Published 2/13/2017
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Immunology and Infection

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Summary

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Udden, S. M., Waliullah, S., Harris, M., Zaki, H. The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies. J. Vis. Exp. (120), e55347, doi:10.3791/55347 (2017).

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Abstract

腸上皮細胞の異なるタイプ、ラミナの免疫細胞を含むpropia、及び間質からなる反復陰窩構造のアーキテクチャを表示します。これらの異種の細胞のすべてが腸の恒常性に貢献し、抗菌宿主防御に参加しています。したがって、 インビトロの設定で免疫応答および腸の抗菌活性を研究するための代用モデルを特定することは極めて困難です。 インビトロ研究は、不死化腸上皮細胞株または正常な腸とその微小環境の正確な生理機能を表すものではありませんオルガノイド培養しても、プライマリのcryptを使用。ここでは、培養皿とどのようにこのex vivoの器官培養系抗菌宿主防御応答に関連した研究で実装することが可能で、マウスの結腸組織を培養する方法を議論します。代表的な実験では、器官培養内のコロンがRESPにおける抗菌ペプチドを発現することを示しました外因性IL-1βおよびIL-18にオンセ。さらに、器官培養における大腸組織によって生成された抗菌エフェクター分子を効率的にin vitroで大腸菌を殺します。このアプローチは、従って、腸の自然免疫応答および抗菌宿主防御応答の調節における病原体及び危険関連分子パターンとその細胞受容体の役割を分析するために利用することができます。

Introduction

腸は、共生微生物、病原体の侵入と戦うための障壁として作用する動的システムを表し、及び微生物組成物1を調節します 。腸上皮細胞は、腸細胞、杯細胞、パネート細胞および腸内分泌細胞からなる、腸内微生物叢に対する宿主防御反応を提供する主要な細胞集団です。杯細胞は、上皮層2の上に非武装地帯を作成するムチンを産生します。パネート細胞および腸細胞は、抗菌性ペプチド、サイトカイン、および抗菌宿主防御応答を構成し、腸内微生物組成物3、4整形に寄与し、反応性酸素及び窒素種を生成します。上皮細胞に加えて、マクロファージを含む免疫細胞、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、リンパ球、およびインナ 7 -粘膜固有層および粘膜下組織のTEリンパ球様細胞は、サイトカイン、ケモカイン、および他のメディエーター5を生成することによって、腸抗菌宿主防御応答に重要な役割を果たしています。粘膜免疫系は、微生物叢を調節し、微生物感染に対する保護を提供する方法を理解するためには、消化管の不均一な細胞集団の複雑な相互作用を考慮することが重要です。しかし、腸の機能をすべて網羅in vitroモデルは使用できません。したがって、腸における宿主 - 病原体相互作用に関する分子研究は非常に挑戦的です。

過去数年にわたり、腸粘膜の側面を模倣するいくつかのモデル系は、炎症性腸疾患(IBD)および他の胃腸障害8に関わる病態生理学的プロセスを研究するために開発されています-= "外部参照"> 14。不死化された腸上皮細胞系は、しばしば、上皮細胞特異的応答を研究するために使用されます。しかし、不死化細胞における示差的遺伝子発現および機能の、これらの細胞を使用することから得られたデータは、多くの場合、in vivo試験で観察されたものと一致していません。最近、種々の刺激13への腸管上皮の応答を評価するための潜在的なツールとして浮上してきたオルガノイド文化腸陰窩。このシステムでは、陰窩の幹細胞が増殖し、3Dオルガノイド構造を開発することが許可されています。オルガノイド培養システムは、腸管上皮の多くの側面を研究するために非常に有用であるが、それは、免疫細胞、上皮細胞および微生物産物の複雑な相互作用を模倣しません。腸組織のex vivo培養は、in vivo宿主防御応答のよりよい表現を提供しています。この方法では、腸の一部が細胞培養プレートウィットで培養します腸内の細胞集団の異なるタイプが、少なくとも48時間、代謝的に活性であることを可能にする時間の適切な媒体。このように、臓器のエクスビボ培養物は、抗菌性の遺伝子の発現と特定の刺激に対する腸の宿主防御応答を測定するために使用することができます。

21 -研究者は、腸15内の微生物感染に対する宿主防御応答を研究するためのex vivoでの器官培養系を使用してきました。我々は最近、マウスのコロン22における抗菌宿主防御応答におけるインフラマソームの役割を研究するために器官培養系を採用しました。インフラマソームが成熟IL-1βおよびIL-18の産生のために必要とされるカスパーゼ1の活性化のための分子プラットフォームです。我々は、IL-1βおよびIL-18が効果的に大腸菌など共生pathobiontsを殺す抗菌ペプチドを誘発することが示されました22で増加した大腸菌負担と一致しました。このシステムは、したがって、パターン認識受容体(PRR)および腸抗菌宿主防御応答の他の先天性免疫の分子の役割だけでなく、そのような炎症性腸疾患(IBD)および結腸直腸癌(CRC)のような腸疾患の病因を研究するために使用することができます。そこに200以上のIBD感受性遺伝子であり、これらの遺伝子の多くの突然変異は、腸内で改変された微生物組成物に関連しています。これは、IBD感受性遺伝子が腸内細菌叢を調節するを通じて正確なメカニズムを決定するために偉大な臨床的意義のあります。この方法の全体的な目標は、ex vivoで結腸器官培養の基本的なプロトコルを導入し、この培養方法は、腸の抗菌宿主防御応答を研究するために使用することができる方法を示すことです。

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Protocol

ここで説明する全ての実験は、動物資源センター(ARC)、サウスウエスタン大学医療センターの特定病原体不在(SPF)施設で維持さ6〜8週齢の雄の野生型(C57BL6 / J)マウスを用いて行きました。すべての研究では、施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたとIACUCガイドラインおよび実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行いました。

1.収集とコロンの調製

  1. 頸椎脱臼に続いてCO 2窒息でマウスを安楽死させます。
  2. 70%エタノールをマウスにスプレーし、ボード上のダウンマウスの背側を維持ピニングボードに手足をピン。
  3. 予め滅菌解剖ハサミとピンセットを用いて、腹部の腹膜に中線切開を行います。鉗子で腹膜を折り畳むことにより、腹部を開きます。
  4. 腹腔のwiから腸を削除します鉗子とはさみを解剖番目。盲腸の底部と直腸にもう一方の端に切断することにより、小腸からコロンを区切ります。
  5. 氷冷PBSを含む滅菌ペトリ皿にコロンを置きます。コロンのルーメン内の便が完全に除去されるまで20 G針または経口胃管栄養針を保持する20 mLの注射器を使用して氷冷PBSで、大腸の内腔の内容をフラッシュします。
  6. 縦にハサミでコロンをカット。滅菌ペトリ皿に氷冷PBS中で激しく振とうすることにより、大腸を洗浄します。
  7. 約1cmの長滅菌メスやハサミを使用して小片に結腸組織をカット。
  8. 結腸片の重量を記録します。
    注:第1節のすべてのステップは、内部または生物学的安全キャビネットの外側のいずれかを行うことができます。コロンは、培養のための準備ができたら、すべてのステップは、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネット内で実行する必要があります。

2.大腸組織文化

  1. 6ウェル細胞培養プレート上の細胞ストレーナー(100μm)を置きます。セルストレーナーに1匹のマウスから採取した結腸作品のすべてを転送します。
  2. 5%FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン(1×)、およびゲンタマイシン(20μg/ ml)を含有する5mlのDMEM / F12培地を追加します。完全にメディアと大腸の部分をカバーしています。
  3. 5%CO 2、95%空気インキュベーター中で37℃で2時間インキュベートします。
  4. セルストレーナーを持ち上げて、メディアを吸引除去します。
  5. バックも上のセルストレーナーを配置し、任意の抗生物質を含まない5ミリリットルに新鮮な培地を追加します。セルストレーナーを持ち上げて、メディアを吸引除去します。
  6. 残留抗生物質のすべてを除去するために、上記の洗浄工程(ステップ2.5)を2回以上(合計3回)繰り返します。
  7. 滅菌12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに、単一のセルストレーナーからコロン片を転送します。
  8. (任意の抗生物質を含まない)は、5%FBSを含むDMEM / F12培地を追加します。 weigでメディアの音量を調整します結腸片のHT、 例えば 、100mgの組織のための1ミリリットル培地。 5%CO 2および95%空気を注入し、インキュベーター中で37℃で12時間インキュベートします。
  9. 無菌の1.5mlチューブに培養上清を収集します。
  10. 5分間、4℃、12,000×gで遠心分離します。アッセイおよび/または他の免疫アッセイを殺す細菌中での使用のための新たな1.5 mLチューブに上清を分離します。上清を分析まで-80℃で保存することができます。
  11. RNA単離のためのチューブでコロン片を収集します。

アッセイキリング3. 大腸菌

  1. 15mlチューブに5mLのルリア-ベルターニ(LB)ブロス中で大腸菌を接種し、一晩200 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。少しゆるめ培養管のキャップを保管してください。
  2. 4℃で10分間、1200×gで遠心分離細菌の培養管。上清を除去し、5mlの氷冷PBSに細菌ペレットを再懸濁します。
  3. BACTの移転を1mL600 nmでのキュベットとメジャーODにerialサスペンション。ブランクとしてPBSを使用してください。
  4. 所定の標準曲線を用いて、コロニー形成単位(CFU)を計算します。ここでは、(約)1 OD = 2×10 9 CFU / mlのことを想定しています。
  5. ストック懸濁液1×10 5 CFU / mLのを作るために細菌懸濁液を希釈します。
  6. 24ウェル細胞培養プレートの複製ウェルに2.10に収集結腸器官培養上清を転送する(500μL/ウェル)。
  7. 1つのウェルを含む500μL大腸器官培養上清中に10μLの大腸菌培養液(千CFU)を追加します。大腸器官培養上清は、任意の汚染が含まれていないことを確認するために、任意の大腸菌接種せずに他のままにしておきます。
  8. コントロールとして任意の抗生物質を含まない培地(DMEM / F12 + 5%FBS)中の細菌の数が同じ(千CFU)をインキュベートします。
  9. 1時間37℃でインキュベートします。
  10. 各サンプルドロップのwiの50μLを配置SEマッコンキー寒天プレート上。 37℃で一晩マッコンキー寒天プレートをインキュベートします。
  11. コロニーの数をカウントし、CFU / mlで計算します。

4.結腸抗菌宿主防御応答に対する外因性および内因性因子の影響

注:ここで説明したように、抗菌性殺傷アッセイ、器官培養上清の殺菌活性の病原体関連分子パターン(のPAMPs)およびサイトカインの効果を調べるために採用することができます。 IL-1βおよびIL-18を使用して、このような実験例について説明します。

  1. 第1節で説明したようにマウスの大腸を収集します。
  2. 滅菌ペーパータオル上でコロンを置きます。はさみを使用して、3つの部分( 図2)へ縦方向にコロンをカット。
  3. 第1節で説明したように、氷冷PBS中で、結腸の各部分を洗います。
  4. 小片に結腸の各部分をカットし、無菌的に重量を量ります。各パーツの部分を転送します6ウェル細胞培養プレートの3つのウェル( 図2)上に配置された3つの別々のセルストレーナー(100ミクロン)に結腸。
  5. 5%FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン(1×)、およびゲンタマイシン(20μg/ ml)を含有する2ミリリットルのDMEM / F12培地を追加します。
  6. 5%CO 2および95%空気を注入し、インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートします。
  7. 2.4から2.6に記載されているように、コロンの部分を洗います。滅菌12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに、単一のセルストレーナーのコロンの部分を転送します。単一のマウスからの結腸の3部を含む3つのウェルは、未処理のIL-1β、およびIL-18( 図2)として指定する必要があります。
  8. (任意の抗生物質を含まない)は、5%FBSを含むDMEM / F12培地を追加します。結腸片の重量、 例えば 、100mgの組織のために1 mLの培地で培地の音量を調整します。
  9. 12時間IL-1β(20 ngの/ ml)またはIL-18(20 ngの/ mL)で大腸器官培養を刺激します。未処理のコロン器官培養は、コントロールとして機能します。
  10. 5%CO 2および95%空気を注入し、インキュベーター中で37℃で12時間インキュベートした後、滅菌した1.5 mLチューブに培養上清を収集します。
  11. 24ウェルプレートの複製ウェルに500μLの培養上清を移します。
  12. 各条件については、項3に記載のように単一のウェルに大腸菌を接種し、大腸器官培養上清中の大腸菌 (千CFU)を接種します。ウェル大腸菌なしで同一の器官培養上清を含む他の細菌汚染の対照として役立ちます。
  13. コントロールとして、任意の抗生物質を含まない培地中で細菌の同量をインキュベートします。
  14. 1時間37℃でインキュベートします。
  15. 滴下マッコンキー寒天プレート上の各サンプルの50μLを置きます。 37℃で一晩のためにマッコンキー寒天プレートをインキュベートします。
  16. コロニーの数を数え、CFU / mLの( 図4)を計算ます。
e_title "> 5。抗菌遺伝子の発現の測定

  1. セクション2および4に記載されているように結腸器官培養物の一晩のインキュベーション(12時間)後、2 mlの氷冷PBS(2×)で結腸片を洗浄します。
  2. 2 mlのRNase / DNaseを無料でスクリューキャップチューブにコロン片を収集します。氷の上にチューブを入れます。
  3. 1ミリリットルを商業Trizol試薬を加え、チューブにマトリックスビーズを溶解。
  4. 溶解自​​動組織ホモジナイザーを用いて組織。
  5. 新しいマイクロチューブに組織溶解液を収集します。
  6. 標準プロトコルを用いてRNAを分離します。
  7. RNA濃度を測定します。
  8. 脱イオン水で適切にRNAを希釈し、cDNAを合成するために500 ngのRNAを使用します。
  9. 標的抗菌遺伝子、サイトカイン、ケモカイン、および目的の他の遺伝子のリアルタイムRT-PCR分析のためのcDNAを使用します。

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Representative Results

器官培養における結腸の代表的な画像は、 図1に示されています。文化の中でコロン片は、代謝および生理活性のまま。彼らは、培養培地に添加外因性の刺激に効率的に対応します。 ex vivoで培養し、外因性刺激による刺激、 例えば、IL-1βおよびIL-18結腸組織の調製の概略的な作業の流れは、 図2に示されています。器官培養中のコロンは、IL-1βおよびIL-18に応答して、このようなβデフェンシン2(BD2)、Reg3γ、S100A8、S100A9、およびiNOSなどの抗菌ペプチドを発現図3ショーで代表的なデータ。

結腸インプラントによって放出メディエーターは、器官培養上清とともにインキュベートした大腸菌 (有意に減少増殖によって示されるように抗菌死滅効果を示します4B図。 大腸菌殺傷活性はさらに、IL-1βおよびIL-18( 図4Aおよび4B)の刺激によって増強されます。 大腸菌なしでインキュベートした結腸器官培養上清をマッコンキー寒天培地( 図4Cおよび4D)で培養後ない細菌の増殖を示しません。これらの結果はさらにソームは、腸抗菌宿主防御に重要な役割を果たしていることを示唆しています。

全体的に、ここに示されたデータは、ex vivoで結腸の器官培養は、in vitroで腸抗菌免疫応答を研究するための非常に有用な技術であることを示唆しています。

GAPDH_F TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC
GAPDH_R AAGATGGTGATGGGCTTCCCG
βデフェンシン2(BD2)_F TGACCACTGCCACACCAATG
βデフェンシン2(BD2)_R CCTGGCAGAAGGAGGACAAA
Reg3γ_F CAAGGTGAAGTTGCCAAGAA
Reg3γ_R CCTCTGTTGGGTTCATAGCC
S100a8_F TGTCCTCAGTTTGTGCAGAATATAAA
S100a8_R TCACCATCGCAAGGAACTCC
S100a9_F GGTGGAAGCACAGTTGGCA
S100a9_R GTGTCCAGGTCCTCCATGATG
iNOS_F TGTGACACACAGCGCTACAACA
iNOS_R GAAACTATGGAGCACAGCCACAT

表1:リアルタイムPCR用のマウスプライマーの一覧。


図1:培養中のマウス結腸片の代表的な画像。 (A)6ウェルプレート上に置かれ、セルストレーナー(100ミクロン)の結腸片のインキュベーション。結腸片を、抗生物質を補充した2mLの培地中に浸漬されています。 2時間のインキュベーションの後(B)は 、結腸の部分は、抗生物質を含まない培地を含む新たな12ウェル細胞培養プレートのウェルに移します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:大腸組織を調製するための手順の概略プレゼンテーションおよびIL-1βおよびIL-18とのex vivoで刺激。 1マウスのコロンはlongiです tudinally三つの部分に解剖しました。各部分は、小片に切断し、秤量しました。結腸の各セクションからの結腸片を2mlのDMEM / F12培地+ 5%FBSおよび抗生物質を含有する6ウェルプレートのウェル上に配置されたセルストレーナーに転写されます。 2時間のインキュベーションに続いて、単一の細胞ストレーナーから結腸片を12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに移します。 DMEM / F12 + 5%FBSを(抗生物質なし)を各ウェルに添加し、培地の容積は、組織(100mgの組織のための1mLの培地)の重量に応じて調整されます。結腸組織を12時間IL-1β(20ng / ml)およびIL-18(20 ngの/ ml)で刺激します。培養上清を遠心分離し、 大腸菌死滅アッセイおよび/または他の免疫アッセイに使用されます。結腸組織をRNA単離およびリアルタイムPCRによる抗菌性遺伝子発現のその後の分析のために商業的トリプシン試薬に収集されます。.jpgの「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:マウスの大腸組織は、ex vivo培養中のIL-1βまたはIL-18に応答してサイトカインおよび抗菌ペプチドを発現します。結腸の器官培養物を12時間、IL-1β(20 ngの/ ml)またはIL-18(20 ngの/ ml)で刺激しました。 BD2、Reg3γ、S100A8、S100A9、およびiNOSの発現は、リアルタイムRT-PCR( 表1)で測定しました。データは、平均±SDを表します。 * P <0.05、** P <0.01。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:マウス大腸臓器カルトの上清UREは、殺菌活性を示します。結腸片を12時間IL-1β(20 ngの/ ml)またはIL-18(20 ngの/ ml)の存在下または非存在下でエクスビボで培養しました。培養上清500μlを37℃で1時間、大腸菌 (千CFU)と共にインキュベートしました。 大腸菌なし結腸器官培養上清を対照としてインキュベートしました。 1時間のインキュベーション後、各試料の50μLをマッコンキー寒天プレートに滴下して入れ、37℃で一晩インキュベートしました。大腸器官培養の抗菌活性を示す寒天マッコンキー上の大腸菌コロニーの(A)の画像。 (B) 大腸菌数は、IL-1β-およびIL-18で処理した結腸器官培養上清の効率を殺す示します。 (C) 大腸菌なしでインキュベートした大腸器官培養には細菌の増殖を示さないマッコンキー寒天プレートの写真。 (D)大腸菌コロニーは、結腸器官Cにおいて同定されましたultureは、試料中の任意の汚染細菌の非存在を示す、 大腸菌なしでインキュベートしました。データは、平均±SDを表します。 ** P <0.01、*** P <0.001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

腸上皮細胞は、それらの増殖要件の点で非常に敏感で培養することが困難です。 EDTA処理により単離された上皮細胞は、DMEM 8のような従来の細胞培養培地中で生存しません。そのため、孤立した陰窩または一次上皮細胞を用いて、宿主 - 病原体相互作用の研究は非常に困難です。最近、佐藤ら。腸の病態生理13に関連した研究のための非常に有望かつ有用である陰窩オルガノイド培養系を説明しました。オルガノイドは腸陰窩の多くの特徴を示しているが、無菌環境で栽培されているオルガノイド細胞の免疫応答は、 生体内で腸上皮細胞の応答を再現するかどうかの懸念があります。上皮幹細胞とオルガノイドの文化のための高価な試薬の要件の単離および培養のために必要とされる正確な技術はミリアンペアを防ぎますこのシステムを利用することからNY研究所。 ex vivoでの器官培養の使用がオルガノイド文化に代わるものではありませんが、このシステムは、腸上皮の抗菌応答を研究するための簡単で安価な方法を提供しています。

この手法の主な利点は、皿で培養しながら、腸の組織構造が維持されることです。我々は、大腸組織が彼らの文化の後、少なくとも24時間、生理活性であることを観察しました。サイトカインおよび抗菌ペプチドの発現により測定されるようなコロンの培養の間、結腸上皮細胞は、外因性刺激に応答します。無傷の組織の上皮細胞の生存能力は、さらに、培養培地中で適切な成長因子と細胞死の阻害剤を添加することによって向上させることができます。以前の報告は数日間8のためにex vivoでの正常ヒト結腸組織の器官を維持することができたことを示唆していますSUP>、23、24。

マウス結腸器官のex vivo培養のためのプロトコルは、腸上皮の抗菌免疫応答に関連した研究で多くのアプリケーションを有することができます。病原体およびそれらのPAMPは、Toll様受容体(TLR)および上皮細胞および免疫細胞に存在するNOD様受容体(NLRs)などのPRRによって認識されています。多くのTLRとNLRsの欠陥発現および機能は、IBDへの感受性、結腸直腸腫瘍形成、および細菌感染に関連しています。不死化上皮細胞株は、腸のニッチのすべての機能を表すものではありませんので、ex vivoで結腸器官培養は、非常に有用な実験ツールです。このシステムを使用して、我々は、腸管上皮細胞における抗菌エフェクター分子の誘導に対する様々なのPAMPまたは刺激の効果を調べることができます。代表的な実験では、サイトカインが好きなことを示しましたIL-1βおよびIL-18のトリガー抗菌ペプチドの発現( 図3)。我々はまた、結腸組織によって生成される抗菌ペプチドが効果的に大腸菌図4)を殺すことができることをここに示します。これらの技術は、ムラミルジペプチド(MDP)、リポ多糖(LPS)、ペプチドグリカン(PGN)の影響をテストするために適用され、そして腸における抗菌宿主防御応答の他のPAMPできます。

私たちは、少し以前に12、16、20、25説明したように、コロンの器官培養プロトコルを変更しました。我々は2つのフェーズでコロンを培養しました。最初に、私たちは2時間、培地を含む抗生物質での結腸組織をインキュベートしました。私たちは、その後、抗生物質を含まない培地で培養した結腸片の繰り返し洗浄と抗生物質を除去しました。したがって、培養上清を一晩培養物から得られました大腸展示大腸菌とインキュベートし、分泌抗菌ペプチドの効果のみ。このアプローチは、目的の任意の細菌に対して結腸または腸由来の抗菌ペプチドの殺菌効果を確認するために利用することができます。適切な選択寒天培地は、細菌を培養するために使用されるべきです。

ほとんどの技術と同様に、 エキソビボ器官培養系の限界があります。まず、細胞培養またはオルガノイド文化とは異なり、臓器が成長し、増殖するため、拡張することはできませんしないでください。第二に、腸上皮細胞は非常に敏感であり、彼らは陰窩オルガノイド培養に使用される追加の増殖因子およびアポトーシス阻害剤、なしで比較的早く死にます。第三に、器官培養から見た免疫応答は、細胞集団の異なる種類の集合的応答です。したがって、抗菌性およびエフェクター遺伝子の発現の個々の細胞タイプの役割を評価することはできません。 Additionally、細胞株およびオルガノイド文化とは異なり、コロンで抗菌ペプチドおよび他のエフェクター分子の発現は、マウスから同じ遺伝的背景のマウスに異なる場合があります。

要約すると、我々はここで、腸の抗菌免疫応答を研究するために非常に有用であるex vivoで結腸の器官培養のための単純なプロトコルを記述します。このアプローチは、目的の遺伝子変異マウスから結腸を培養することにより、抗菌ペプチドの発現の多様な自然免疫の遺伝子の役割を試験するために使用することができます。さらに、このプロトコルは、結腸生検サンプルの器官培養を行うことにより、IBD患者の腸の抗菌応答を調べるために臨床試験での使用に適合させることができます。

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Acknowledgements

MHZに与えられた、とUTサウスウェスタン医療センター、がん予防テキサスの研究所(RP160169 CPRIT);この作業は、クローン病とアメリカの大腸炎財団、(3711 CCFA)からの資金によってサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/ F12 Life Technologies 12634-010
Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride Sigma 5634
FBS, heat inactivated Sigma F4135
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15070063
Gentamicin solution Sigma G1272
Mouse IL-1b recombinan Reprokine RKP10749
Mouse IL-18 recombinant Reprokine RKP70380
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Difco Luria-Bertani Broth  BD Bioscience 244620
BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar Fisher Scientific DF0075-17-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific Uded to measure RNA concentration
UV/Vis Spectrophotometer BECKMAN DU 530 Used to determine E. coli count
iScript RT Supermix, 100 rxns Bio-Rad 1708841
iTaq Univer SYBR Green Supermix  Bio-Rad 1725125 
Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube MP Biomedicals 116925500 Used to homgenize colon organ for RNA isolation
FastPrep-24 5G System Bio-Rad 116005500
100 mm x 15 mm Petri Dish Falcon 5687
Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile Cellstar 5085
100 μm cell strainer Falcon 5698
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge Thermo Fisher Scientific
Sorvall ST40R Centrifuge Thermo Fisher Scientific
Forma Scientific orbital shaker Thermo Fisher Scientific

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References

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