के स्तर; R26R -YFP वयस्क चूहों (चित्रा 1C में वर्णित के रूप में, हरा) अवर्गीकृत अग्नाशय के ऊतकों (काला) की तुलना में। आरएनए निकाला गया था और जीन अभिव्यक्ति qPCR द्वारा विश्लेषण किया गया था; अभिव्यक्ति cyclophilin के लिए सामान्यीकृत किया गया था। एन = 4 *** पी <0.001। डेटा ± एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) Nkx3.2 -Cre से छितरी हुई अग्नाशय कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण; R26R -YFP वयस्क चूहों इम्युनो से सना हुआ allophycocyanin (एपीसी) के साथ विरोधी CD9 एंटीबॉडी संयुग्मित और एपीसी (शाफ़्ट) और पीले रंग की रोशनी (एक्स अक्ष) के लिए विश्लेषण किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम अलग और अग्नाशय microenvironment की कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस विधि भ्रूण और वयस्क अग्नाशय के ऊतकों से mesenchymal कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक वयस्क और नवजात अग्न्याशय 5, 17 से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। हालांकि, यह (वैकल्पिक प्रोटोकॉल संदर्भ में 18, 23 में वर्णित हैं, और 24) अग्नाशय उपकला कोशिकाओं की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। इस विधि, fluorescently लेबल कोशिकाओं का उपयोग करना, या तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त या सतह मार्करों के लिए immunostained, FACS द्वारा शुद्ध या प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। आरएनए उनके जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रोफ़ाइल करने के लिए शुद्ध कोशिकाओं से निकाला जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शुद्ध कोशिकाओं बाद प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक सेल लाइन स्थापित करने के लिए संवर्धित किया जा सकता। इस विधि के कारकों ई लक्षण वर्णन सक्षम हो जाएगाअग्न्याशय microenvironment, जो अपनी जीवोत्पत्ति, शरीर विज्ञान, और pathophysiology शासन द्वारा xpressed।

अग्नाशय mesenchyme व्यापारियों और विभेदित कोशिकाओं 5, 9 के प्रसार को बढ़ावा देने से ऊतक जीवोत्पत्ति समर्थन करता है। इन कोशिकाओं को मानव भ्रूण स्टेम सेल के विस्तार का समर्थन करने के लिए दिखाया गया (hESC) अग्नाशय पूर्वज 17, 25, 26 व्युत्पन्न। इसलिए, भ्रूण mesenchymal कारकों की पहचान की रूपरेखा hESCs और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) मधुमेह के लिए एक संभावित इलाज के रूप से इंसुलिन के उत्पादन बीटा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए वर्तमान प्रयासों की सुविधा होगी। माउस आनुवंशिक अध्ययन अग्न्याशय के विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान अग्नाशय उपकला विस्तार को बढ़ावा देने के लिए इस तरह Fgf10 रूप में वृद्धि कारकों, कि mesenchyme द्वारा उत्पादित कर रहे हैं की पहचान की अनुमति दी3, 9। भ्रूण mesenchyme में व्यक्त अतिरिक्त कारकों की पहचान करने के उद्देश्य के साथ, हम इन लेजर कब्जा कर लिया microdissection का उपयोग कोशिकाओं को अलग किया है, उनके लिए शाही सेना निकाली गई, और जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के 26 प्रदर्शन किया। हालांकि, श्रम तीव्र होने के अलावा, इस विधि को अपने रूपात्मक सुविधाओं, जो पूर्व के आसपास mesenchyme (यानी, E12.5) में उपकला की शाखाओं को विकास के चरणों के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित करता है के आधार पर कोशिकाओं की पहचान पर निर्भर करता है। बाद में विकास के चरणों में mesenchymal कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए, हम विधि यहाँ 5, 17 में वर्णित कार्यरत हैं।

हम इस विधि का इस्तेमाल नवजात अग्नाशय mesenchyme 5 से सतह मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए। इसके अलावा, mesenchymal कोशिकाओं Nkx3.2 -Cre की भ्रूण और नवजात अग्नाशय के ऊतकों से अलग थे; R26-EYFP चूहों पर आधारितइस माउस लाइन में अपने फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और सेल लाइनों की स्थापना के लिए 17 सुसंस्कृत थे। इन कोशिकाओं hESC व्युत्पन्न अग्नाशय पूर्वज 17 बढ़ावा देने की क्षमता के साथ अग्नाशय mesenchyme द्वारा स्रावित कारकों की पहचान के लिए अनुमति की प्रोटिओमिक विश्लेषण। हम आगे शाही सेना निष्कर्षण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 17 के लिए वयस्क अग्नाशय के ऊतकों से mesenchymal कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए इस सेल अलगाव विधि का इस्तेमाल किया। इसलिए, इस विधि अग्नाशय सेल के विकास का समर्थन करने की क्षमता के साथ जीन और प्रोटीन अग्नाशय mesenchyme द्वारा व्यक्त की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अग्नाशय mesenchymal कोशिकाओं आगे अग्न्याशय tumorigenesis में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। PDAC एक fibroblast अमीर desmoplastic fibroblasts, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के शामिल स्ट्रोमा के गठन, और ईसीएम 27 की विशेषता है। स्ट्रोमा कई के विकास को बढ़ावा देने के बारे में सोचा था, जबकिकैंसर के प्रकार, यह PDAC प्रगति 15, 16, 28 को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया था। यह पता चलता है कि अग्नाशय स्ट्रोमा के घटकों कारक है कि tumorigenesis बाधित छिपाना। इसके अलावा, स्ट्रोमा सेलुलर संरचना में और साथ ही सेल phenotype में परिवर्तन उपकला कोशिकाओं 15, 16, 28 पर उनके प्रभाव कायम कर सकते हैं। विधि यहाँ वर्णित इसलिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं है कि एक PDAC स्ट्रोमा को बनाने के स्वस्थ अग्नाशय के ऊतकों की तुलना में निस्र्पक में सहायता कर सकते हैं। इसे आगे भी विभिन्न प्रकार के stromal सेल की शुद्धि PDAC प्रगति के दौरान उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में संभावित परिवर्तनों को चिह्नित करने की अनुमति होगी। हालांकि, tumorigenesis 27 के दौरान अग्नाशय ईसीएम संरचना में परिवर्तन की वजह से, इस तरह के addit के शामिल किए जाने के रूप में ऊतक पाचन मापदंडों का समायोजन,ional कोलैजिनेज़ प्रकार या ऊष्मायन समय बढ़ रही है, आवश्यक हो सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213865001
DNase Sigma-Aldrich D5025-15KU The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) Sigma-Aldrich H6648
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
EDTA Biological Industries 01-862-1A
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Goat IgG serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Sigma-Aldrich D9542
RNAse inhibitor Invitrogen N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965092
L-Glutamine Biological Industries 03-020-1B
Penicillin-streptomycin Biological Industries 03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 mL tubes Sarstedt 72 690
15 mL conical tube Corning 430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tube Corning 352008 FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap Cap Corning 352235 FACS tube
70 μm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-462
Heating block with agitation  Eppendorf ThermoMixer C
Centrifuge ThermoFisher Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope Nikon SMZ 745
Cell sorter BD Biosciences FACSAria IIu
flow cytometer Beckman Coulter Gallios 

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References

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