Isolering og analysere celler i bugspytkirtlen mesenchym ved flowcytometri

Developmental Biology
 

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af celler i bugspytkirtlen mikromiljø fra embryonale, neonatale og voksne mus væv, der fokuserer på isolering af mesenchymale celler. Denne fremgangsmåde tillader profilering af celle genekspression og proteinsekretion for at belyse de ydre signaler, som regulerer bugspytkirtel udvikling, funktion og tumorigenese.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Epshtein, A., Sakhneny, L., Landsman, L. Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55344, doi:10.3791/55344 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Energi-homeostase og fordøjelse hos pattedyr afhænger af korrekt pancreasfunktionen. Den voksne pancreas består af to vigtigste cellulære rum: det exokrine og endokrine. Eksokrine celler, herunder de acinære celler, der producerer og udskiller fordøjelsesenzymer og kanal- celler, der transporterer disse enzymer til tarmen, omfatte mere end 80% af den totale pancreas- masse 1. Endokrine celler, som omfatter insulinproducerende betaceller og glucagon-producerende alfa-celler, er organiseret i de Langerhanske øer, der er indlejret i exokrine væv og udskiller hormoner til at regulere blodsukkerniveauet 2.

Pancreasceller erhverve deres differentierede skæbne gennem en meget reguleret, flertrins proces 3. Undersøgelser viser, at ydre signaler leveret af neuronal, endotel- og mesenkymceller guide pankreatisk celledifferentiering og proliferation i than embryo 3, 4, 5. Et eksempel er kravet af aorta for specifikation af tidlige pancreas forstadier 6. Senere i udvikling, blev endotelceller vist at spille en central rolle i udviklingen af både pancreas endokrine og eksokrine celler og fremme beta-celledifferentiering 4, 6, 7. Mesenchymceller viste sig at understøtte overlevelse og ekspansion af fælles pancreas progenitorer, hovedsagelig gennem sekretion af vækstfaktoren Fgf10 8, 9. Vi har yderligere vist, at disse celler understøtter proliferation af endokrine og exokrine prækursorer, samt af differentierede celler (herunder acinære og beta-celler) i den embryoniske pancreas 5. For nylig, mesenkymale celler blev yderligerevist at regulere endokrine celler differentiering 10.

I den voksne, blev beta-cellefunktion og masse vist sig at afhænge af celler i deres mikromiljø, herunder neuronal, immun, og endotelceller samt pericytes 11, 12, 13. Under skade blev endotelceller vist at rekruttere immunceller til bugspytkirtlen til at fremme beta-cellereplikation 13. Endotelceller blev yderligere vist sig at producere ekstracellulær matrix (ECM) komponenter til støtte insulinekspression og beta-cellefunktion 14. Vi har for nylig demonstreret kravet af ø pericytter for beta-cellefunktion 11. Endelig blev cellerne i pancreas stroma vist at regulere udviklingen af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) 15, 16. Imidlertid idenhed af ydre signaler, der styrer bugspytkirtlen udvikling, funktion og tumorigenese er stort set ukendt.

Identificering tidskoder leveret af celler i bugspytkirtlen mikromiljø kræver karakterisering af gener og proteiner udtrykt af disse celler. Dette afhænger af at isolere disse celler fra bugspytkirtlen for at udføre genekspression og proteomikanalyser og / eller på at etablere cellelinier. Her foreslår vi en fremgangsmåde til isolering af mesenchymale celler i bugspytkirtlen mikromiljø ved anvendelse af væv enzymatisk fordøjelse og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af enten immunofluorescently-mærkede celler eller celler, der udtrykker fluorescerende proteiner. Denne protokol blev succesfuldt udført for at isolere og analysere gult fluorescerende protein (YFP) udtrykkende mesenkymale celler i embryonale, neonatal, og voksen pancreas 5, 17.

Protocol

Eksperimenter blev udført i henhold til protokoller, der er godkendt af Udvalget for Animal Forskning ved Tel Aviv University.

1. Isolering af pancreasvæv fra mus

  1. For voksne mus:
    1. Forbered fordøjelsen buffer: 0,4 mg / ml collagenase P og 0,1 ng / ml DNase I opløst i Hanks 'balancerede saltopløsning (HBSS). Frisk forberede 5 ml buffer pr mus i 15 ml konisk rør og holde dem på is indtil brug.
    2. Afliv musene efter institutionel retningslinje.
    3. Dissekere hver mus til at fjerne bugspytkirtlen (for instruktion, se venligst reference 18); placere den i en kultur skål indeholdende HBSS. Det er muligt at udføre dette trin under et stereomikroskop, og øge fordøjelsen effektiviteten, reducere vævet i 2 - 4 stykker.
    4. Placer pancreasvæv i et rør indeholdende fordøjelsessystem puffer (fremstillet i trin 1.1.1). Hold rørene på is indtil alle mus dissekeres og pancreas vævindsamlet.
    5. Gentag trin 1.1.2 - 1.1.4 med de resterende mus.
  2. For embryoner og neonatale mus:
    1. Forbered fordøjelsen buffer: 0,4 mg / ml collagenase P og 0,1 ng / ml DNase I opløst i HBSS. For embryoner og unger på postnatal dag 7 (p7) eller yngre, frisk udarbejde 1.5 - 2 ml buffer pr mus i en 15-ml konisk rør. For p7 eller ældre unger, forberede 3 - 4 ml buffer pr mus i en 15-ml konisk rør. Hold på is indtil brug.
    2. Afliv musene efter institutionel retningslinje. For embryoner, fjerne alle embryoner fra deres mors livmoder og placere dem i et 10-mm kultur skål indeholdende PBS. Dissekere ét embryon på et tidspunkt.
    3. Læg musen på ryggen, med hovedet pegende væk fra investigator. Brug af fine tænger, trække op den abdominale hud og åben ved midterlinjen at blotlægge bughulen op til membranen musen 18.
    4. Ved hjælp af fine pincet, frigøre leveren frabout bagsiden bugvæggen. Med en kontinuerlig bevægelse mod muse hale, øse ud de indre organer (herunder lever, mave, milt, tarme, nyre og bugspytkirtel) og placere dem i en kultur skål indeholdende HBSS.
    5. Under et stereomikroskop, fjerne leveren og nyrerne at blotlægge pancreas (figur 1). Brug af fine tænger, frigøre bugspytkirtlen fra maven, duodenum og endelig fra milten.
    6. Placer pancreasvæv i et rør indeholdende fordøjelsessystem puffer (fremstillet i trin 1.2.1). For P14 eller ældre unger, skæres vævet i 2 stykker for at øge fordøjelsen effektivitet. Hold rørene på is indtil alle mus dissekeres og pancreas væv opsamlet.
    7. Gentag trin 1.2.2 - 1.2.6 med de resterende mus.

2. Pancreas Fordøjelse

  1. Inkuber rørene indeholdende pancreasvæv (i fordøjelsen buffer) i en varmeblok ved 37 ° C i 30 minutter med agitation ved 700 rpm. Efter 15 min, manuelt ryste rørene ved at vende dem 3 - 4 gange, og læg dem tilbage i varmeblokken.
    BEMÆRK: Hvis du bruger en opvarmning blok uden agitation kapaciteter, vend rørene hver 5 - 10 min. Sørg for, at vævet er korrekt fordøjet. Hvis ikke, skæres vævet i mindre stykker, inden inkubering eller øge omrøring.
  2. For at stoppe vævet fordøjelse, placere rørene på is og tilsæt 10 ml koldt HBSS til hvert rør. Centrifuger rørene ved 4 ° C og 300 x g i 5 min og aspirere supernatanten.
  3. Re-suspension:
    1. For voksne mus og p14 eller ældre unger, resuspender pelleten med 6 ml PBS og stamme det gennem en 70-um cellefilter placeret på toppen af ​​et nyt 15-ml konisk samling polypropylenrør. For at sikre maksimal celleindvinding, vaske det oprindelige rør med yderligere 6 mL PBS og stamme det gennem cellesigte på opsamlingsrøret.
    2. For embryoner og hvalpe yngre the p14, genopslæmmes pelleten med 2 ml PBS og stamme det gennem en 35-um cellefilter placeret på toppen af ​​en 5-ml rundbundet polystyren opsamlingsrør (FACS rør). For at sikre maksimal celleindvinding, vaske det oprindelige rør med yderligere 2 ml PBS og stamme det gennem cellesigte på opsamlingsrøret.
  4. Centrifuger rørene ved 4 ° C og 300 x g i 5 min og aspirere supernatanten. Fjern væsken omhyggeligt, som celler er løst fastgjort til polystyrenrør.

