Isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen Mesenchyme ved flowcytometri

Developmental Biology
 

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering av celler i bukspyttkjertelen mikromiljøet fra embryoniske, neonatale og voksne mus vev, med fokus på isolering av mesenchymale celler. Denne metoden gjør det mulig profilering av celle genekspresjon og protein sekresjon for å belyse de ytre signalene som regulerer bukspyttkjertel utviklingen, funksjon og tumorigenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Epshtein, A., Sakhneny, L., Landsman, L. Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55344, doi:10.3791/55344 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Energi homeostase og fordøyelsen hos pattedyr er avhengig av riktig bukspyttkjertelfunksjon. Den voksne bukspyttkjertelen består av to hoved cellulære avdelinger: eksokrin og endokrin. Eksokrine celler, inkludert akinærceller som produserer og utskiller fordøyelsesenzymer og de kanalsystem celler som transporterer disse enzymene til tarmen, omfatte mer enn 80% av den totale massen pancreatic 1. Endokrine celler, som inkluderer insulinproduserende betaceller og glukagon-produserende alfaceller, er organisert i de Langerhanske øyer som er innebygd i den eksokrine vevet og skiller ut hormoner for å regulere blodsukkernivået 2.

Bukspyttkjertelen celler skaffe sin differensiert skjebne gjennom en svært regulert, flertrinnsprosess tre. Tyder på at ytre signaler gitt av nevronale, endothelial, og mesenchymalceller veilede bukspyttkjertelen celledifferensiering og spredning i than embryo 3, 4, 5. Et eksempel er kravet til aorta for spesifisering av tidlige forløpere pankreatiske 6. Senere i utvikling, ble endotelceller vist seg å spille en sentral rolle i utviklingen av både bukspyttkjertelen endokrine og eksokrine celler og for å fremme beta-celledifferensiering 4, 6, 7. Mesenchymale celler ble vist å understøtte overlevelsen og utvidelse av vanlige pankreas progenitorceller, hovedsakelig gjennom sekresjon av vekstfaktor Fgf10 8, 9. Vi har videre vist at disse cellene understøtte proliferasjon av endokrine og eksokrine forløpere, samt av differensierte celler (inkludert acinar og beta-celler) i den embryoniske bukspyttkjertelen 5. Nylig mesenchymalceller var viderevist seg å regulere endokrine celler differensiering 10.

I den voksne, ble beta-cellefunksjon og masse vist seg å være avhengig av celler i deres mikromiljø, innbefattet nerve-, immunsystemet, og endotelceller, samt pericytes 11, 12, 13. I løpet av skade, ble endotelceller vist å rekruttere immunceller til bukspyttkjertelen for å fremme beta-celle-replikasjon 13. Endotelceller ble videre vist å produsere ekstracellulær matriks (ECM) komponenter for å støtte insulin ekspresjon og beta-cellefunksjon 14. Vi har nylig demonstrert kravet om holmen pericytes for betacellefunksjon 11. Til slutt, ble cellene i bukspyttkjertelen stroma vist seg å regulere utviklingen av pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC) 15, 16. Imidlertid idenhet av ytre signaler som styrer bukspyttkjertelen utvikling, funksjon og tumorigenesis er i stor grad ukjent.

Identifisering av signaler levert av cellene i bukspyttkjertelen mikromiljøet krever karakterisering av genene og proteinene uttrykt av disse celler. Dette er avhengig av å isolere disse cellene fra bukspyttkjertelen for å utføre genekspresjon og proteomic analyser og / eller å etablere cellelinjer. Her, foreslår en metode for å isolere mesenchymale celler i bukspyttkjertelen mikromiljøet ved å benytte vev enzymatisk fordøyelse og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) av enten immunofluorescently-merkede celler eller celler som uttrykker fluorescerende proteiner. Denne protokollen ble vellykket utført for å isolere og analysere gul fluoriserende protein (YFP) -expressing mesenchymale celler av embryonale, neonatal, og voksen bukspyttkjertelen 5, 17.

Protocol

Forsøkene ble utført i henhold til protokoller godkjent av komité for forsøksdyr ved Tel Aviv University.

1. Isolering av bukspyttkjertelen vev fra Mus

  1. For voksne mus:
    1. Klargjør fordøyelse buffer: 0,4 mg / ml kollagenase P og 0,1 ng / ml DNase I som er oppløst i Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS). Fersk forberede 5 ml buffer per mus i 15-ml koniske rør og holde dem på is inntil bruk.
    2. Avlive mus i henhold til institusjonelle retningslinjer.
    3. Dissekere hver mus for å fjerne bukspyttkjertelen (for instruksjon, kan du se Referanse 18); plassere den i en kultur tallerken med HBSS. Det er mulig å utføre dette trinn under et stereomikroskop, og for å øke effektiviteten fordøyelse, skjære vevet inn i 2 - 4 stk.
    4. Plasser pankreasvevet inn i et rør inneholdende fordøyelseskanal-buffer (fremstilt i trinn 1.1.1). Hold rørene på is inntil alle mus er dissekert og bukspyttkjertelen vevoppsamlet.
    5. Gjenta trinn 1.1.2 - 1.1.4 med de resterende mus.
  2. For embryoer og neonatale mus:
    1. Klargjør fordøyelse buffer: 0,4 mg / ml kollagenase P og 0,1 ng / ml DNase I som er oppløst i HBSS. For embryoer og valper på postnatal dag 7 (P7) eller yngre, nystekte forberede 1,5 - 2 ml buffer per mus i en 15-ml konisk tube. For P7 eller eldre unger, forberede 3 - 4 ml buffer per mus i en 15-ml konisk tube. Hold på is inntil bruk.
    2. Avlive mus i henhold til institusjonelle retningslinjer. For embryoer, fjerne alle embryoer fra sin mors livmor og plassere dem i en 10-mm kulturskål inneholder PBS. Dissekere en embryo av gangen.
    3. Lå musen på ryggen, med hodet pekende bort fra etterforsker. Bruke fin pinsett, trekke opp abdominal hud og åpne på midtlinjen for å eksponere bukhulen opp til muse membran 18.
    4. Bruke fin pinsett, ta leveren from ryggen bukveggen. Med en kontinuerlig bevegelse mot musehale, øse ut de indre organer (inkludert lever, magesekk, milt, tarm, nyre og bukspyttkjertel) og plassere dem i en kultur tallerken med HBSS.
    5. Under en stereomikroskop, fjerner du lever og nyrer for å avsløre bukspyttkjertelen (figur 1). Bruke fin pinsett, ta bukspyttkjertelen fra magen, tolvfingertarmen, og til slutt, fra milten.
    6. Plasser pankreasvevet inn i et rør inneholdende fordøyelseskanal-buffer (fremstilt i trinn 1.2.1). For P14 eller eldre unger, kutt vev i 2 deler for å øke fordøyelsen effektivitet. Hold rørene på is inntil alle mus er dissekert og bukspyttkjertelen vev samlet.
    7. Gjenta trinn 1.2.2 - 1.2.6 med de resterende mus.

2. Pancreas Fordøyelse

  1. Inkuber rørene inneholdende pankreasvevet (i fordøyelse buffer) i en varmeblokk ved 37 ° C i 30 minutter med agitation ved 700 rpm. Etter 15 minutter manuelt riste rørene ved å snu dem 3 - 4 ganger og legg dem tilbake i varmeblokken.
    MERK: Hvis du bruker en varmeblokk uten agitasjon evner, snu rørene hver 5-10 min. Sørg for at vevet blir skikkelig fordøyd. Hvis ikke, skåret i vevet til mindre stykker før inkubering eller øke den agitering.
  2. For å stoppe vevsfordøyelse, plasser rørene på is og tilsett 10 ml kald HBSS til hvert rør. Sentrifuger rørene ved 4 ° C og 300 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten.
  3. Re-suspensjon:
    1. For voksne mus og p14 eller eldre unger, re-suspendere pellet med 6 ml PBS og siles gjennom en 70-mikrometer celle sil plassert på toppen av en ny 15-ml konisk samling polypropylenrør. For å sikre maksimal celle utvinning, vaske det opprinnelige rør med ytterligere 6 ml PBS og press den gjennom cellen sil på oppsamlingsrør.
    2. For embryoer og valper yngre tHan-P14, re-suspendere pellet med 2 ml PBS og siles gjennom en 35-mikrometer celle sil plassert på toppen av en 5-ml rundbunnet polystyren oppsamlingsrør (FACS tube). For å sikre maksimal celle utvinning, vaske det opprinnelige rør med ytterligere 2 ml PBS og press den gjennom cellen sil på oppsamlingsrør.
  4. Sentrifuger rørene ved 4 ° C og 300 xg i 5 minutter og aspirer supernatanten. Fjern væsken forsiktig, da cellene er løst festet til polystyrenrør.

3. Forbereder Merket enkeltceller

  1. Buffer preparater: For celleisolasjon ved hjelp av FACS, forberede sortering buffer ved blanding av PBS (uten kalsium og magnesiumklorid), 5% føtalt bovint serum (FBS), og 5 mM EDTA. For strømningscytometri-analyse, forberede analyse buffer ved å supplere sortering buffer med 0,05% natriumazid. Begge buffere kan oppbevares ved 4-8 ° C i opptil 2 måneder.
  2. Re-suspendere celler i sortering eller analyseringsbuffer. Re-suspendere hver bukspyttkjertelen isolert fra befruktede egg og unger yngre enn p7 i 1 ml, fra valper mellom P8 og en måned gammel i 1,5 ml, og fra mus eldre enn en måned i 3 ml. Sil cellene gjennom et 35 mikrometer celle sil plassert på toppen av en rundbunnet polystyren rør (FACS tube).
  3. For flekker kontrollene, ta ut 50 til 100 ul porsjoner fra prøvene som er gjort i forrige trinn (ikke mer enn 5% av den totale prøvevolumet) og plassere dem inn i nye FACS rør; omfatte et rør for hver fluorofor anvendes, innbefattet DAPI og fluorescerende proteiner, så vel som for en unstained kontroll.
    MERK: Ved bruk av transgene mus med celler som uttrykker en fluorescerende protein, eller når cellen antallet er begrenset, har en ikke-transgen vev som en fargekontroll. Hvis celler som uttrykker en fluorescerende protein er brukt uten ytterligere flekker, fortsett til trinn 3.8.
  4. Spinn-ned cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og aspirer supernatanten.
  5. for blockonge, re-suspendere cellene med blokkering løsning (100 mL sortering eller analyse buffer supplert med en ul geit IgG) og inkuberes i 30 min på is.
  6. For å farge celleoverflatemarkører, fremstille en blanding som inneholder alle de ønskede fluoroforen-konjugerte antistoffer i et volum på 100 mL per prøve. Forbered 2x antistoff-fortynninger i sortering eller analysebuffer (dvs. fortynnes antistoffet for å oppnå dobbel den nødvendige konsentrasjon, hvis en endelig fortynning på 1: 200 er ønsket, fortynnes antistoff 1: 100). Uten vasking av blokkeringsoppløsningen, tilsett 100 ul av blandingen til prøven cellene for å oppnå en endelig farging volum på 200 ul. Inkuber i 30-60 minutter på is og i mørke.
  7. Slik stiller analyse eller sorteringsparametre (se trinn 4.3 og 5.2), forberede flere rør som bare en av de antistoffer som brukes (flekker kontroll) inneholder. Forbered 2x antistoff-fortynninger i sortering eller analyse-buffer (som beskrevet i trinn 3.6). Sørg for å inkludere en single farging kontroll fortynning for hver fluorofor anvendes, så vel som en kontroll uten flekker. Uten vasking av blokkeringsoppløsningen, tilsett 100 ul av antistoff-mikser til cellene (fremstilt i trinn 3.3) for å oppnå en endelig farging volum på 200 ul. Inkuber i 30 - 60 min på is og i mørke.
  8. Vask ved å fylle hvert rør med analyse eller sortering buffer til et maksimalt volum på 4 ml. Eventuelt re-stamme cellene gjennom et 35 mikrometer celle sil (som beskrevet i trinn 3.2).
  9. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten forsiktig.
  10. Re-suspendere prøvene i analyse eller sortering buffer. Re-suspendere celler isolert fra embryoer i 500 mL, fra valper yngre enn en måned i 1 ml, fra 1 - 3 måneder gammel i 2 ml, og fra mus som er eldre enn 3 måneder i 3 ml. Flekker kontroller kan bli resuspendert i 300 ul buffer.
  11. Tilsett 200 ng / ml av DAPI for å re-suspenderte celler for å identifisere de døde cellene. Sørg for å inkludere et rør containing ufargede celler uten DAPI for cytometer innstillinger. Gå videre til cellesortering (trinn 4) eller analyse (trinn 5).

4. Cell Sorting

  1. Forberedelser:
    1. For cellesortering før RNA ekstraksjon, frakk en 1,5 ml samle tube med RNase inhibitor umiddelbart før sortering. For å oppnå dette, tilsett 1 ml for sortering buffer, inneholdende 0,01 U / ml RNase-inhibitor, til et sterilt 1,5 ml oppsamlingsrør. Etter 5 minutter ble vortex røret og fjern væsken.
    2. For cellesortering før cellekultur, tilsettes 3 ml sterilt dyrkningsmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 20% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin) i en steril 15 ml oppsamlingsrør .
  2. Før du legger et rør inn en FACS sorter, vortex det kort å re-suspendere cellene. Hold de resterende rørene på is.
  3. Start med å analysere fargekontroll for å bestemme sorteringsparametere (for eksempel (f.eks total cellepopulasjon, live DAPI-negative celler og cellepopulasjoner som skal sorteres).
  4. Når sorteringsparametere og porter er satt opp, legger prøvene og initiere celle sortering i innsamlingsrørene.
    MERK: Sortering forholdene er svært avhengig av instrumentet. Vi bruker en dyse bredde på 100 um, et trykk på 23,1 MPa, og en maksimal sortering hastighet på 5.
  5. Fortsett til RNA ekstraksjon eller dyrking av sorterte cellene.
    NB: For RNA-ekstraksjon, sentrifuger cellene ved 2000 xg i 5 minutter og fjerne overflødig væske før fortsetter med en standard protokoll ekstraksjon. For dyrkning av celler, hvis celler ble sortert under ikke-sterile betingelser, vasker dem to ganger ved å fylle røret med dyrkningsmedium og sentrifugering av den ved 300 xg i 7 min før dyrkning, for å minimere forurensning.

5. Cell Analysis ved flowcytometri

  1. før loading hvert rør inn cytometeret, vortex det kort å re-suspendere cellene. Hold de resterende rørene på is.
  2. Start med å analysere de ufargede og enkelt-farget prøver for å bestemme analyseparametere (for eksempel spenning og kompensasjon).
  3. Når analyseparametere er satt opp, legger hver prøve, herunder flekker kontroll, og registrere resultatene. Analyser oppnådde resultater ved hjelp av flowcytometri analyse programvare.

Representative Results

Bukspyttkjertelen mesenchyme er nødvendig under utvikling og voksen. Metoden som beskrives her muliggjør isoleringen av mesenchymale celler fra den embryoniske, neonatale og voksne bukspyttkjertel. Mesenchymale celler, men ingen andre celletyper, uttrykke gul fluoriserende protein (YFP) i bukspyttkjertelen av Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP mus 5, 11, 17, 19. Under utvikling, er Nkx3.2 (også kjent som BapX1) uttrykt ved embryonisk pankreas, mage, tarm og mesenchyme, så vel som i en undergruppe av skjelett somites 19, 20, 21. Dette genet ble uttrykt i bukspyttkjertelen mesenchyme fra e9.5 til e11.5, slik genekspresjon under kontroll av Nkx3.2 -Cre fra e9.5 5, 19, 20. Basert på denne merking, kan cellene bli renset fra masse pankreatisk vev ved hjelp av strømningscytometri. Figur 2 viser et flow-cytometri analyse av enkeltceller fra embryoniske, neonatale og voksne pankreatiske vev, isolert som beskrevet her. Mens ikke-transgene pancreatic vev ikke inneholder fluorescerende celler, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP bukspyttkjertelen vev fra alle analyserte aldre inneholder en tydelig YFP-merket cellepopulasjon (figur 2, merket med porter).

Ved å følge fremgangsmåten som er beskrevet her, kan celler som uttrykker fluorescerende proteiner enten være renset eller analysert ved flow-cytometri, med eller uten ytterligere immunfarging. For eksempel, etter sortering basert på fluorescerende merking, mesenchymale celler kan dyrkes for å etablere en cellelinje (i minst fem passeringer), som vist i figur 3A. Note t han fibrocytisk morfologi av dyrkede celler, typisk til mesenchymale celler. Dessuten ble dette systemet anvendt for å analysere ekspresjon av gener sorterte cellene. For dette formål, ble RNA ekstrahert fra sortert mesenchymale celler for å syntetisere cDNA, og genekspresjon nivåene ble analysert ved hjelp av qPCR. En slik analyse viste at sorterte celler uttrykker pan-mesenchymale markør vimentin (figur 3B). Til slutt kan overflatemarkør ekspresjon av pankreatiske celler analysert ved flow-cytometri. For eksempel, isolerte vi celler fra bukspyttkjertelvevet av Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP voksne mus under anvendelse av metoden som er beskrevet her og farget dem med celleoverflate glykoprotein CD9, som ble rapportert å være uttrykt ved 22 fibroblaster. Som vist i figur 3C, all fluorescens-merkede celler i Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP bukspyttkjertelen uttrykke CD9.

tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/>
Figur 1: Embryonic og neonatal bukspyttkjertelen vev. Isolert hele mage-tarmkanalen, inkludert mage, milt, tarm, bukspyttkjertel og, av en e15.5 embryo (A) og en p4 pup (B). Pankreasvevet er avgrenset med en blå linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: mesenchymalceller er fluorescensmerkede i Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP bukspyttkjertelen vev. Flow-cytometri analyse av bukspyttkjertelen celler isolert fra ikke-transgen (venstre panel) og Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP transgen (høyre panel) mus i ulike aldre: embryonale (A), neonatal (B) og annonseult (C). Celler ble analysert for side scatter (y-aksen) og gul fluorescens (x-aksen). Porter (merket med "D") indikerte tilstedeværelse av en YFP + cellepopulasjon i transgene mus, men ikke i ikke-transgene kontrollene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Analyser av isolerte bukspyttkjertelen celler. (A) Celler sortert fra bukspyttkjertelen vev av Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP neonatale mus (som beskrevet i figur 2B) ble dyrket for å etablere en cellelinje. Dyrkede celler ble fotografert for fluorescens (grønn, høyre og venstre panel) og fasekontrast (grå, panel til høyre). (B) Bar diagram som viser Vimentin1 (Vim1)uttrykk nivåer av YFP + -sorted celler fra bukspyttkjertelen vev av Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP voksne mus (som beskrevet i figur 1C, grønn), sammenlignet med usortert pankreatisk vev (svart). RNA ble ekstrahert og gen-ekspresjon ble analysert ved qPCR; Uttrykket ble normalisert til Cyklofilin. N = 4. *** p <0,001. Data representerer gjennomsnittet ± SD. (C) Flow-cytometri analyse av dispergert bukspyttkjertelen celler fra Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP voksne mus immuno-farget med allofykocyanin (APC) -konjugert anti-CD9 antistoff og analysert med hensyn på APC (y-aksen) og gul fluorescens (x-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her beskriver vi en metode for å isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen mikromiljøet. Denne fremgangsmåten kan brukes til å isolere mesenchymale celler fra embryonisk og voksen pankreatisk vev. I tillegg har vi med hell brukt denne protokollen for å isolere endotelceller fra den voksne og neonatal bukspyttkjertelen 5, 17. Det kan imidlertid ikke være egnet til å oppnå en reproduserbar enkeltcellesuspensjon av pankreas epitelceller (alternative protokoller er beskrevet i referanser 18 og 23, og 24). Ved hjelp av denne metode, fluorescensmerket-merkede celler, som uttrykker enten fluorescerende proteiner eller immunfarget for overflatemarkører, kan renses ved hjelp av FACS og analysert ved strømningscytometri. RNA kan ekstraheres fra rensede celler for å profilere deres genekspresjon mønster. Alternativt kan renset celler dyrkes for å etablere en cellelinje for påfølgende proteomikk analyse. Denne metoden gjør det mulig å karakterisere faktorer expressed av bukspyttkjertelen mikromiljøet, som styrer sin organogeneseperioden, fysiologi og patofysiologi.

Bukspyttkjertelen mesenchyme støtter vev organogeneseperioden ved å fremme spredning av forløpere og differensierte celler 5, 9. Disse cellene ble vist seg å støtte utvidelsen av humane embryonale stamceller (hESC) avledede bukspyttkjertelen stamfedre 17, 25, 26. Derfor opptegning identiteten til embryonale mesenchymale faktorer vil lette dagens innsats for å generere insulinproduserende betaceller fra hESCs og induserte pluripotente stamceller (iPSCs) som en potensiell kur for diabetes. Muse genetiske studier tillot identifisering av vekstfaktorer, slik som Fgf10, som er produsert ved den mesenchyme for å fremme pankreatisk epitel ekspansjon i løpet av den tidlige fasen av bukspyttkjertel utvikling3, 9. Med mål om å identifisere flere faktorer uttrykt i embryonale mesenchyme, isolert vi disse cellene ved hjelp av laser-fanget mikrodisseksjon, hentet sin RNA, og utført genekspresjonsanalyser 26. Imidlertid, i tillegg til å være arbeidskrevende, Denne metoden kan bare å identifisere celler basert på deres morfologiske egenskaper, noe som begrenser bruken til utviklingsstadier før forgreningen av epitelet i det omkringliggende mesenchyme (dvs. E12.5). For å karakterisere mesenchymalceller på senere utviklingsstadier, ansatt vi metoden beskrevet her 5, 17.

Vi brukte denne metoden til å analysere overflaten markør uttrykk ved neonatal bukspyttkjertelen mesenchyme 5. I tillegg ble mesenchymale celler isolert fra embryoniske og neonatal pankreatisk vev fra Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP mus, på grunnlag avderes fluorescerende merkingen i denne muselinje, og ble dyrket til å etablere cellelinjer 17. Den proteomikk analyse av disse cellene tillatt for identifisering av faktorer som utskilles av den pankreatiske mesenchyme med evnen til å fremme hESC-avledede stamceller pankreatiske 17. Vi videre brukt denne cellen isolasjon metoden for å rense mesenchymalceller fra voksne bukspyttkjertelen vev for RNA-ekstraksjon og analyse av genuttrykk 17. Derfor kan denne metoden anvendes for å identifisere genene og proteinene uttrykt av det pankreatiske mesenchyme, med evnen til å understøtte bukspyttkjertelen celle utvikling.

Pankreas mesenchymale celler ble videre vist å spille en rolle i bukspyttkjertel tumorigenesis. PDAC er karakterisert ved dannelse av en fibroblast-rik desmoplastic stroma består av fibroblaster, immunceller, og ECM 27. Mens stroma ble antatt å fremme utviklingen av mangetyper kreft, ble det vist å beherske PDAC progresjon 15, 16, 28. Dette tyder på at deler av bukspyttkjertelen stroma utskille faktorer som hemmer tumorigenesis. Videre kan forandringer i stroma cellulære sammensetning, så vel som i celle-fenotype ligger til grunn for deres virkning på epitelceller 15, 16, 28. Metoden som beskrives her kan derfor hjelpe til å karakterisere de forskjellige celletyper som utgjør en PDAC stroma sammenlignet med friske pankreas vev. Det ville videre tillate rensing av de forskjellige stromale celletyper for å karakterisere mulige endringer i deres genekspresjonsprofiler under PDAC progresjon. Men på grunn av forandringer i pankreas ECM sammensetning under tumorgenese 27, justeringer av vev fordøyelsen parametere, slik som inkludering av additional kollagenase-typer eller økning av inkubasjonstiden, kan være nødvendig.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213865001
DNase Sigma-Aldrich D5025-15KU The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) Sigma-Aldrich H6648
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
EDTA Biological Industries 01-862-1A
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Goat IgG serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Sigma-Aldrich D9542
RNAse inhibitor Invitrogen N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965092
L-Glutamine Biological Industries 03-020-1B
Penicillin-streptomycin Biological Industries 03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 mL tubes Sarstedt 72 690
15 mL conical tube Corning 430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tube Corning 352008 FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap Cap Corning 352235 FACS tube
70 μm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-462
Heating block with agitation  Eppendorf ThermoMixer C
Centrifuge ThermoFisher Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope Nikon SMZ 745
Cell sorter BD Biosciences FACSAria IIu
flow cytometer Beckman Coulter Gallios 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, (10), 2447-2457 (2002).
  2. Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (7), 2334-2339 (2006).
  3. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326, (1), 4-35 (2009).
  4. Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. 1-8 (2012).
  5. Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9, (9), e1001143 (2011).
  6. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294, (5542), 564-567 (2001).
  7. Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347, (1), 216-227 (2010).
  8. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
  9. Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128, (24), 5109-5117 (2001).
  10. Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142, (22), 3859-3868 (2015).
  11. Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65, (10), 3008-3014 (2016).
  12. Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531, (7596), 647-650 (2016).
  13. Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19, (3), 498-511 (2014).
  14. Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10, (3), 397-405 (2006).
  15. Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25, (6), 735-747 (2014).
  16. Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25, (6), 719-734 (2014).
  17. Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).
  18. Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).
  19. Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136, (5), 1701-1710 (2009).
  20. Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65, (1-2), 145-162 (1997).
  21. Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131, (19), 4665-4675 (2004).
  22. Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. (2014).
  23. Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9, (5), 95486 (2014).
  24. Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63, (10), 3388-3393 (2014).
  25. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491, (7426), 765-768 (2012).
  26. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62, (5), 1581-1592 (2013).
  27. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324, (5933), 1457-1461 (2009).
  28. Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319, (11), 1596-1603 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics