Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Biochemistry

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Summary

Questo protocollo descrive la ricostituzione dei nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Allo stesso tempo, nucleosomi asimmetricamente post-traduzionali modificati possono essere generati dopo utilizzando una copia istone premodified. Queste preparazioni possono essere facilmente utilizzati per studiare i meccanismi modifica diafonia, contemporaneamente su entrambi istoni sorella, utilizzando la spettroscopia NMR ad alta risoluzione.

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Liokatis, S. Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones. J. Vis. Exp. (121), e55349, doi:10.3791/55349 (2017).

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Abstract

nucleosomi asimmetricamente modificati contengono le due copie di un istone (istoni sorella) decorati con distinte serie di modificazioni post-traduzionali (PTM). Essi sono di nuova specie identificate con mezzi sconosciuti di stabilimento e implicazioni funzionali. metodi di analisi attuali non sono sufficienti per rilevare la presenza specifica copia dei PTM sulle istoni sorella nucleosomal. Questo protocollo presenta un metodo biochimico per la ricostituzione in vitro di nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Il complesso generato può essere anche asimmetricamente modificato, dopo tra cui una piscina istone premodified durante ripiegamento di Sottocomplessi istoni. Queste preparazioni nucleosoma asimmetriche possono essere prontamente reagito con enzimi istone modificanti per studiare i meccanismi di modifica di cross-talk imposte dal PTM asimmetricamente pre-incorporato usando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). In particolare, le reazioni di modifica inin tempo reale può essere mappato in modo indipendente sui due sorelle istoni eseguendo diversi tipi di esperimenti di correlazione NMR, su misura per il tipo di isotopo. Questa metodologia fornisce i mezzi per studiare i meccanismi diafonia che contribuiscono alla formazione e propagazione di modelli PTM asimmetrici su complessi nucleosomal.

Introduction

DNA eucariotica è strettamente confezionato all'interno di nuclei cellulari in cromatina. L'elemento fondamentale della cromatina è la particella nucleo nucleosoma che contiene ~ 147 bp di DNA avvolto attorno ad un complesso octameric costituito da due copie ciascuna delle quattro istoni di base (H3, H4, H2A, H2B). proteine ​​istoniche porto una pletora di modificazioni post-traduzionali (PTM). Queste sostituzioni covalenti inducono alterazioni nella struttura della cromatina, sia direttamente modificando la chimica fisica del sistema e, indirettamente, con l'assunzione di attività della cromatina-rimodellamento 1, 2, 3. Con tali mezzi, PTM istoni controllano cromatina accessibilità e, quindi, di regolare tutte le funzioni cellulari 4 basati sul DNA.

PTM vengono installati sistemi enzimatici istoni modificanti principalmente sui segmenti N-terminale non strutturati (code) di isto nucleo nucleosomi-incorporatones. A causa dei numerosi siti di modifica sulla relativamente breve sequenza di code degli istoni, PTM influenzano a vicenda inducendo o bloccando le reazioni successive di modifica, un effetto noto come modifica cross-talk 5. A causa della architettura simmetrica generale del nucleosoma, si pensava reazioni di modificazione e meccanismi di crosstalk a verificarsi in modo simile sui due copie di ogni istone nucleosomal (istoni sorella). Questo concetto è stato recentemente sfidato e successivamente smentita. In particolare, in vitro saggi enzimatici sulla libera istone H3 peptidi coda e sulle nucleosomi hanno dimostrato che una serie di chinasi H3 introdotto fosforilazione in maniera asimmetrica 6. Inoltre, l'analisi LC-MS / MS a base di affinità purificazione rivelato l'esistenza di nucleosomi asimmetricamente H3-metilato in diversi tipi di cellule eucariotiche 7. Così, nucleosomi asimmetricamente modificati costituiscono specie romanzo, egli strumenti sono necessari per scoprire i meccanismi che controllano la loro formazione e per analizzare gli effetti di crosstalk che questa asimmetria potrebbe esercitare.

Comunemente, Western Blotting (WB) e spettrometria di massa analisi (MS) sono stati utilizzati per rilevare PTM istoni. Nonostante la sua facilità di applicazione, WB soffre di problemi di specificità / cross-reattività. In cima a quello, è incapace di svolgere contemporaneamente analisi multi-PTM e la quantificazione diretta delle reazioni di modifica 8. D'altra parte, l'analisi MS impiega strumentazione sofisticata che richiede una formazione di alto livello, ma fornisce elevata specificità e mappatura simultanea e quantificazione di più PTMs 9.   Tuttavia, entrambi i metodi sono dirompente e complessi nucleosomal sono dissociate prima dell'analisi, dando origine ad una miscela di istoni e / o peptidi istone-derivato. Questa manipolazione rimuove la capacità di distinguere indipendentiLe reazioni di modifica che si verificano su ciascuna delle due sorelle istoni e per segnalare lo stato di modifica specifica per copia degli istoni nucleosomiali.

Nucleare Risonanza Magnetica (NMR) evoluto come metodo alternativo per mappare reazioni PTM. NMR è senza interruzioni e quindi consente il monitoraggio di eventi PTM in modo tempo reale in miscele ricostituiti, e anche in cellule intatte 10, 11. Lo sviluppo delle routine di acquisizione dati veloce così come per la mappatura ad alta risoluzione sulla base 2D etero-nucleare metodi di correlazione di campioni marcati con isotopi (15 N e / o 13 C) 12 ha permesso la mappatura simultanea di diversi tipi di PTMs, tale come serina / treonina / fosforilazione della tirosina, lisina acetilazione / metilazione, e arginina metilazione 13. A seconda del PTM in esame, 15 N- o 13 C-etichettatura protocols possono essere impiegati per segnare il gruppo funzionale proteina che serve come reporter modifica. Di conseguenza, PTM mappatura può essere eseguita seguendo la caratteristica chemical shift spostamento del corrispondente gruppo funzionale 'sensing' alterazione sull'ambiente chimica. Nella maggior parte dei casi, sia NH e gruppi chimici CH possono essere utilizzati per segnalare l'evoluzione del PTM di interesse.

L'attuale protocollo descrive la generazione di nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Esso combina la flessibilità della spettroscopia NMR alla mappa PTMs utilizzando sia 1 H- 15 N e 1 H- 13 C correlazione spettri con l'utilizzo di diversi tag proteine affinità per la purificazione dei complessi istone ricostituiti selezionati. In particolare, il protocollo si avvale di due diverse piscine di un particolare istone per la ricostituzione nucleosomi. Queste piscine sono differenziale marcati con isotopi (uno con 13 C), e sono fuse ad un polyhistidine e un tag streptavidina affinità rispettivamente. Uno schema di purificazione di affinità tandem con Ni-NTA e la cromatografia streptavidina basata inizialmente utilizzato da Voigt et al. 7 è impiegato per purificare specie asimmetrica controparti simmetriche (Figura 1A). Ottameri istone asimmetrici sono utilizzati successivamente per ricostituire complessi nucleosomal equivalenti (Figura 1B), utilizzando il metodo di dialisi del sale di serie 14. Inoltre, attraverso la stessa procedura e avendo una delle piscine istone pre-modificato, un PTM può essere incorporato in modo asimmetrico sui nucleosomi risultanti. La reazione di questi substrati con enzimi istone-modifica e successiva NMR-mappatura degli eventi di modifica consentono la caratterizzazione dei meccanismi di crosstalk sia in-cis (copia istone premodified) e in-trans (unmodifiistone copia ndr) (Figura 1C).

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Protocol

1. Ricostituzione di nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi (e asimmetrico modificato) Sorella istoni

NOTA: L'attuale protocollo descrive la ricostituzione dei nucleosomi con differenziale marcati con isotopi istone H3. A tal fine, sono stati usati due piscine di istone H3; uno era 15 N-etichettati e conteneva un 6xHis-tag al N-terminale e la seconda era 13 C-marcato e conteneva il peptide Strep (WSHPQFEK) fusa alla N-terminale. Entrambi i tag sono stati separati dalla sequenza H3 nativa con un sito di riconoscimento della proteasi Tobacco Etch Virus (TEV). Per preparare ulteriori nucleosomi asimmetricamente modificati, una delle due piscine H3 è incluso in una forma premodified. Premodification di una piscina istone può essere effettuata facendo reagire l'istone marcati con isotopi di interesse con il rispettivo dell'enzima istone modificanti in presenza della necessaria per ogni tipo di cofattori reazione / PTM donatori 16. Il posizionamento efficiente del rispettivo PTM può essere valutata mediante spettroscopia NMR e spettrometria di massa. Le quantità di istoni / DNA usati qui sono raccomandazioni grezzi per ottenere un preparato nucleosoma con una concentrazione di circa 10 pM (misurato come concentrazione di DNA a 260 nm) .Questo resa finale è sufficiente per registrare spettri NMR buona qualità con tempi di acquisizione relativamente brevi.

  1. La ricostituzione di un ottamero istone con differenziale marcati con isotopi (e asimmetrico modificato) istone H3
    NOTA: ricombinante proteine istoni possono essere prodotti in quantità mg a BL21 (DE3) pLysS cellule 14. Per ottenere istoni marcati con isotopi, lo stesso protocollo espressione / purificazione è seguito con l'eccezione di utilizzare per la crescita batterica un terreno minimo contenente 15 NH 4 Cl e / o 13 C-glucosio come fonte di azoto e di carbonio, per 15 o 13 N- C-etichettatura respectivamente. istoni purificati sono ampiamente dializzato contro 5 mM β-mercaptoetanolo e conservati liofilizzati prima dell'uso.
    1. Sciogliere aliquote istone liofilizzati, contenente ~ 5 mg di ciascun istone in 1 mL di dispiegarsi tampone (7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Includere entrambi i tipi di istone H3. Mescolare pipettando e non fare vortice. Mantenere i tubi in ghiaccio per 30 minuti per permettere la completa dispiegarsi.
    2. Determinare l'esatta concentrazione di ciascun istone misurando l'assorbanza a 280 nm contro il dispiegamento tampone e utilizzando coefficienti di estinzione calcolato con lo strumento ProtParam del portale ExPASy. 15
    3. Mescolare gli istoni base ai rapporti equimolecolari, tenendo a mente per includere il 50% ciascuna delle due piscine dell'istone H3. Iniziare con l'intero contenuto del istone meno concentrata e aggiungere tutti gli altri di conseguenza.
    4. Regolare concentrazione proteica finale a circa 1 mg / ml usando dispiegarsi buffer.
    5. transfer la miscela ad una membrana di dialisi 6 kDa-cutoff e Dializzare contro 1-2 L di tampone refolding refrigerati (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) a 4 ° C. Cambiare il buffer almeno una volta dopo la dialisi è proceduto per almeno 3 ore. Eseguire una finale di dialisi O / N a 4 ° C.
    6. Raccogliere materiale dializzato e rimuovere eventuali precipitati mediante centrifugazione in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 ° C alla massima velocità (normalmente senza precipitazione deve osservare). Determinare la concentrazione ottamero misurando l'assorbanza a 280 nm. Nei calcoli, utilizzare i coefficienti di estinzione aggiunti di istoni, tenendo presente a doppia ogni valore.
    7. Concentrato ad un volume finale di ~ 2 mL utilizzando un'unità filtro centrifugo 10 kDa-taglio. Ricalcolare ottamero concentrazione e perdita di stima. A questo punto, una concentrazione ottamero tra 50 - 100 mM deve essere ottenuta.
    8. Collegare la colonna gel filtrazione (indicato nella tabella dei materiali) ad unsistema FPLC e equilibrare con 2 volumi di colonna (CV) di 0,22 micron-filtrato e degassato ripiegamento tampone ad un flusso di 1 ml / min e un limite di pressione di 0,5 MPa.
      NOTA: La corsa filtrazione gel deve essere eseguita in stanza fredda o in un armadietto fredda.
    9. Iniettare materiale concentrato usando una portata di 1 ml / min e raccogliere 1,0 - 1,5 ml frazioni.
    10. Seguire il profilo cromatografico ed osservare istone ottamero eluizione a ~ 65 - 68 ml.
      NOTA: Una piccola spalla del picco di eluizione e un picco a ~ 80 mL indica l'esistenza del libero tetrameri H3-H4 e dimeri H2A-H2B, rispettivamente.
    11. Eseguire 20 microlitri di ogni frazione raccolta in un gel SDS-PAGE 18%.
      NOTA: Diluire i campioni di un fattore di almeno 2 con acqua prima di caricarle sul gel per ridurre la concentrazione di sale e quindi, evitare distorsioni. Lo stesso vale per le successive analisi SDS-PAGE di campioni in refolding buffer.
    12. Pool A partire da rilevantiZIONI contenenti ottameri puri giudicati dalla equa distribuzione dei 4 istoni sul gel colorato e determinare la concentrazione come prima (fase 1.1.7).
    13. Collegare un mL Ni-NTA colonna 1 (tabella dei materiali) ad un sistema FPLC e equilibrare con 10 CV di 0,22 micron-filtrato e degassato ripiegamento tampone ad un flusso di 1 ml / min.
      NOTA: La cromatografia Ni-NTA deve essere eseguita in stanza fredda o in un armadietto fredda.
    14. Passare ottamero purificata attraverso il Ni-NTA utilizzando una portata di 1 ml / min.
    15. Raccogliere flow-through e conservare campioni per SDS-PAGE analisi / WB (20 microlitri e 4 ml, rispettivamente). Successivamente, lavare colonna con 10 CV di ripiegamento tampone o fino a raggiungere un segnale di base.
    16. Eluire con 10 CV di ripiegamento tampone contenente 250 mM imidazolo con una portata di 1 ml / min. I campioni per SDS-PAGE analisi / WB (20 microlitri e 4 ml, rispettivamente).
    17. Equilibrare una colonna di affinità 1 ml di acstreptavidina ommercial (Table of Materials) con 10 CV tampone di ripiegamento contenente 250 mm imidazolo utilizzando una messa a punto del flusso lotto / gravità.
      NOTA: Questa fase cromatografica deve essere eseguita nella stanza fredda.
    18. Passare Ni-NTA eluizione attraverso la colonna commerciale affinità streptavidina.
    19. Raccogliere flusso attraverso e mantenere i campioni per SDS-PAGE analisi / WB (20 microlitri e 4 ml, rispettivamente). Successivamente, lavare con 10 CV di ripiegamento buffer.
    20. Eluire con 10 CV di ripiegamento tampone contenente 2,5 mM desthiobiotin. I campioni per l'analisi SDS-PAGE / WB (20 e 4 ml, rispettivamente).
    21. Misurare concentrazione ottamero, aggiungere 10 volte meno proteasi TEV e lasciare che la reazione procede notte a 4 ° C in un tubo di plastica centrifuga standard.
      NOTA: La quantità necessaria di TEV per ottenere la digestione completa (rimozione dei tag di affinità) dipende dall'origine (costrutto) e sull'attività (fresco, TEV ricombinante è piùattiva rispetto a quella memorizzata per periodi prolungati a - 80 ° C). Prova inizialmente l'aggiunta di 10 volte meno TEV rispetto al ottamero (stimato come concentrazioni di proteine) e regolare di conseguenza.
    22. Controllare la digestione efficiente eseguendo 20 microlitri della miscela prima e dopo TEV aggiunta su un gel SDS-PAGE 18%. Se la digestione non è completa, aggiungere più TEV proteasi e continuare l'incubazione per un altro 3-4 ore.
    23. Dializzare campione contro ripiegamento buffer utilizzando una membrana di dialisi 50 kDa-taglio per rimuovere TEV proteasi e regolare la composizione del buffer.
    24. Concentrare il ottamero asimmetrica purificato utilizzando una unità 10 kDa-cutoff centrifuga filtro (la stessa unità filtro dal punto 1.1.7 può anche essere usato) ad un volume di 1,0-2,0 mL. Misurare la concentrazione finale. Utilizzare subito dopo per la ricostituzione nucleosoma o regolare al 50% (v / v) glicerolo per conservare a -20 ° C per periodi più lunghi. A questo punto, e in attesa di perdita di almeno il 70% durante le fasi precedenti, thconcentrazione ottamero e dovrebbe essere nell'intervallo di 20 - 50 pM.
  2. ricostituzione nucleosomi
    1. Se ottamero è stato immagazzinato in 50% glicerolo, dializzare notte a 4 ° C contro ripiegamento buffer prima di procedere con la ricostituzione nucleosomi.
    2. Regolare DNA (contenente un nucleosomi-posizionamento sequenza) la concentrazione di sale di 2 M NaCl utilizzando una soluzione stock 5 M NaCl.
      NOTA: Il DNA purificato sia isolato dopo la purificazione di un plasmide che contiene più copie della sequenza desiderata o sintetizzati mediante PCR deve essere conservato concentrato per ~ 50 micron di acqua o un tampone standard Tris-EDTA.
    3. Mescolare ottamero e DNA utilizzando il rapporto ottimale determinata da un test su piccola scala. Utilizzare tampone ripiegamento per regolare il volume finale a ~ 3,0 mL. Aggiungere sempre l'ultima ottamero per evitare qualsiasi possibilità di miscelazione del ottamero e il DNA a <2 M concentrazioni di sale.
      1. Eseguire iniziale piccolo-scricostituzioni ale per determinare la ottamero: rapporto di DNA che porta a rendimenti nucleosoma ottimali. Per questo, assemblare tre reazioni di 0.9: 1.0, 1.0: 1.0, 1.1 e 1.0: DNA: ottamero rapporti in un volume compreso tra 50-100 ml. Tipicamente, utilizzare una concentrazione di DNA 5 mM.
      2. Procedere con ricostituzione come descritto di seguito (gradini 1.2.4-1.2.8) e alla fine, stimare la quantità di nucleosoma ricostituito solubile e buona qualità misurando la concentrazione di DNA a 260 nm ed eseguendo un gel DNA nativo-PAGE 6% , colorati con bromuro di etidio, rispettivamente (Figura 5A).
    4. Trasferire il mix di una membrana di dialisi 6 kDa-cutoff e dializzare contro 1 L di ripiegamento buffer di notte a 4 ° C.
    5. Ridurre la concentrazione di sale del tampone di dialisi in modo graduale da 2 a 0,85, 0,64 e 0,2 M NaCl, rispettivamente. Mantenere campione in ogni buffer per almeno 3 ore. A volte precipitato è formato dopo l'ultima transizione. In questo caso continue dialisi come previsto e rimuovere precipitato da microcentrifuga centrifugazione alla fine del passo successivo.
    6. Trasferimento membrana di dialisi in un becher con 1 L di tampone (25 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) e continuare la dialisi O / N a 4 ° C.
    7. Raccogliere il campione, rimuovere qualsiasi precipitato formato nel passo 1.2.5 per centrifugazione in una microcentrifuga per 5 minuti a 4 ° C alla massima velocità e concentrato usando una unità filtro centrifugo 30 kDa-cutoff ad un volume finale di 300 microlitri ~.
    8. Misurare concentrazione di DNA a 260 nm, eseguire un gel 18% SDS-PAGE di proteine ​​(4 ml di campione) e un gel 6% nativo-PAGE DNA (0,2 ml di campione) e campione conservare a 4 ° C per diverse settimane. La concentrazione finale dovrebbe essere nel range di 10-20 micron.

2. Analisi NMR delle reazioni di modifica sui due sorelle Gli istoni

NOTA: Assegnazione di2D 1 H- 15 N correlazione spettri di code degli istoni nucleosomal sono disponibili all'indirizzo riferimenti 16, 17, 18. Inoltre, le assegnazioni di CH x gruppi di lisine, serine e threonines su 2D 1 H- 13 C correlazione spettri sono disponibili all'indirizzo di riferimento 16.

  1. Configurazione NMR e la registrazione degli spettri di riferimento
    NOTA: saggi enzimatici sono stati eseguiti utilizzando 140 ml di campione nucleosoma in tampone in un tubo NMR 3 mm a 300 K. vari tubi NMR con altri volumi di campione può anche essere usato. La temperatura di cui sopra è opportuno ottenere una buona qualità 1 H- 15 N correlazione spettri di code degli istoni nucleosomal e buone attività enzimatiche. 2D-SOFAST-HMQC 1 H- 15 N e 2D-HSQC 1 H- 13 C spettri sono stati registrati, rispettivamente, con una configurazione tcappello conferisce tempi di acquisizione simili. Parametri di acquisizione tipiche sono 128 transienti con 1.024 (1 H) x 128 (15 N) punti complessi e 32 transienti con 1.024 (1 H) x 64 (13 C) punti complessi per i due diversi tipi di spettri di correlazione. Per entrambi gli spettri 2D, il tempo di acquisizione era ~ 30 min.
    1. Impostare 300 K come la temperatura del campione nello spettrometro. Aggiungere 10% D 2 O (v / v) al campione da utilizzare per la serratura di frequenza spettrometro.
    2. Posizionare il campione nello spettrometro ed eseguire operazioni di base (bloccaggio, tuning, spessoramento). Inoltre, determinare lunghezze di impulso ottimali e parametri di acquisizione generali.
    3. Record 1D e 2D 1 H- 15 N e 1 H- 13 spettri di riferimento C.
    4. spettri di riferimento processo e garantire che i segnali da utilizzare per la mappatura delle reazioni di modifica sono ben risolti e hanno buone intensità.
    5. Recuperare campione e trasferire it ad una provetta per microcentrifuga.
  2. Impostazione della reazione enzimatica, monitoraggio NMR e l'analisi quantitativa
    1. Copiare e organizzare una serie di 2D Interleaved 1 H- 15 N e 1 H- 13 C spettri. Obiettivo per un tempo totale di acquisizione di diverse ore e regolare di conseguenza in una nuova corsa sulla base dei tassi enzimatici ottenuti dalla prima reazione.
    2. Aggiungere al campione cofattori necessari per il rispettivo tipo di reazione modifica (1 mM ATP / 2 mM MgCl 2 per fosforilazione, 1 mM acetil-CoA per acetilazione, 1 mM SAM per metilazione, ecc.).
    3. Aggiungere l'enzima di interesse, mescolare pipettando, trasferire il campione nel tubetto NMR e successivamente nello spettrometro (eseguire queste operazioni rapidamente).
      NOTA: Se non ci sono dati sull'attività enzimatica previsto, regolare il substrato-to-enzima rapporto molare 10: 1. Eseguire un primo giro di prova e regolare di conseguenza perla vera corsa.
    4. Eseguire un veloce spessoramento automatica e utilizzare il resto dei parametri dagli spettri di riferimento.
    5. Avviare la serie di 2D Interleaved 1 H- 15 N e 1 H- 13 C spettri.
    6. Seguire la progressione della reazione in tempo reale e fermare acquisizione quando la reazione giunge a compimento o al livello desiderato.
    7. Processo spettri come prima con esattamente gli stessi parametri.
    8. Ripetere l'intero percorso usando un ordine di acquisizione diversa per i due tipi di spettri di correlazione. Se nel primo esperimento di una correlazione 1 H- 15 N per la prima volta nella serie, inizia ora con una correlazione 1 H- 13 C. Con questo ed avente stesso tempo di acquisizione per entrambe spettri, è possibile tracciare e confrontare reazioni PTM su entrambi istoni marcati con isotopi modo differenziale sulla stessa scala temporale. Inoltre, è possibile calcolare le medie e le barre di errore trama.
      NOTA: A thorougDescrizione h delle metodologie per l'analisi dei segnali NMR e successiva quantificazione delle reazioni enzimatiche può essere trovato qui 19.
    9. Selezionare segnali NMR da ogni spettro NMR volta portate che riportano la progressione della reazione e calcolare le intensità di segnale relative utilizzando un software di visualizzazione e analisi per NMR. Fare questo per i segnali che la relazione non modificato, così come lo stato modificato. Estrarre i livelli di modifica.
    10. Tracciare i valori calcolati di livelli di modifica contro il tempo di reazione.

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Representative Results

Specie octameric correttamente ripiegate sono isolati dopo una corsa della miscela ricostituzione attraverso una colonna di gel filtrazione (figura 2). La piscina ricostituito octameric contenente i tre diversi tipi di octamers è sottoposto al regime tandem purificazione di affinità. I campioni vengono raccolti da tutte le fasi ed analizzati mediante SDS-PAGE e successivamente WB. La verifica della corretta esecuzione del protocollo che comporta l'isolamento di specie asimmetrici è ottenuta seguendo la presenza dei due tag di affinità (ria e Strep-) nei diversi campioni (Figura 3). Successivamente, i tag di affinità vengono rimossi dopo TEV proteasi digestione (Figura 4). ottameri asimmetrici smaltiti tag di affinità sono utilizzate per ricostituire nucleosomi asimmetrici. Inizialmente, un piccolo ricostituzione test di scala viene usata per determinare il rapporto molare ottimale di DNA: ottamero che si traduce in un elevatocedere formazione di un complesso monodisperse. Successivamente, il rapporto di miscelazione ottimizzato è impiegato per ricostituire nucleosomi in larga scala. Ricostruzioni nucleosomi sono analizzati da proteine / gel DNA e spettroscopia NMR per il corretto montaggio e la presenza dei modo differenziale sorella istoni H3 marcati con isotopi, rispettivamente (Figura 5). Un esempio di applicazione è illustrato in figura 6. In particolare, differenzialmente marcati con isotopi e asimmetricamente fosforilata su H3S10 nucleosomi vengono fatti reagire con GCN5 acetiltransferasi e acetilazione di H3K14 su entrambe le copie H3 è seguito in tempo reale mediante spettroscopia NMR. L'analisi rivela che H3S10 fosforilazione stimola H3K14 acetilazione da GCN5 in cis rispetto al trans.

Figura 1
Figura 1: diagramma di flusso per la preparazione di differenzialmente Isotope-labeled (e asimmetrico modificato) nucleosomi. (A) La ricostituzione e tandem affinità purificazione di modo differenziale marcati con isotopi (e asimmetrico modificato) ottameri istoni. (B) ricostituzione Nucleosome combinando i ottameri asimmetrici purificati e una sequenza di DNA nucleosomi-posizionamento. (C) NMR monitoraggio di in-cis e trans diafonia modifica dopo la miscelazione dei nucleosomi marcati con isotopi asimmetricamente modificati e differenziale con enzimi istone-modifica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Ricostituzione dell'istone ottameri. Un profilo di eluizione gel filtrazione della miscela istone ripiegata. Il picco maggiore a ~ 70 ml corrisponde alle ottameri istoni. A 14 - gradiente di gel SDS-PAGE 20% (Coomassie Blu colorazione) delle frazioni eluite corrispondenti al picco ottamero mostra la corretta stechiometria istoni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Purificazione di asimmetrici Histone ottameri. 14-20% gel gradiente SDS-PAGE (Coomassie colorazione) e WB contro i ria e Strep- affinità tag dei campioni delle diverse fasi del regime tandem purificazione di affinità. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Figura Figura 4: rimozione dei marchi affinità. 18% gel SDS-PAGE (Coomassie colorazione) di purificati ottameri asimmetrica degli istoni, prima e dopo la miscelazione con la proteasi TEV. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: biochimica e NMR caratterizzazione di differenzialmente marcati con isotopi nucleosomi. (A) 6% gel DNA nativo-PAGE (colorazione con etidio bromuro) di una ricostituzione nucleosomi piccolo test su scala utilizzando diversi rapporti molari di DNA: ottamero (a sinistra). 6% gel nativo-PAGE DNA (colorazione con etidio bromuro) di una ricostituzione nucleosomi su larga scala utilizzando il DNA ottimizzato: ottamero rapporto molare (a destra). (B) 18% di gel di proteine SDS-PAGE (Coomassie colorazione) di nucleosomi ricostituiti mostra la corretta stechiometria delle quattro istoni core. (C) 1 H- 15 N SOFAST-HMQC spettro della copia H3 15 N-etichettato di modo differenziale nucleosomi marcati con isotopi (solo H3 residui di coda sono visibili - il nucleo della proteina è invisibile a causa del tasso di tumbling lenta). (D) 1 H- 13 C HSQC spettro della copia H3 13 C-marcato di modo differenziale nucleosomi marcati con isotopi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: NMR monitoraggio di In cis e in trans Modifica diafonia imposto dagli asimmetrica fosforilazione di H3S10 sul H3K14 acetilazione attività di GCN5 acetiltransferasi. (A) Rappresentazione schematica del differenziale marcati con isotopi e asimmetrico fosforilata su H3S10 nucleosomi hanno reagito con GCN5 acetiltransferasi e mappatura acetilazione H3K14, in cis e in trans. (B) 1 H- 15 N SOFAST-HMQC e 1 H- 13 C HSQC spettri (regioni selezionate) dei nucleosomi asimmetrici prima e dopo la reazione con GCN5. (C) il monitoraggio NMR risolta nel tempo di H3K14 acetilazione da GCN5 su nucleosomi asimmetricamente H3S10 fosforilata. Le medie e di variazione (barre di errore) provenienti da due esperimenti indipendenti sono mostrati. Riprodotto con il permesso 16. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta figura.

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Discussion

Per la ricostituzione nucleosomi, l'attuale protocollo utilizza un modello di DNA lungo 165 bp contenente il 601-Widom sequenza di posizionamento nucleosoma 20, ma le prestazioni simile è previsto con diverse lunghezze di modelli di DNA. Il protocollo è stato progettato e impiegato utilizzando i tipi asimmetriche di istone H3. Con lo stesso principio, il metodo può essere applicato anche per gli altri istoni core e inoltre può essere usato per ricostituire complessi trasportano due istoni principali distinte con diverse etichette isotopi. Il protocollo può essere anche leggermente modificata per ricostituire inizialmente istoni sub-complessi e non istone direttamente ottameri. A seguito di questa modifica, asimmetrici tetrameri H3-H4 possono essere ricostituito utilizzando lo stesso schema di purificazione tandem. Questi ultimi sono mescolati con ricostituiti separatamente dimeri H2A-H2B e il DNA da assemblare nucleosomi 16. Le rese finali e le prestazioni complessive del ProtoC modificatoolo sono simili a quella originale.

Il protocollo è fortemente dipendente dalla capacità delle due colonne di affinità di legarsi efficacemente le specie corrispondenti e quindi cedere alla fine altamente puri complessi asimmetrici. E 'ingombrante per fornire la prova diretta e concreta che il complesso purificato finale è davvero e solo asimmetrica. Tuttavia, l'analisi WB di campioni da tutti gli stadi di purificazione con gli anticorpi pertinenti fornisce indicazioni affidabili per il successo del sistema di purificazione tandem (Figura 3). Gli stessi risultati, e quindi rassicurazione aggiuntiva, sono stati ottenuti analizzando stessi campioni per la presenza dei tag di affinità con metodi NMR 16. Eppure, se l'analisi WB indica la contaminazione di specie asimmetrici con quelli simmetrici, una piccola variazione può essere adottata in occasione della prima fase di purificazione (Ni-NTA) che può migliorare il risultato. In particolare, invece di un eluizione isocratica, un gradien imidazolo t eluizione (10-250 mM) può essere impiegato e quindi, solo le prime frazioni di eluizione che sono altamente arricchito nelle specie asimmetrici vengono riunite ed eseguire attraverso la colonna di affinità. Questo può essere valutata mediante analisi WB delle frazioni di eluizione per la presenza del tag strep affinità.

La selezione dell'isotopo-label rispetto alla PTM di interesse è piuttosto flessibile perché maggior parte dei casi, NMR è in grado di mappare stesso PTM utilizzando sia 1 H- 15 N e 1 H- 13 Ccorrelation spettri. Tuttavia, per alcuni aminoacidi, come lisine, la dispersione chemical shift per catena laterale 1 H- 13 C risonanze è piuttosto limitata. Inoltre, quando i siti di destinazione di un enzima lisina modificanti sono sconosciuti, site-specific read-out di lisina PTM non è semplice. In questi casi, metodi alternativi impiegano 13 C-etichettatura site-selective, combinata con la produzione istone semisintetico"> 21 o l'uso di sequenze di impulsi NMR di nuova costituzione che consente il rilevamento preciso degli stati di modifica attraverso eccitazione selettiva routine 22. Spettroscopia NMR conferisce piuttosto bassa sensibilità. A questo proposito, sono necessarie quantità relativamente elevate di nucleosomi (range micron) per eseguire la reazioni enzimatiche. Questo impedisce l'evoluzione del metodo ad una configurazione high-throughput.

Contemporaneamente, un nuovo metodo chimico è stato introdotto per la sintesi di chimicamente puri, nucleosomi asimmetricamente modificati, con alte rese, portando definito PTMs 23. Questo approccio è stato utilizzato, in combinazione con fluorography, per studiare i meccanismi di diafonia PTM. A causa della bassa capacità di risoluzione dei metodi fluorografia nel rilevamento PTM, conclusioni sono state derivate indirettamente confrontando attività enzimatiche complessive su un insieme di nucleosomi trasportano diverse combinazioni di PTMs simmetrici e asimmetrici, piuttostoche con osservazione diretta delle reazioni PTM sui corrispondenti siti di ciascun istone sorella. Tuttavia, l'incorporazione di istoni marcati con isotopi e l'uso di spettroscopia NMR per PTM lettura potrebbero costituire il suddetto metodo un ulteriore strumento per alta risoluzione analisi PTM dei nucleosomi asimmetricamente modificati.

In connessione con l'individuazione di nuovi tipi di nucleosomi asimmetricamente modificati in futuro, l'attuale metodo si propone di costituire uno strumento ad alta risoluzione per l'analisi in cis e nelle reazioni di diafonia PTM trans su substrati nucleosomal. In particolare, di grande importanza è la decodifica dei meccanismi di crosstalk che danno luogo a nucleosomi bivalenti 24 che contengono in modo asimmetrico, sia PTM trascrizionalmente attivi e repressivi.

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Acknowledgements

L'autore ringrazia il Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlino) per la fornitura di spazio wet-lab e le infrastrutture per eseguire esperimenti e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) per il finanziamento dell'opera attraverso un assegno di ricerca (LI 2402 / 2-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidinium HCl Applichem A14199 Use high quality Gu-HCl
Tris  Roth 4855.2
DTT Applichem A1101
NaCl VWR chemicals 27810.364
EDTA Roth 8043.2
Na2H2PO4 Applichem A1046
NaH2PO4 Applichem A3902
Imidazole Applichem A1073
d-Desthiobiotin Sigma D1411
Ni-NTA Superflow Qiagen 1034557
Strep-Tactin Superflow IBA 2-1207-001
His-probe antibody Santa Cruz sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP IBA 2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28-9893-35
6 - 8 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 1, 132650
50 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 7, 132129
10 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC901024
30 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC903024
Solution-state NMR spectrometer  at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe
Buffer name Component
Unfolding Buffer 7 M Guanidinium HCl
20 mM Tris, pH 7.5
10 mM DTT
Refolding Buffer 10 mM Tris, pH 7.5
2 M NaCl
1 mM EDTA
2 mM DTT
Assay Buffer 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8
25 mM NaCl
2 mM DTT

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References

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