3. fremstilling af mærkede enkeltceller

  1. Buffer-præparater: For celleisolering ved FACS, forberede sortering buffer ved at blande PBS (uden calciumchlorid og magnesiumchlorid), 5% føtalt bovint serum (FBS) og 5 mM EDTA. For flowcytometrianalyse, forberede analyse buffer ved at supplere sortering puffer med 0,05% natriumazid. Begge buffere kan opbevares ved 4-8 ° C i op til 2 måneder.
  2. Re-suspendere cellerne i sortering eller analyseringsbuffer. Re-suspendere hver bugspytkirtlen isoleret fra embryoner og hvalpe yngre end p7 i 1 ml, fra hvalpe mellem P8 og en måned gammel i 1,5 ml, og fra mus ældre end en måned i 3 ml. Belaste celler gennem en 35-um cellefilter placeret på toppen af ​​en rundbundet polystyrenrør (FACS rør).
  3. Til farvning kontroller, tegne 50- til 100-pi prøver fra prøverne foretaget i det foregående trin (ikke mere end 5% af det totale prøvevolumen) og placere dem i nye FACS rør; omfatter et rør til hver fluorofor anvendes, herunder DAPI og fluorescerende proteiner, samt for en ufarvet kontrol.
    BEMÆRK: Ved brug transgene mus med celler, der udtrykker et fluorescerende protein, eller når celleantal er begrænset, omfatte en ikke-transgen væv som en farvning kontrol. Hvis celler, der udtrykker et fluorescerende protein anvendes uden yderligere farvning, gå videre til trin 3.8.
  4. Spin-down cellerne ved 300 x g i 5 min ved 4 ° C og aspireres supernatanten.
  5. For blokkonge, re-suspendere cellerne med blokerende opløsning (100 uL sortering eller analyse buffer suppleret med 1 pi ged IgG) og inkuberes i 30 minutter på is.
  6. At farve celleoverflademarkører, fremstille en blanding, der omfatter alle ønskede fluorofor-konjugerede antistoffer i et volumen på 100 pi per prøve. Forbered 2x antistof-fortyndinger i sortering eller analyse puffer (dvs., fortyndes antistoffet til opnåelse dobbelt den krævede koncentration, hvis en slutfortynding på 1: ønskes 200, fortyndes antistoffet 1: 100). Uden vask blokeringsopløsningen, tilsættes 100 pi af blandingen til prøvecellernes at opnå en endelig farvning volumen på 200 pi. Inkuber i 30-60 min på is og i mørke.
  7. For at indstille analysen eller sortering parametre (se trin 4.3 og 5.2), forberede yderligere rør, der kun indeholder et af de anvendte antistoffer (farvning kontrol). Forbered 2x antistoffortyndinger i sortering eller analyse puffer (som beskrevet i trin 3.6). Sørg for at medtage en single fortynding for hver fluorofor anvendt, samt en ufarvet kontrol farvning kontrol. Uden vask blokeringsopløsningen, tilsættes 100 pi af antistof blandinger til cellerne (fremstillet i trin 3.3) for at opnå et endeligt farvning volumen på 200 pi. Der inkuberes i 30 - 60 min på is og i mørke.
  8. Vask ved at fylde hvert rør med analyse eller sortering buffer til en maksimal mængde på 4 ml. Eventuelt re-stamme cellerne gennem et 35 um cellefilter (som beskrevet i trin 3.2).
  9. Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten fjernes forsigtigt.
  10. Re-suspendere prøverne i analyse eller sortering buffer. Re-suspendere celler isoleret fra embryoner i 500 uL, fra hvalpe yngre end en måned i 1 ml, fra 1 - 3 måneder gammel i 2 ml, og fra mus ældre end 3 måneder i 3 ml. Farvning kontrol kan resuspenderes i 300 pi buffer.
  11. Tilsæt 200 ng / ml DAPI ophvirvlede celler for at identificere de døde celler. Sørg for at inkludere et rør containing ufarvede celler uden DAPI for cytometer indstillinger. Fortsæt til cellesortering (trin 4) eller analyse (trin 5).

4. Cell Sortering

  1. Forberedelser:
    1. For cellesortering før RNA-ekstraktion, belægge en 1,5-ml indsamle rør med RNase-inhibitor umiddelbart før sorteringen. Til dette formål tilsættes 1 ml af sortering buffer, indeholdende 0,01 U / ml RNase-inhibitor, til en steril 1,5 ml opsamlingsrør. Efter 5 minutter vortexes røret og fjerne væsken.
    2. For cellesortering før celledyrkning, tilsættes 3 ml steril dyrkning medier (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 20% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin) i en steril 15 ml opsamlingsrør .
  2. Før du lægger et rør ind i en FACS sorteringsanlæg, vortex det kort til at re-suspendere cellerne. Hold de resterende rør på is.
  3. Start med at analysere farvning kontrol for at bestemme sortering parametre (f.eks, (f.eks total cellepopulation, levende DAPI-negative celler og cellepopulationer skal sorteres).
  4. Når sortering parametre og porte er sat op, indlæse prøverne og initiere celle sortering i indsamling rør i.
    BEMÆRK: Sortering betingelser er meget afhængige af instrumentet. Vi anvender en dyse bredde på 100 um, et tryk på 23,1 psi, og en maksimal sortering hastighed på 5.
  5. Fortsæt til RNA-ekstraktion eller dyrkning af sorterede celler.
    BEMÆRK: RNA-ekstraktion, centrifugeres cellerne ved 2.000 xg i 5 min og fjerne den overskydende væske før der fortsættes med en standard ekstraktionsprotokol. Til dyrkning af celler, hvis cellerne blev sorteret under ikke-sterile betingelser, vaske dem to gange ved fyldning af røret med dyrkningsmediet og centrifugering den ved 300 xg i 7 min før dyrkning for at minimere deres kontaminering.

5. Cell Analyse ved flowcytometri

  1. Før loading hvert rør i cytometret, vortex det kort til at re-suspendere cellerne. Hold de resterende rør på is.
  2. Start med at analysere de ufarvede og enkelt-farvede prøver for at bestemme de analyseparametre (f.eks spænding og kompensation).
  3. Når analyseparametre er sat op, indlæse hver prøve, herunder farvning kontrol, og registrere resultaterne. Analyser de opnåede resultater ved hjælp af flowcytometri analyse software.

Representative Results

Den bugspytkirtlen mesenkym er nødvendig under udvikling og voksenlivet. Den her beskrevne fremgangsmåde tillader isolering af mesenchymal-celler fra embryonale, neonatale og voksne pancreas. Mesenchymale celler, men ingen andre celletyper, ekspres gult fluorescerende protein (YFP) i pancreas fra Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP mus 5, 11, 17, 19. Under udvikling, er Nkx3.2 (også kendt som BapX1) udtrykt af embryonisk pankreas-, mave-, og tarmen mesenkym, samt i en undergruppe af skeletal somitter 19, 20, 21. Dette gen blev udtrykt i pancreas mesenkym fra E9.5 indtil E11.5, tillader genekspression under kontrol af Nkx3.2 -Cre fra E9.5 5, 19, 20. Baseret på denne mærkning kan celler oprenses fra bulk-pancreasvæv ved hjælp af flowcytometri. Figur 2 viser et flow-cytometri-analyse af enkeltceller fra embryonale, neonatale og voksne pancreas væv, isoleret som beskrevet her. Mens ikke-transgene pancreas væv ikke indeholdt fluorescerende celler, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP pancreasvæv fra alle analyserede aldre indeholder en særskilt YFP-mærkede cellepopulation (figur 2; markeret med porte).

Ifølge metoden beskrevet her, kan celler, der udtrykker fluorescerende proteiner være enten oprenset eller analyseret ved flowcytometri, med eller uden yderligere immunfarvning. For eksempel, efter sortering baseret på fluorescerende mærkning, mesenchymale celler kan dyrkes for at etablere en cellelinje (i mindst fem passager), som vist i figur 3A. Bemærk t han fibrocytisk morfologi de dyrkede celler, typisk til mesenchymale celler. Desuden blev dette system anvendt til at analysere genekspression ved sorterede celler. Til dette formål blev RNA ekstraheret fra Weaver mesenchymal-celler til at syntetisere cDNA og genekspressionsniveauer blev analyseret ved qPCR. Sådan analyse viste, at sorterede celler udtrykker den pan-mesenchymale markør vimentin (figur 3B). Endelig kan overflademarkør ekspression ved pancreasceller analyseres ved flow-cytometri. For eksempel har vi isoleret celler fra pancreasvæv af Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP voksne mus under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her og farves dem med celleoverfladen glycoprotein CD9, som blev rapporteret at blive udtrykt af fibroblaster 22. Som vist i figur 3C, alle fluorescens-mærkede celler i Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP bugspytkirtlen udtrykker CD9.

tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/>
Figur 1: Embryonale og neonatal pancreasvæv. Isoleret hele mave-tarmkanalen, herunder maven, milten, tarm og pancreas, af en E15.5 embryo (A) og en p4 pup (B). Pancreasvævet er afgrænset med en blå linie. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: mesenchymceller er fluorescensmærket i Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP pancreasvæv. Flow-cytometri analyse af bugspytkirtlen celler isoleret fra ikke-transgene (venstre paneler) og Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP transgene (højre paneler) mus i forskellige aldre: embryonale (A), neonatal (B), og adULT (C). Celler blev analyseret for sidespredning (y-aksen) og gul fluorescens (x-aksen). Gates (markeret med "D") indikerede tilstedeværelsen af en YFP + cellepopulation i transgene mus, men ikke i ikke-transgene kontroller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Analyser af isolerede pancreasceller. (A) Celler sorteret fra pancreasvævet af Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP neonatale mus (som beskrevet i figur 2B) blev dyrket for at etablere en cellelinje. Dyrkede celler blev afbildet til fluorescens (grøn, højre og venstre paneler) og fasekontrast (grå, højre panel). (B) Bar der viser Vimentin1 (Vim1)ekspressionsniveauerne af YFP + -sorterede celler fra bugspytkirtlen væv af Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP voksne mus (som beskrevet i figur 1C, grøn) sammenlignet med usorteret pancreasvæv (sort). RNA blev ekstraheret og genekspression blev analyseret ved qPCR; udtryk blev normaliseret til cyclophilin. N = 4. *** P <0,001. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD. (C) Flow-cytometri-analyse af dispergerede pancreasceller fra Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP voksne mus immunofarvet med allophycocyanin (APC) -konjugeret anti-CD9-antistof og analyseret for APC (y-aksen) og gul fluorescens (x-aksen). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere og analysere celler i pancreas mikromiljø. Denne metode kan anvendes til at isolere mesenchymal-celler fra embryonale og voksen pancreasvæv. Desuden har vi med succes brugt denne protokol til at isolere endothelceller fra den voksne og neonatal bugspytkirtel 5, 17. Det kan dog ikke være egnet til at opnå en reproducerbar enkelt-cellesuspension af pancreasepitelceller (alternative protokoller er beskrevet i referencer 18, 23, og 24). Under anvendelse af denne metode, fluorescens-mærkede celler, der enten udtrykker fluorescerende proteiner eller immunfarvet for overflademarkører, kan oprenses ved FACS eller analyseres ved flowcytometri. RNA kan ekstraheres fra oprensede celler at profilere deres genekspression mønster. Alternativt kan oprensede celler dyrkes for at etablere en cellelinje til efterfølgende proteomanalyse. Denne metode vil muliggøre karakterisering af faktorer expressed af bugspytkirtlen mikromiljø, der regulerer dens organogenese, fysiologi og patofysiologi.

Den bugspytkirtlen mesenkym understøtter væv organogenese ved at fremme udbredelsen af prækursorer og differentierede celler 5, 9. Disse celler viste sig at støtte udvidelsen af humane embryonale stamceller (embryonale) afledte pancreas stamfædre 17, 25, 26. Derfor afgrænser identiteten af ​​embryonale mesenkymale faktorer vil lette igangværende bestræbelser på at generere insulinproducerende betaceller fra hESCs og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) som en potentiel kur til diabetes. Mus genetiske undersøgelser tillod identifikation af vækstfaktorer, såsom Fgf10, der er produceret af mesenchymet at fremme bugspytkirtlen epitel ekspansion i de tidlige stadier af bugspytkirtlen udvikling3, 9. Med henblik på at identificere yderligere faktorer udtrykt i embryonale mesenkym, vi isolerede disse celler ved hjælp af laser-fanget mikrodissektion, udvundet deres RNA, og udførte genekspression analyse 26. Men ud over at være arbejdskrævende intens, denne metode beror på at identificere celler baseret på deres morfologiske træk, som begrænser brugen til udviklingsstadier før forgreningen af epitelet i den omgivende mesenkym (dvs. E12.5). For at karakterisere mesenchymale celler på senere udviklingsstadier, anvendte vi den her beskrevne fremgangsmåde 5, 17.

Vi brugte denne metode til at analysere overfladen markør udtryk ved neonatal bugspytkirtlen mesenkym 5. Desuden blev mesenchymal-celler isoleret fra embryonale og neonatal pancreasvæv af Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP mus, baseret påderes fluorescerende mærkning i denne mus linie, og blev dyrket til at etablere cellelinier 17. Den proteomisk analyse af disse celler er tilladt for identifikation af faktorer, der udskilles af pancreas mesenkym med evnen til at fremme hESC-afledte pancreas progenitorer 17. Vi anvendte yderligere denne celle isolation metode til at oprense mesenchymal-celler fra voksne pancreas væv til RNA-ekstraktion og genekspression analyse 17. Derfor kan denne metode anvendes til at identificere gener og proteiner udtrykt af den pankreatiske mesenkym, med evnen til at understøtte pancreas celleudvikling.

Pankreatiske mesenkymale celler blev yderligere vist at spille en rolle i pancreas tumorigenese. PDAC er karakteriseret ved dannelsen af en fibroblast-rige desmoplastiske stroma består af fibroblaster, immunceller, og ECM 27. Mens stroma blev anset for at fremme udviklingen af ​​mangetyper af kræft, blev det vist at begrænse PDAC progression 15, 16, 28. Dette antyder, at komponenter af pancreas stroma secernerer faktorer, der hæmmer tumorigenese. Endvidere kan ændringer i stroma cellulære sammensætning samt i cellefænotype ligge til grund for deres virkning på epitelceller 15, 16, 28. Den her beskrevne metode kan derfor bidrage til at karakterisere de forskellige celletyper, der udgør en PDAC stroma sammenlignet med raske pancreasvæv. Det ville endvidere tillade oprensning af de forskellige stromale celletyper at karakterisere potentielle ændringer i deres genekspressionsprofiler under PDAC progression. Men på grund af ændringer i pancreas ECM sammensætning under tumorigenese 27, justeringer af vævsfordøjelse parametre, såsom optagelse af additional collagenase typer eller forøge inkubationstiden, kan være påkrævet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213865001
DNase Sigma-Aldrich D5025-15KU The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) Sigma-Aldrich H6648
Fetal Bovine Serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
EDTA Biological Industries 01-862-1A
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002
Goat IgG serum Sigma-Aldrich G9023
DAPI Sigma-Aldrich D9542
RNAse inhibitor Invitrogen N8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965092
L-Glutamine Biological Industries 03-020-1B
Penicillin-streptomycin Biological Industries 03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride
1.5 mL tubes Sarstedt 72 690
15 mL conical tube Corning 430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tube Corning 352008 FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap Cap Corning 352235 FACS tube
70 μm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-462
Heating block with agitation  Eppendorf ThermoMixer C
Centrifuge ThermoFisher Heraeus Megafuge 40R
Steromicroscope Nikon SMZ 745
Cell sorter BD Biosciences FACSAria IIu
flow cytometer Beckman Coulter Gallios 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, (10), 2447-2457 (2002).
  2. Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (7), 2334-2339 (2006).
  3. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326, (1), 4-35 (2009).
  4. Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. 1-8 (2012).
  5. Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9, (9), e1001143 (2011).
  6. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294, (5542), 564-567 (2001).
  7. Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347, (1), 216-227 (2010).
  8. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
  9. Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128, (24), 5109-5117 (2001).
  10. Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142, (22), 3859-3868 (2015).
  11. Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65, (10), 3008-3014 (2016).
  12. Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531, (7596), 647-650 (2016).
  13. Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19, (3), 498-511 (2014).
  14. Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10, (3), 397-405 (2006).
  15. Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25, (6), 735-747 (2014).
  16. Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25, (6), 719-734 (2014).
  17. Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).
  18. Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).
  19. Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136, (5), 1701-1710 (2009).
  20. Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65, (1-2), 145-162 (1997).
  21. Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131, (19), 4665-4675 (2004).
  22. Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. (2014).
  23. Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9, (5), 95486 (2014).
  24. Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63, (10), 3388-3393 (2014).
  25. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491, (7426), 765-768 (2012).
  26. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62, (5), 1581-1592 (2013).
  27. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324, (5933), 1457-1461 (2009).
  28. Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319, (11), 1596-1603 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics