للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Bioengineering
 

Summary

وتصف هذه الورقة نموذج تجريبي من الارقاء الذي يقيس وقت واحد وظيفة الصفائح الدموية وتخثر الدم. يتم قياس الصفائح الدموية ومضان الليفين في الوقت الحقيقي، ويتم تحديد معدل الصفائح الدموية التصاق، ومعدل تجلط الدم، وبداية من تجلط الدم. يتم استخدام نموذج لتحديد خصائص الصفائح الدموية محفز التخثر تحت التدفق في المركزات لنقل الدم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst, B., Vandekerckhove, P., Feys, H. B., Compernolle, V. A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time. J. Vis. Exp. (120), e55351, doi:10.3791/55351 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نماذج ميكروفلويديك من الارقاء تقييم وظائف الصفائح الدموية في ظل ظروف القص الهيدروديناميكية، ولكن في وجود مضادات التخثر، وقيدت هذا التحليل لترسب الصفائح الدموية فقط. العلاقة المعقدة بين الكالسيوم 2+ معتمد على تجلط الدم والصفائح الدموية وظيفة تتطلب إعادة التكلس دقيق ورقابة من الدم قبل التحليل. يستخدم الإعداد لدينا قناة خلط على شكل حرف Y، التي تمد المركز الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ عازلة لتدفق الدم فقط قبل التروية، مما يتيح إعادة التكلس السريع دون عينة ركود. وهناك فرق عشرة أضعاف في سرعة تدفق بين مكامن يقلل من التخفيف. ثم يتم perfused الدم معادة التكلس في غرفة التحليل المغلفة الكولاجين، ويسمح وضع العلامات فرق التصوير في الوقت الحقيقي من كل من الصفائح الدموية والفيبرين ترسب باستخدام مضان الفيديو المجهر. ويستخدم هذا النظام فقط الأدوات المتاحة تجاريا، مما يزيد من فرص توحيد. إعادة تشكيل تروالدم mbocytopenic مع الصفائح الدموية من المختزنة يركز علاوة على ذلك نماذج الصفيحات نقل، مما يثبت استخدامه في هذا المجال البحثي. وأظهرت البيانات النموذجية أن بداية تجلط الدم وترسب الفيبرين كانوا يعتمدون خطيا على تركيز الصفائح الدموية، مما يؤكد العلاقة بين الارقاء الابتدائي والثانوي في نموذجنا. في إطار زمني من 16 دقيقة التروية، لم تفعيل الاتصال لم يحدث، على الرغم من إعادة التكلس إلى الكالسيوم العادي 2+ والمغنيسيوم 2+ المستويات. عندما تم تثبيط عامل التخثر XIIa التي كتبها المانع التربسين والذرة، وكان هذا الإطار الزمني لفترة أطول، مما يشير إلى مجموعة ديناميكية كبيرة فيها تغييرات في طبيعة محفز التخثر من الصفائح الدموية ويمكن تقييم. شارك في تجميد العامل النسيجي مع الكولاجين خفضت كثيرا من الوقت لبدء التخثر، ولكن ليس معدل. الخيار لدراسة العامل النسيجي و / أو مسار اتصال يزيد براعة وفائدة الفحص.

Introduction

وتصور الارقاء الابتدائي والثانوي في الأصل عن اثنين من العمليات الكيميائية الحيوية للانفصال نسبيا. كان ينظر الإرقاء الأولي كمساهم رئيسي في ظروف التدفق الشرياني، مع دورا رئيسيا لالصفائح الدموية، في حين كان ينظر الإرقاء الثانوي للسيطرة على تجلط الدم تحت تدفق الدم الوريدي، والسماح للسلسلة البروتيني لتشكيل الليفين غير قابلة للذوبان. أعادت تشكيل العقود القليلة الماضية هذه النظرة التقليدية إلى حد كبير، معترفا بأن نشاط الصفائح الدموية وتخثر مترابطة وهي عمليات لا تقل أهمية خلال الارقاء الفسيولوجية والمرضية في كل (غير المتطرفة) الأوساط الهيدروديناميكية. وقد ترجم هذا الرأي إلى العيادة، حيث يتزايد استخدامها المقايسات وضعت لقياس شامل تجلط كامل الدم، ولكن مع العديد من الأسئلة المتبقية على أهمية وإمكانية التطبيق وفائدة 1.

نشرنا مؤخرا تحليل وظيفي من الصفائح الدمويةيركز باستخدام غرف تدفق الموائع الدقيقة المغلفة مع الكولاجين ييفي في نموذج في المختبر من نقل مع عينات تحتوي على كميات طبيعية من خلايا الدم الحمراء والبلازما والصفائح الدموية. يستخدم هذا الأسلوب الهيبارين أو هيرودين anticoagulated الدم، مما يعني ضمنا أي أو مشاركة محدودة من الارقاء الثانوي، والتي تعتمد على توليد الثرومبين والكالسيوم المتأين (كاليفورنيا 2+). لدعم تشكيل الثرومبين، وبالتالي لتشمل جميع جوانب الارقاء تحت تدفق ميكروفلويديك، قمنا بتطوير طريقة مكملة على القاعدة التقنية نفسها، بما في ذلك الآن مجانا الكالسيوم 2+. وبهذه الطريقة، ترسب الصفائح الدموية وتكوين الفيبرين يمكن دراستها، ومرة ​​أخرى في نموذج نقل الصفائح الدموية، لتقييم الصفائح الدموية نوعية التركيز.

في هذه الطريقة، وصفت الصفائح والفيبرينوجين مع fluorophores التي فصلت تماما أطياف الانبعاث. اللون المزدوج، في الوقت الحقيقي الفيديو المجهر ثم يسمح تحليلالتصاق الصفيحات الأساسي، فضلا عن بدء تجلط الدم وترسب الفيبرين. متغير مهم في هذا النوع من الاختبار هو إعادة التكلس، لأن إضافة الكالسيوم 2+ إلى الدم ثابتة، قبل التروية، سيتسبب حتما تخثر بمبادرة الاتصال في الحاوية. سيكون هذا بدء التحيز قراءات بسبب انسداد الأنابيب وبيوشيب مداخل قبل التروية. لذلك، في أسلوبنا، anticoagulated سترات الدم وضخت في كاليفورنيا 2+ عازلة المحتوية على حدة من خلال الساقين العليا من غرفة مدخل على شكل حرف Y. يتم خلط المكونات أثناء التروية قبل الدخول إلى غرفة تحليل المغلفة مع الكولاجين وحده أو بالاشتراك مع عامل النسيج البشري المؤتلف (rhTF). من خلال تكييف سرعات تدفق مضخات منفصلة وتركيز الكالسيوم 2+ في المنطقة العازلة، وتخفيف 10٪ من عينة الدم النهائية تأخذ مكان.

باستخدام هذا البروتوكول الموسعة، ونحن لشرح مساهمة خثراتعامل نشوئها الثاني عشر (العامل XII) وتركيز الصفائح الدموية للاتصال مسار تخثر الشروع في ظل التدفق. تظهر البيانات المتوفرة لدينا أيضا أنه من خلال طلاء rhTF جنبا إلى جنب مع الكولاجين، ومسار العامل النسيجي يمكن قياسها بصورة متزامنة.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية الأخلاقية المؤسسية للبحث في العينات البشرية، وتم الحصول على الموافقة المسبقة من جميع الجهات المانحة المعنية. تم الحصول على الموافقة لوصف التجارب هنا من مجلس المراجعة المؤسسية من مستشفى جامعة أنتويرب (موافقة عدد 16/10/120).

ملاحظة: مؤشرات درجة الحرارة هي دائما درجة حرارة الغرفة، ما لم يذكر.

إعداد 1. على microfluidics

  1. إعداد القنوات ميكروفلويديك غرفة التدفق، وأنابيب، وربط المسامير
    1. Resuspend وقارورة الأسهم الكولاجين التي دوامة الاختلاط، ومن ثم يخفف في محلول الجلوكوز متساوي التوتر المقدمة من قبل الشركة المصنعة لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: استخدام وتر الخيول الكولاجين، مصنوعة أساسا من النوع الأول الألياف. والخيول نوع الكولاجين أنا غالبا ما يشار إليها باسم "Horm" الكولاجين وهو المعيار الذهبي لهذا النوع من الفحص، على حد سواء التاريخية وأسباب بيولوجية. ويمكن أيضا الكولاجين النوع الثالث البشري أن تستخدم، ولكن هذه الألياف معطف أقل جيدا، واستجابة الصفائح الدموية ليست قوية كما. ويمكن أيضا طلاء الأسطح الأخرى يمكن استخدامها، مثل عامل فون ويلبراند، الفيبرينوجين، فبرونيكتين، laminin، vitronectin، thrombospondin-1، أو مزيج من هذه 3.
    2. خذ، بيوشيب ميكروفلويديك المتاح جديد مع ثمانية والقنوات وأبعاد موازية على التوالي، في ملم، 0.4 م خ 0.1 ح خ 20 L. الماصة 0.8 ميكرولتر من الكولاجين في قناة (ق) من بيوشيب على نهاية واحدة وتسمية هذا النحو مخرج. ملء فقط 5/6 من طول القناة بحيث لا يتم المغلفة الألياف الكولاجين عند مدخل القناة، لأن هذا يمكن أن يسبب انسداد، من شأنه أن يعرقل ونضح كفاءة.
    3. احتضان بيوشيب في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات في وعاء ترطيب ومختومة.
    4. لدراسة العامل النسيجي (خارجي) تجلط الدم بوساطة في تركيبة مع مسار الاتصال (الجوهرية)، ومعطف القنوات مع أعناقجنرال والمؤتلف عامل الأنسجة البشرية (rhTF).
      1. تمييع rhTF في 10 ملي 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) -buffered المالحة (HBS؛ 0.9٪ (ث / ت) كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 1: 3000، تركيز الأسهم: 4.5 نانومتر).
      2. إزالة حل الكولاجين طلاء عبر منفذ. الماصة 0.8 ميكرولتر من rhTF في مسح ميزانية الأسرة (1/500 التخفيف من تركيز الأسهم، وتركيز النهائي: 21:00) في منفذ للقناة، وملء 5/6 من طول القناة، على غرار استراتيجية الكولاجين طلاء.
      3. احتضان بيوشيب لمدة 30 دقيقة إضافية في وعاء ترطيب ومختومة.
    5. ملء قنوات المغلفة مع عازلة تمنع (1.0٪ (ث / ت) زلال المصل البقري و 0.1٪ (ث / ت) الجلوكوز في HBS)، بدءا من الطرف الآخر (وصفت بأنها المدخل). ملء عدد متساو من القنوات على شكل حرف Y مع عازلة تمنع نفسه في إحدى بيوشيب الاختلاط.
      1. تأكد من أن جميع القنوات والأسلحة قناة تمتلئ تماما مع عازلة تمنع. احتضان كل من بيوشيبالصورة لا يقل عن 1 ساعة في وعاء ترطيب ومختومة.
    6. لكل قناة في الاستخدام، وإعداد اثنين من أنابيب من 8 سم، واحدة 2 سم، واحد 46 سم طويلة. وضع دبوس في واحدة من نهاية الأنبوب ثلاثة أصغر وفي كلا الطرفين من أطول الأنابيب.
  2. إعداد مضخة الشطف
    1. شطف كل FLUIDICS مضخة وأنابيب متصلة مع الماء المقطر.
    2. أزل الشحم الصب وبيوشيب مع دقة خالية من الغبار مسح والكحول التشويه والتحريف لإزالة بصمات والغبار.
    3. ملء جميع أنابيب مع عازلة تمنع قبل ربطها biochips.
    4. إصلاح بيوشيب المغلفة على المسرح المجهر الآلي. إصلاح بيوشيب خلط في نفس الارتفاع المسرح المجهر باستخدام مقبس مقص المختبر.
    5. ربط بيوشيب المغلفة مع بيوشيب خلط باستخدام أطول الأنابيب، 46 سم. تأكد من أن كلا biochips هي على مسافة بحيث يشكل خط أنابيب مرنة ولكن على التوالي. إرفاق موصل حقنة في أنابيب لور متوافق مع مضخة الشطف. توصيله إلى نهاية خالية من 2 سم، والأنابيب وتحديد الطرف الآخر للمخرج بيوشيب المغلفة.
    6. إصلاح 8 سم أنابيب اثنين إلى مدخل بيوشيب خلط باستخدام دبابيس لها. وضع نهاية خالية من كل أنبوب في قارورة من مسح ميزانية الأسرة. شطف جميع الأنابيب وجميع القنوات مع 1 مل HBS.
      ملاحظة: تدفقات HBS من القارورة خلال 8 سم أنابيب إلى رقاقة خلط وخلال ال 46 سم أنابيب إلى رقاقة المغلفة (المتدفقة من غير المصقول إلى الجزء المطلي) نظرا لقوة سحب المضخة الشطف. هذه الخطوة يزيل عازلة تمنع والكولاجين سيئة الالتزام (أو rhTF في biochips المزدوجة المغلفة).
  3. إعداد مضخات نضح
    1. فتح برنامج التشغيل للمضخات نضح. تهيئة مضخات عن طريق النقر المزدوج على أيقونة الحقن في البرنامج.
    2. حدد نوع الحقنة التي سيتم استخدامها: 1 الحقن مل للتخثر بuffer و 2 المحاقن مل للدم تشكيلها.
  4. توصيل الحقن لبناء بيوشيب
    1. فصل مضخة الشطف وجميع أنابيب، باستثناء واحد يربط بين biochips اثنين. إعادة استخدام أنابيب قطع في الخطوات التالية.
    2. توصيل أنابيب 2 سم مع دبوس موصل حقنة لقفل لور من أنابيب النفايات سميك الجدران. ملء أنابيب سميكة الجدران مع الحل البيبسين قياسي باستخدام حقنة.
      ملاحظة: إضافة البيبسين ليمنع أنابيب النفايات وانحلال بعد نضح تخثر وبالتالي يمنع انسداد النظام في النهاية الخلفية.
    3. تأمين نهاية مفتوحة للأنابيب سميكة الجدران مع المشبك كوشر. وضع حاوية النفايات مناسبة مع تحت التبييض لجمع التدفق من خلال.
    4. إصلاح الأنبوب مع دبوس لمخرج من بيوشيب المغلفة.

2. إعداد عينات الدم

  1. جمع الدم من المتطوعين الأصحاء وفصل مكوناته 4
    1. جمع الدم في وعاء اجلاء حمض الإيثيلين tetraacetic (EDTA). استخدام هذا عينة فقط لأداء تعداد الدم الكامل (CBC) باستخدام محلل أمراض الدم الآلي.
    2. جمع الدم في حاويات سيترات الصوديوم إخلاؤها. 5 مل من الدم ويلزم لكل قناة.
    3. ضع عينة (ق) على محور دوار الأفقي في انتظار إعادة الدم.
      ملاحظة: يجب أن يتم الانتهاء من فحص ضمن 3 ساعات من الفصد. تركيز الصفائح الدموية وكامل الدم العينات فصيلة الدم ABO / RHD الملائمة.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 13 دقيقة في 250 x ج لإعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP). لا تستخدم الفرامل أجهزة الطرد المركزي لمنع اضطراب بيليه معبأة فضفاضة.
    5. نقل PRP إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطية الطازجة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4500 x ج (مع الفرامل) لتكوير الصفائح الدموية والبلازما إعداد فقيرة الصفائح الدموية (PPP). تجاهل بلاتبيليه elet. احتضان حزب الشعب الباكستاني في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    6. نقل خلايا الدم الحمراء معبأة في أنبوب مخروطي الشكل الجديد عن طريق تثقيب الجزء السفلي من نسخة أصلية واحدة مع إبرة 21 G.
      ملاحظة: عدد الصفائح الدموية المتبقية في جزء الخلية الحمراء معبأة هو 11 ± 4 × 10 3 في ميكرولتر (يعني ± SD، ن = 10).
  2. إعادة الدم
    1. تحديد الهيماتوكريت من خلايا الدم الحمراء معبأة أعدت في الخطوة 2.1.6 باستخدام محلل أمراض الدم الآلي.
    2. تحديد تركيز الصفائح الدموية من التركيز الصفائح الدموية التي سيتم استخدامها لتحليل باستخدام محلل أمراض الدم الآلي.
    3. حساب حجم معبأة خلايا الدم الحمراء، التركيز الصفائح الدموية، وحزب الشعب الباكستاني من شأنها أن تسفر عن الهيماتوكريت 40٪ و 250 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر في الحجم النهائي 2.5 مل. خلط هذه لإعداد الدم أعيد تشكيلها وإجراء CBC.
      ملاحظة: التتر الأخرى المستهدفة من الخلايا يمكن استخدامها، اعتمادا على اله سؤال البحث.
    4. إعداد "فارغة" العينة الضابطة التي يتم استبدال حجم تركيز الصفائح الدموية من نفس الحجم من المياه المالحة لتحديد تركيز الصفائح الدموية "الذاتية" (أي غير الدم الصفائح الدموية البنك).
  3. تسمية الدم تشكيلها لالصفائح والفيبرينوجين
    1. الماصة 13 ميكرولتر من 10.7 ملغ / مل حل الفيبرينوجين اليكسا فلور 405 المسمى (70 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) في أنبوب اختبار وإضافة 1 مل من الدم تشكيلها.
      ملاحظة: وصفت الفيبرينوجين استخدام عدة متاحة تجاريا وفقا لدليل الشركة المصنعة.
    2. مزيج 1 مل أخرى من الدم تشكيلها في أنبوب اختبار يحتوي على 2 ميكرولتر من 1 ملم DiOC 6 (1 ميكرومتر تركيز النهائي) أو التي تحتوي على 2 ميكرولتر من 5 ملم Calcein AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي). هذا إضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الدم مع الفيبرينوجين، وإعطاء الحجم النهائي من 2 مل من platelet- والفيبرينوجين-قالدم tained.
      ملاحظة: إن اختيار الصبغة يمكن أن تعتمد على السؤال البحثي أو تفضيل الباحث 5. كن على علم أن الإثارة من أي صبغة يمكن أن يسبب التحف الضوئية.
    3. المزيج بلطف عكس. احتضان العينة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. إعداد المخزن المؤقت التخثر
    1. إعداد عازلة تجلط الدم التي تحتوي على 10 ملي CaCl 2 و 3.75 ملي MgCl 2 في مسح ميزانية الأسرة. إعداد 1 مل من العازلة تخثر لقناة واحدة.
    2. تصفية تعقيم المنطقة العازلة تجلط الدم من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قبل الدافئة هذا إلى 37 درجة مئوية.

3. الإرواء الفحص

  1. التركيز البصريات المجهر لألياف الكولاجين انضمت إلى قاع القناة. استخدام النقيض من المرحلة أو على النقيض تدخل الفرق (DIC). حدد "Z الحالي تعيين لمناطق البلاط المحدد" في برنامج التجربة لإصلاح رقميا التركيز بشكل انتقائي.
  2. تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في القناة المختارة باستخدام برنامج اكتساب المجهر.
    ملاحظة: العائد على الاستثمار يمكن أن يكون أي مساحة مختارة عشوائيا داخل قناة التروية. ينصح بعدم تحليل تشكيل خثرة وتوليد الليفين على مقربة من مدخل ومخرج لتفادي الحصول على الصور من التجلط أو توزيعها بشكل غير متساو. يجب أن تحتوي على مساحة العائد على الاستثمار عددا كبيرا من الجلطة الدموية للسماح للتسوية من تقلب إشارة من الصفائح الفردية. موقع العائد على الاستثمار في س ص الطائرة من القناة دائما ثابتة وتحديد مسبق لنضح. إذا لزم الأمر، والجزء غير المصقول للقناة يمكن تضمينها في التحليل لتحديد ما إذا الصفائح الدموية ربط nonspecifically إلى البلاستيك بيوشيب.
  3. تحضير عينات للنضح
    1. جبل حقنة 1 مل تحتوي على 1 مل من العازلة تخثر قبل تحسنت في مضخة نضح.
    2. مزيج من الدم قبل حرارة التي أعيد تنظيمها قلب بلطف وتحميل 2 مL في مل حقنة 2.
    3. تأكد من إزالة كل الهواء من كلا المحاقن وربط كل لأنابيب 8 سم باستخدام دبوس موصل حقنة.
    4. رئيس الموصلات وأنابيب من كلا الحقن بسرعة عالية (400 ميكرولتر / دقيقة)، ووقف عند شغل كل شيء مع العازلة تجلط الدم أو الدم.
      ملاحظة: من خلال فتيلة أنابيب، المخزن المؤقت تخثر الدم وأعيد تشكيلها سوف تكون مختلطة مباشرة في قناة على شكل حرف Y من بيوشيب خلط عند بدء التجربة، وتجنب إدخال الهواء إلى غرف نضح.
  4. باستخدام دبابيس، وتحديد الطرف الآخر من كل من الأنابيب في الساقين تقسيم للقناة على شكل حرف Y في بيوشيب الاختلاط. يتم استخدام الساق أسفل لperfusing عازلة تجلط الدم والساق العلوية للدماء تشكيلها.
  5. بدء التجربة من خلال البدء نضح في 4.4 ميكرولتر / دقيقة لعازلة التخثر و 44 ميكرولتر / دقيقة للدم تشكيلها. إزالة المشبك كوشر عند مخرج أنابيب النفايات للسماح perfuسيون.
    يمكن تغيير معدل التدفق اعتمادا على سؤال البحث: ملاحظة. بدء ساعة توقيت لتحديد الوقت بين بدء التجربة وبدء الحصول على الصور في الوقت الحقيقي.
  6. تسجيل صور كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة في الوقت الحقيقي باستخدام اقتناء وتجربة البرنامج المجهر. بدء التسجيل عندما مزيج من الدم تشكيلها وعازلة تخثر يدخل بيوشيب المغلفة التي شنت على المسرح المجهر.
    ملاحظة: سلسلة زمنية أخرى يمكن استخدامها اعتمادا على الإعداد التجريبية. استخدام التكبير 100X (الهدف 10X 10X والعدسات).

4. إنهاء التجربة

  1. إنهاء المضخات والحصول على الصور بعد 30 دقيقة أو في وقت سابق، إذا المشبعة الإشارة. فصل جميع الأنابيب والحقن والتخلص منها كنفايات biohazardous.

تحليل 5. البيانات

  1. تحديد النمو خثرة (مخضر) وتشكيل الليفين (البنفسجي fluorescencه) حركية مع برنامج تحليل الصور. الأوامر التالية هي محددة لالبرمجيات المستخدمة هنا:
    1. فتح تجهيز المساعد: خياطة غرزة الصور جنبا إلى جنب في نقطة زمنية.
    2. فتح تحليل المساعد صورة لتحديد تغطية سطح الصفائح الدموية.
    3. فتح قياس المساعد. تحديد العائد على الاستثمار عن طريق رسم المنطقة المستطيل بما في ذلك جميع الألياف الجلطة الدموية والفيبرين. في هذا البروتوكول، والعائد على الاستثمار هو مستطيل قياس 637 مم 2.
      حدد علامة التبويب جميع المشاهدات لتشمل جميع نقاط الوقت المسجل.
    4. استخدام إنشاء جداول لتوليد تلقائيا البيانات التي سوف تحتوي على قيمة كثافة مضان يعني من المنطقة المستطيل المحدد من كل نقطة زمنية.
    5. حفظ جداول البيانات في شكل أكس أم أل.
  2. فتح جدول البيانات في برنامج جداول البيانات لمزيد من العمليات الحسابية.
    1. طرح الأولية (backgrouالثانية) قيمة كل البيانات.
    2. رسم إشارة الفلورسنت بوصفها وظيفة من الوقت نضح لكل من الأخضر (الصفائح الدموية) والبنفسجي (الليفين) الأصباغ.
      ملاحظة: مراعاة الوقت بين التهيئة مضخة ونقطة الانطلاق الفعلية من الحصول على الصور. تشكيل خثرة عموما هو عملية من خطوتين في هذا النموذج: (1) "بطيء" الصفائح الدموية التصاق (أي التصاق) على الكولاجين يجمد تليها (2) النمو خثرة يحركها تجلط الدم مع زيادة "السريع" في كل من الصفائح الدموية ملزمة ( أي تراكم) وترسب الفيبرين (أي تخثر) (الشكل 1).
    3. حساب المنحدر من التصاق الصفائح الدموية وتراكم من الانحدار الخطي. هذا المنحدر ينتج حركية النمو جلطة في كل مرحلة من مراحل تأسيسها.
    4. حساب المنحدر من تجلط الدم الفيبرين واستقراء هذا الخط لاعتراض محور X، تحديد لحظة البداية.

Representative Results

وصفت تحليل البيانات الخام في الوقت الحقيقي في الشكل 1. أولا، الصفائح الدموية تلتصق على سطح رد الفعل، مما أدى إلى زيادة مطردة في مخضر سجلت (الشكل 1A، ط)، وتسمى التصاق. خلال هذه المرحلة، هناك القليل البنفسجي مضان، مشيرا إلى أن الفيبرين ليس أو ليست سوى شكل طفيف (الشكل 1B). عند بدء من التخثر، والودائع الفيبرين بسرعة-الاستشعاع البنفسجي (ج)، وخلال ذلك الوقت، الصفيحات زيادات مضان الخضراء في حوالي نفس المعدل، المعين هنا كما تراكم الصفائح الدموية (ب). وبالتالي هناك تجربة واحدة بإرجاع ثلاثة معدلات الزيادة مضان (الأول والثاني، والثالث) كمؤشر بديل للسرعة التي الصفائح الدموية والفيبرين ترسب يحدث في هذا النموذج. وعلاوة على ذلك، واستقراء لحظة بداية تجلط الدم (لحظة من الظهور (د))، والذي هو محدد من الصفائح الدمويةإمكانية محفز التخثر.

في غياب TF، تخثر بدء بطيء ويعمل من خلال مسار الاتصال حيث ينشط المجمع tenase جوهري FX عبر تفعيل مباشر للFIX 6 من معهد حرية التعبير و / أو العامل XII في المقام الأول. لإثبات تبعية العامل XII، وأضيف 4 ميكرومتر مثبط التربسين الذرة (CTI) لكبح العامل XII المنشط (FXIIa) 7. فإن هذا لن يؤثر على تثبيط التصاق الصفائح الدموية (الشكل 2A)، ولكن لم تخثر لا تبدأ لمدة إجمالية محددة، تعسفا، من تجربة نضح (الشكل 2B والتكميلية فيديو 1).

في المختبر، وطريقة الاتصال يمكن أن تبدأ من مواد غريبة مثل الزجاج، أو في فحوصات السريرية باستخدام المواد المعدنية مثل الكاولين. في الجسم الحي، وتوفر الصفائح الدموية تنشيط شحنة سالبة 8 </ سوب> من خلال التعرض الغشاء من الدهون الفوسفاتية الحمضية مثل فسفاتيديل، و / أو من خلال إطلاق سراح فوسفات (ورم) 10، 11. لدينا ميكروفلويديك يقلد فحص في الوقت الحقيقي وهذا الأخير لأنه، في مجموعة من تركيزات صفائح الدم، وهي تعتمد على رد فعل لوقف نزيف الدم في عدد الصفائح الدموية (الشكل 3). من خلال زيادة عدد الصفائح الدموية في عينة تشكيلها، فإن معدل التصاق (الشكل 3A)، وتراكم (الشكل 3B والأخضر)، والتخثر (الشكل 3B، البنفسجي) زاد خطيا. لحظة من الظهور تقصير كبير (الشكل 3C) عن طريق زيادة تركيز الصفائح الدموية، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى عدد عتبة (تفعيل) أودعت الصفائح الدموية لتحريك التخثر.

على تلف الأنسجة في الجسم الحي، ومع ذلك، فإن الخلايا الحاملة للTF طnitiate تخثر الدم عن طريق مجمع tenase خارجي FVIIa-TF في وجود الكالسيوم 2+. وتحاكي هذه في الإعداد التجريبية لدينا من قبل بعد طلاء غرف نضح التي تحتوي على الكولاجين مع rhTF lipidated. في تحليل تقرن القنوات المغلفة مع الكولاجين فقط أو بالاشتراك مع rhTF، كان التخثر بداية أسرع بكثير الشكل (4A). وبلغت نسبة التصاق الصفائح الدموية يست خطية، لذلك يمكن أن يؤديها أي الانحدار الخطي (لا تظهر البيانات). وكان كل من معدل تجلط الدم وتراكم الصفائح الدموية لا تختلف بين الشروط (الشكل 4B-4C، التكميلية فيديو 2).

شكل 1
الشكل 1: تحليل الانحدار من التصاق الصفائح الدموية وتخثر في غرف نضح ميكروفلويديك. هذا الرقم يوضح المعلمات المستمدة من الوقت الحقيقي مضان البيانات الخام اكتسب خلال تدفق الدم معادة التكلس على سطح رد الفعل. (أ) متوسط كثافة مضان أخضر يظهر ترسب الصفائح الدموية في وظيفة من الزمن الارواء. يصف منحنى عملية ذات النسقين بدءا من (ط) زيادة ببطء التصاق الصفائح الدموية الخطي يتبعه تراكم الخطي (ب) التي تنمو بسرعة. وتراجعت كل من أجزاء خطية من منحنى والمنحدر من هذه يصف السعرين تشكيل خثرة من قبل مضان الصفائح الدموية. (ط) التصاق و (ب) التراكم. (ب) يعني كثافة مضان البنفسجي يظهر ترسب الليفين في وظيفة من الزمن. خلال التصاق الصفائح الدموية، والبنفسجي مضان غائب بشكل أساسي، في حين أنه سرعان ما تطور بدء التالي من تجلط الدم. يتم تعريف حظة من الظهور (د) على أنه اعتراض مع محور س من الانحدار الخطي استقراء من (ج) المرحلة الثانية من تشكيل خثرة من قبل مضان الفيبرين المعينة هنا كما تجلط الدم.EF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: في حالة عدم وجود TF، تجلط الدم في غرف تدفق نضح المغلفة الكولاجين يعتمد على FXIIa. تم تنفيذ نضح ميكروفلويديك الدم أعيد تحتوي على CTI أو عازلة التحكم (مراقبة) بمعدل القص من 1000 ق -1 ليصبح المجموع 30 دقيقة. (أ) نسبة التصاق الصفائح الدموية (ق -1) لا يتوقف على CTI. (ب) كانت لحظة من الظهور للعينات تعامل CTI-تتجاوز الحد المسموح به 30 دقيقة من التجربة (كما هو موضح خط منقط)، مما يدل على الاعتماد على FXIIa هذه المعلمة. الحانات والنقاط هي القيم الوسطية، وشعيرات هي الانحراف المعياري. كان التحليل الإحصائي التي تقرن اختبار t. (NS = غير الهامة، ن ≥3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
يعتمد التخثر تحت التدفق على عدد الصفائح الدموية: الرقم 3. أجريت تجارب نضح ميكروفلويديك في غرف المغلفة الكولاجين مع الدم تشكيلها في وجود الكالسيوم 2+ ومتفاوتة تركيز الصفائح الدموية (ن ≥3). (A) معدل معدل التصاق الصفائح الدموية (ب) من تراكم الصفائح الدموية (الخضراء) والتخثر (البنفسجي)، و (C) لحظة من الحدوث وتظهر وظائف تركيزات الصفائح الدموية في الدم تشكيلها. النقاط هي القيم الوسطية، وشعيرات هي الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تفعيل كل من فريق العمل ومسار الاتصال تخثر تقصير كبير في لحظة من بين بداية من تجلط الدم. أعيد الدم، في وجود الكالسيوم 2+، تم perfused من خلال الغرف المغلفة مع الكولاجين وحده أو مع الكولاجين وrhTF لدراسة مسار الاتصال وحدها أو مزيجا من مسارات الاتصال وفريق العمل. (A) هو اختصار لحظة من بين بداية من تجلط الدم بشكل ملحوظ في غرف تدفق التي تحتوي على TF. (ب) معدل تراكم الصفائح الدموية خلال التخثر و (C) معدل تجلط الدم لا تختلف بشكل كبير بين الكولاجين فقط أو غرف تدفق collagen- والمغلفة rhTF. الحانات والنقاط هي القيم الوسطية. شعيرات هي الانحرافات المعيارية. كان التحليل الإحصائي التي تقرن اختبار t. (NS = ليس كبيرا، * P < 0.05، ن ≥3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1
التكميلي فيديو 1: في غياب TF، تجلط الدم في غرف تدفق نضح المغلفة الكولاجين يعتمد على FXIIa. يتم تحديد دور لمسار الاتصال في غرف تدفق نضح المغلفة الكولاجين. (A) متراكب تسلسل الصور مضان من الصفائح الدموية (الخضراء) والليفين (ogen) (البنفسجي) ترسب في غياب CTI. (ب) نفس تسلسل لوحة ولكن مع القناة الخضراء مغلقا. (C) متراكب تسلسل الصور مضان من الصفائح الدموية (الخضراء) والليفين (ogen) (البنفسجي) ترسب في وجود CTI. (د) نفس تسلسل لوحة C ولكن مع القناة الخضراء مغلقا.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2
التكميلي فيديو 2: تفعيل كل من فريق العمل ومسار الاتصال تقصير كبير في تخثر حظة من الحدوث. لدراسة دور فريق العمل، واستخدمت غرف تدفق المغلفة مع الكولاجين وحده أو مع الكولاجين وrhTF. (A) متراكب تسلسل الصور مضان من الصفائح الدموية (الخضراء) والليفين (ogen) (البنفسجي) ترسب في غرف تدفق المغلفة فقط مع الكولاجين. (ب) نفس تسلسل لوحة ولكن مع القناة الخضراء مغلقا. (C) متراكب تسلسل الصور مضان من الصفائح الدموية (الخضراء) والليفين (ogen) (البنفسجي) ترسب في غرف تدفق المغلفة مع كل من الكولاجين وrhTF. (د) نفس تسلسل لوحة C ولكن مع switc قناة الأخضر[هد] باتجاه آخر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Discussion

ونقل الصفيحات مركزات يوصف للمريض نقص الصفيحات لمنع أو وقف النزيف. وقد أبرزت تأثيره السريرية مؤخرا في استعراض تاريخي للسرطان الدم الحاد 12، مشيرة إلى أن زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة من الأطفال المرضى في الستينات والسبعينات تعزى إلى حد كبير إلى التحسينات في (الصفائح الدموية) الطب نقل الدم. يتم استخدام مركزات الصفيحات أيضا لوقف النزيف في مجال الصدمات النفسية الحادة أو أثناء الجراحة. في هذه الظروف، ويفضل الصفائح الدموية مع خصائص محفز التخثر ممتازة التي تبدأ بسرعة الارقاء، ولكن تعد مركزات الصفائح الدموية من التبرعات من المتبرعين، وعلى عكس الأدوية الدوائي، وموحدة من قبل التحضير فقط، وليس من قبل (الكيميائية) التكوين. لذلك، العديد من الأسئلة في مجال بنوك الدم هي التي لم يرد عليها، بما فيها تلك المتعلقة الطرائق المثلى للتبرع، وظروف التخزين، وممارسات نقل الدم. في مجال ررatelet (نقل) البيولوجيا، العديد من الأسئلة بشأن إزالة الخلايا من التداول، كما تبقى مساهمة الصفائح الدموية المنقول إلى الارقاء، أو المناعة التي لم يتم الرد عليها.

هي التقنيات المخبرية العديدة للتحليل وظيفة الصفيحات المتاحة، ولكن هذه تعالج في الغالب الجانب المفرد وظيفة الصفائح الدموية، مثل تجميع أو تحبب 13. لتقييم نطاق واسع الصفائح الدموية والمركزات الصفائح الدموية، ونماذج شاملة من الارقاء لا غنى عنها، وهذه يجب أن تشمل الهيدروناميكا. الريولوجيا الدم ضروري لتفسير السلوك الصفائح الدموية بشكل صحيح أثناء الارقاء 14 أو 15 أو تخثر 16، حتى لو منع تخثر الدم يمنع الكالسيوم 2+ و / أو الثرومبين للمشاركة في وجود سترات أو الهيبارين، على التوالي 2. لدراسة التفاعل بين تجلط الدم والصفائح الدموية وظيفة تحت تدفق 17، مطلوب 18 وتوليد الثرومبين العادي، وبالتالي، مجانا الكالسيوم 2+ كذلك. الإعداد التجريبية لدراسة الارقاء في ظل هذه الظروف معقدة، لأن التدابير لمنع "الأداة" أو التنشيط غير المنضبط للتخثر ينبغي أن تؤخذ قدر الإمكان. وعلاوة على ذلك، تستخدم العديد من المجموعات البحثية المتخصصة حسب الطلب الأجهزة 19 و 20، والذي يسبب التغير الكبير بين المختبرات 5. القيود النمطية لهذا النهج هي استخدام السفن مستطيلة، لمحات من تدفق غير نابض، ومواد الطلاء غير البشرية 5. مقايسة وصفنا هنا يستخدم الأدوات المتاحة تجاريا، وبالتالي قد تكون مناسبة لتوحيد.

لأنه يتم تنشيط رد فعل تجلط الدم شلال بسهولة مرة واحدة لا يرد الدم داخل الجسم البشري، إعادة التكلس تسيطر هي خطوة محورية. تيس تحقيق ذلك، إضافة الكالسيوم 2+ يجب تأجيلها إلى قبل نضح على سطح الكولاجين رد الفعل، لأنه عندما يتم تزويد 2+ عازلة الكالسيوم بكميات كبيرة إلى الدم ثابتة، تخثر يأخذ حتما مكان، في نهاية المطاف انسداد الأنابيب ويتحامل البيانات تفسير (لا تظهر البيانات). الحل لهذه المشكلة هو ضخ العازلة الكالسيوم 2+ والدم على حدة، مما يسمح لخلط من قبل قوات الحمل الحراري وناشر خلال نضح في طريقها إلى غرفة التحليل. ويتحقق الاختلاط الكامل في قطعة 46 سم من الأنابيب بين الاختلاط وتحليل الدوائر. تم احتساب هذه المدة لمدة بقاء الأمثل من الكواشف إلى المزيج على أساس القوانين الأساسية للكتلة والنقل الحمل الحراري 21 خلال نضح بمعدل تدفق المستخدمة (1000 ق -1). أثبت هذا النهج يمكن السيطرة عليها وقابلة للتكرار.

تفعيل الاتصال من تجلط الدم وينظر أحيانا باعتبارها الأداة بسيطةاخذ عينات من الدم ويجب تجنبها عند تفسير زمن التجلط. لذلك، أثبتنا أنه في حالة عدم وجود موانع، يبدأ تجلط الدم تلامس يسببها في 16.7 دقيقة (± 3.7 دقيقة) التروية. في ظل وجود CTI لمنع تفعيل الاتصال FXIIa بوساطة، لا يبدأ تجلط الدم خلال تعريفها بشكل تعسفي من التجربة (30 دقيقة). هذه النافذة من التجريب هو طويل بما فيه الكفاية لتمييز عينات التي هي المؤيدة أو جرعات. على الرغم من تجلط الدم عن طريق تفعيل الاتصال يمكن أن يكون نتيجة غير مرغوب فيها من الدم بالاتصال الأسطح الاصطناعية، بياناتنا تظهر تأثير جرعة البيولوجي واضح من الصفائح الدموية. هذا يمكن أن يكون هاما للطب نقل الدم، بسبب النتائج الأخيرة على العامل XII، الصفائح الدموية فوسفات 10، توزيع فسفاتيديل 22، والمجهرية الدقيقة الصفائح الدموية 23 وإعادة تقييم الواقع بالتماس التخثر كما مساهما هاما في الارقاء، والبريدوخاصة في سياق تخثر 24. على سبيل المثال، فإن العائد المتغير من نقل الصفائح الدموية لدى مرضى أو التعبير فسفاتيديل متغير من الصفائح الدموية راهن قد بالتالي تحفز التغير في الكفاءة العلاجية إذا ثبت تخثر الناجح يعتمد على هذه العوامل.

بواسطة lipidated rhTF شارك في شل حركة مع الكولاجين، الطريق تخثر خارجي، أو TF مسار، يتم تنشيط خلال ترسب الصفائح الدموية على الكولاجين. ويمتد هذا الفحص إلى الوضع الأكثر شمولا، كنموذج للإصابات التي تجلب الدم في اتصال مع الخلايا التي تحمل TF والأنسجة. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن شارك في تجميد الكولاجين وTF ينخفض ​​لحظة بداية تجلط الدم ولكن لا يغير من معدل تجلط الدم. من المذكرة، وكمية من rhTF ثبتوا على السطح هو متغير مهم في هذا النموذج 25 و 26 و يجب أن تكون موحدة ضمن دراسة معينة. في presenم من CTI، مسار TF يمكن دراستها على وجه الحصر (لا يظهر) لأنه يتم منع تفعيل الاتصال.

في الختام، لدينا الإعداد التجريبية يجمع نموذجا للنقل عن طريق إعادة الدم الصفيحات مع الصفائح الدموية راهن ونموذج من الارقاء التي تعتمد على الكالسيوم ترسب الصفائح الدموية وتكوين الفيبرين تحت تدفق الهيدروديناميكية. وسيتم استخدام هذا الاختبار للرد على أسئلة حول طبيعة محفز التخثر الصفائح الدموية راهن وتقنيات إعداد التركيز آثار الصفائح الدموية لديها في هذا الشأن.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث والتنمية من الصليب الأحمر، فلاندرز خدمة الدم البلجيكية. ونحن نعترف بالدعم المالي المقدم من "Bijzonder onderzoeksfond" (محايد - صندوق الأبحاث الخاص) من جامعة غنت الممنوحة للمشروع مع عدد العقد BOF30290744.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD A00434
10 mL Syringe BD 309604
2 mL Syringe BD 307727
Alexa Fluor 405 Life Technologies A30100 The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Coagulation buffer in house preparation in house preparation 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15 mL Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 mL Greiner bio-one 227261
Corn trypsin inhibitor (CTI) Enzyme Research Laboratories CTI
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
DiOC6 Sigma-Aldrich 318426 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump Cellix EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer Sysmex pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Incubation water bath GFL 1013
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8
Pipette Brand A03429
Pipette tips 100-1000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Platelet concentrate orbital shaker Helmer PF-48i
Precision wipes Kimtech 5511
Pepsin solution  Hanna instrument HI7073L  2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin Dade Berhing B4212-40 rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vena8 syringe connector pin Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Coated biochip
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips Cellix VDY1-400-100-01-02 Mixing biochip
Vortex mixer VWR 58816-121
ZEN2012 software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13, (11), 1960-1967 (2015).
  2. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
  3. Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
  4. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
  5. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9, (11), 2322-2324 (2011).
  6. Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376, (3), 433-453 (1998).
  7. Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4, (5), 1160-1161 (2006).
  8. Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79, (2), 380-388 (1992).
  9. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122, (2), 429-436 (1982).
  10. Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139, (6), 1143-1156 (2009).
  11. Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, (4), 903-908 (2006).
  12. Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375, (1), 96-97 (2016).
  13. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8, (1), 221-224 (2013).
  14. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, (5714), 636-638 (1979).
  15. Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81, (5), 1263-1276 (1993).
  16. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, (6), 665-673 (2009).
  17. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, (10), 1875-1885 (2013).
  18. Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100, (6), 748-756 (2015).
  19. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, (1), 27-40 (2000).
  20. Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8, (9), 1486-1495 (2008).
  21. Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, (33), 7502-7519 (2011).
  22. Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. Blood. (2016).
  23. Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10, (7), 1355-1362 (2012).
  24. Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126, (11), 1379-1389 (2015).
  25. Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111, (7), 3507-3513 (2008).
  26. Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, (11), 2035-2041 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics