Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso

Developmental Biology
 

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Epshtein, A., Sakhneny, L., Landsman, L. Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55344, doi:10.3791/55344 (2017).

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Abstract

Introduction

omeostasi energetica e la digestione degli alimenti nei mammiferi dipendono da una corretta funzione pancreatica. Il pancreas adulto è composto da due principali compartimenti cellulari: il esocrina e il sistema endocrino. Cellule esocrine, comprese le cellule acinari che producono e secernono enzimi digestivi e le cellule dei dotti che trasportano questi enzimi per l'intestino, comprendono oltre l'80% della massa pancreatica totale 1. Cellule endocrine, che includono le cellule beta produttrici di insulina e glucagone cellule alfa producono, sono organizzati nelle isole di Langerhans che sono incorporati nel tessuto esocrino e secernono ormoni per regolare i livelli di glucosio nel sangue 2.

Cellule pancreatiche acquisiscono il loro destino differenziata attraverso una altamente regolamentato, processo a più gradi 3. L'evidenza suggerisce che spunti estrinseci forniti da neuronale, endoteliali e cellule mesenchimali guidare la differenziazione delle cellule del pancreas e la proliferazione in tha embrione 3, 4, 5. Un esempio è il requisito dell'aorta per la specifica dei primi precursori pancreatici 6. Più tardi in fase di sviluppo, le cellule endoteliali sono stati mostrati a svolgere un ruolo centrale nello sviluppo di entrambe le cellule endocrine e esocrine del pancreas e di promuovere la differenziazione delle cellule beta 4, 6, 7. Cellule mesenchimali hanno dimostrato di sostenere la sopravvivenza e l'espansione di progenitori pancreatici comuni, principalmente attraverso la secrezione del fattore di crescita FGF10 8, 9. Abbiamo inoltre dimostrato che queste cellule supportano la proliferazione di endocrine ed esocrine precursori, nonché di cellule differenziate (comprese le cellule acinari e beta) nel pancreas embrionale 5. Recentemente, cellule mesenchimali sono stati ulteriormentedimostrato che regolano il differenziamento cellule endocrine 10.

Nell'adulto, funzione delle cellule beta e massa sono stati mostrati dipendere cellule nel loro microambiente, tra neuronale, immunitario, e le cellule endoteliali, nonché periciti 11, 12, 13. Durante la ferita, le cellule endoteliali sono stati mostrati a reclutare le cellule immunitarie al pancreas per promuovere la replicazione delle cellule beta 13. Le cellule endoteliali sono state ulteriormente mostrati per produrre componenti della matrice extracellulare (ECM) per sostenere l'espressione di insulina e beta-cellule funzione 14. Abbiamo recentemente dimostrato l'esigenza di pericytes isolotto per la funzione delle cellule beta 11. Infine, le cellule dello stroma pancreatica sono stati mostrati per regolare la progressione di adenocarcinoma del dotto pancreatico (PDAC) 15, 16. Tuttavia, l'identità di spunti estrinseci che guidano lo sviluppo del pancreas, la funzione, e tumorigenesi sono in gran parte sconosciuti.

Identificare spunti forniti dalle cellule del microambiente del pancreas richiede caratterizzare i geni e le proteine ​​espresse da queste cellule. Questo dipende isolare queste cellule dal pancreas per effettuare l'espressione genica e proteomica e / o stabilire linee cellulari. Qui, vi proponiamo un metodo per isolare le cellule mesenchimali del microambiente del pancreas utilizzando tessuti digestione enzimatica e fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) di entrambi cellule immunofluorescently-etichettati o cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e analizzare proteina fluorescente gialla (YFP) esprimente cellule mesenchimali del embrionale, neonatale e adulta del pancreas 5, 17.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213865001
DNase Sigma-Aldrich D5025-15KU The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) Sigma-Aldrich H6648
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
EDTA Biological Industries 01-862-1A
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Goat IgG serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Sigma-Aldrich D9542
RNAse inhibitor Invitrogen N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965092
L-Glutamine Biological Industries 03-020-1B
Penicillin-streptomycin Biological Industries 03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 mL tubes Sarstedt 72 690
15 mL conical tube Corning 430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tube Corning 352008 FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap Cap Corning 352235 FACS tube
70 μm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-462
Heating block with agitation  Eppendorf ThermoMixer C
Centrifuge ThermoFisher Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope Nikon SMZ 745
Cell sorter BD Biosciences FACSAria IIu
flow cytometer Beckman Coulter Gallios 

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References

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