혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

Bioengineering
 

Summary

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

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Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst, B., Vandekerckhove, P., Feys, H. B., Compernolle, V. A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time. J. Vis. Exp. (120), e55351, doi:10.3791/55351 (2017).

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Abstract

지혈 미세 유체 역학 모델은 전단의 조건으로 혈소판 기능을 평가하지만, 항응고제의 존재 하에서, 이러한 분석은 혈소판 침착에만 제한된다. 칼슘 의존성 응고와 혈소판 기능 사이의 복잡한 관계는 이전의 분석에 혈액의 신중하고 제어 재석이 필요합니다. 우리의 설치는 샘플 정체없는 빠른 재석이 가능 직전 관류 혈액을 유입에 집중 칼슘 / 마그네슘 2+ 버퍼를 공급하는 Y 모양의 혼합 채널을 사용합니다. 두 저수지 사이의 유속에서 10 배의 차이가 희석을 최소화한다. recalcified 혈액은 콜라겐 분석 피복 실에 관류되고, 차동 라벨 형광 비디오 현미경을 사용하여 모두 혈소판 피브린 침착 실시간 이미징을 허용한다. 시스템은 표준화의 가능성을 증가 만 시판되는 공구를 사용한다. 죽의 재구성뱅크 드에서 혈소판과 mbocytopenic 혈액이 연구 영역에서의 사용을 입증 모델에게 또한 혈소판 수혈을 집중하고 있습니다. 예시적인 데이터가 응고 개시 피브린 침착 우리의 모델에서 일차 및 이차 지혈 사이의 관계를 확인하는 혈소판 농도에 선형 적으로 의존라고 설명했다. 16 관류 분의 기간에, 접촉 활성화는 정상 칼슘과 마그네슘 2+ 수준으로 재석에도 불구하고, 발생하지 않았다. 응고 인자 XIIa는 옥수수 트립신 억제제에 의해 억제 될 때,이 기간은 혈소판의 응고 성질의 변화가 평가 될 수있는 상당한 동적 범위를 나타내는도 길었다. 콜라겐 조직 인자의 공동 고정화 대폭 속도 응고 발병 시간을 줄일 수 있지만. 조직 인자 및 / 또는 접촉 경로를 연구 할 수있는 옵션은 분석의 다양성과 유틸리티를 증가시킨다.

Introduction

기본 및 보조 지혈는 원래이 상대적으로 분리 생화학 적 과정으로 개념화 하였다. 이차 지혈이 프로테아제 캐스케이드 불용성 피브린을 형성 할 수 있도록, 정맥혈 흐름 하에서 응집을 지배하는 것으로하면서 차 지혈은 혈소판의 핵심 역할 동맥 유량 조건의 주요 원인으로 간주 하였다. 지난 몇 년간은 혈소판의 활성화와 응집이 상호 의존적 모든 (비 극단적 인) 유체 역학적 milieus의 생리 학적 및 병리학 적 지혈하는 동안 똑같이 중요 프로세스입니다 인정, 실질적으로이 전통적인보기를 재편했다. 이보기는 포괄적으로 전체 혈액 응고를 측정하기 위해 고안 분석이 점점 관련성, 적용 및 유틸리티 (1)에 많은 나머지 질문이기는하지만, 사용되는 병원,로 번역되었습니다.

우리는 최근 혈소판의 기능 분석을 발표적혈구, 혈장, 혈소판 정상적인 양을 함유하는 샘플에, 수액 (2)의 시험 관내 모델에서 섬유 성 콜라겐 코팅 미세 유동 챔버를 이용하여 집중한다. 이 방법은 헤파린 또는 히 루딘은 더 또는 트롬빈의 생성 및 이온화 된 칼슘 (Ca 2+)에 의존 차 지혈의 제한된 참여를 의미, 혈액을 응고되지 사용합니다. 미세 유체 흐름 하에서 지혈의 모든 측면을 포함하는 것이 트롬빈의 형성을 지원하기 위해, 우리는 이제 자유 칼슘 포함 동일한 기술적 플랫폼 상보 방법을 개발 하였다. 이러한 방식으로, 혈소판 증착 및 섬유소 형성, 혈소판 농축 품질을 평가하기 위해, 다시 혈소판 수혈의 모델에서 연구 될 수있다.

이 방법에서, 혈소판 피브리노겐 완전 방출 스펙트럼을 분리 한 형광 물질로 표지되어있다. 이중 색상은 실시간 비디오 현미경은 다음의 분석을 허용주 상체의 부착뿐만 아니라, 응고 개시 피브린 침착. 정적 혈액 칼슘의 첨가가, 관류하기 전에 필연적 컨테이너 접촉 개시 응집을 야기하기 때문에 분석의이 형태의 중요한 변수는 재석이다. 이 개시 인해 이전 관류에 튜브 및 바이오칩 입구 막힘에 바이어스 판독을 것입니다. 따라서, 우리의 방법에서, 시트르산은 혈액 응고 및 칼슘 함유 버퍼는 Y 자형 유입 챔버의 상부 다리를 통해 개별적으로 펌핑된다. 구성 요소는 단독으로 또는 콜라겐, 재조합 인간 조직 인자 (rhTF)와 함께 코팅 분석 챔버에 들어가기 전에 재관류 동안 혼합한다. 버퍼 내의 개별 펌프의 유속과 칼슘 이온의 농도를 적용하여 최종 혈액 샘플의 10 % 희석 일어난다.

이 확장 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 coagula의 기여를 입증기 인자 XII (FXII) 및 혈소판 농도가 흐름에 따라 경로 응고 개시를 문의합니다. 우리의 데이타는 콜라겐과 함께 rhTF를 도포함으로써, 조직 인자 경로가 부수적으로 측정 할 수 있음을 보여준다.

Protocol

이 프로토콜은 인간의 샘플에 대한 연구에 대한 기관 윤리 지침을 다음과 동의서가 포함 된 모든 기증자로부터 얻은 것입니다. 여기에 설명 된 실험에 대한 승인은 앤트워프 대학 병원 (승인 번호 16/10/120)의 제도적 검토 보드에서 얻었다.

주 : 지정하지 않는 온도 표시는 항상 실온이다.

1. 미세 유체 설치

  1. 미세 유체 유량 용기 채널, 배관 및 연결 핀을 준비
    1. 와류 혼합하여 콜라겐 스톡 바이알을 재현 탁하고를 50㎍ / ㎖의 최종 농도를 제조자의 등장 글루코스 용액에 희석.
      참고 : 사용 말 건 콜라겐, 주로 유형 I 미세 섬유로 구성. 말의 콜라겐 타입 I은 종종 "HORM"콜라겐로하고, 역사적 모두, 분석이 유형의 금 표준이다생물학적 이유. 인간 타입 III 콜라겐이 사용될 수 있지만, 이러한 브릴 코트 덜, 및 혈소판 반응은 강하지 않다. 기타 코팅 표면은 또한, 폰 빌레 브란트 인자, 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로 넥틴, 트롬 보스 폰딘 -1 또는 이들 셋의 조합으로서 사용될 수있다.
    2. 한쪽 끝에서 바이오칩의 채널 (들)에 0.4 W 0.1 × H 콜라겐 × 20 L. 피펫 0.8 μL의, mm에, 팔 직선, 병렬 채널과 크기로 새로운 일회용 미세 유체 바이오 칩을 가지고로이 레이블 출구. 콜라겐 원 섬유가 채널 입구 피복되지 않도록이 효과적인 혈류를 저해하는 막힘을 일으킬 수 있기 때문에, 단지 5/6 채널 길이를 채운다.
    3. 가습 및 밀폐 용기에 적어도 4 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션 바이오칩.
    4. COLLA과의 접촉 경로와 결합 조직 인자 (외인성) - 매개 응고 공부 (진성) 코트 채널세대 및 재조합 인간 조직 인자 (rhTF).
      1. 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸)에 rhTF 희석 -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 식염수 -buffered (HBS 0.9 %을 (/ v)의 염화나트륨, pH 7.4의 1, W : 3000 재고 농도 : 4.5 ㎚).
      2. 출구를 통해 콜라겐 코팅 용액을 제거합니다. HBS에서 rhTF의 0.8 μL 피펫 (스톡 농도 최종 농도의 1/500 희석 9 PM) 콜라겐 코팅 전략 유사한 채널 길이의 5/6을 충전 채널의 콘센트.
      3. 가습 및 밀폐 용기에 추가로 30 분 동안 인큐베이션 바이오칩.
    5. 버퍼로 차단 코팅 기입 채널 ((/ w 1.0 %를 v)의 소 혈청 알부민 및 0.1 % (HBS IN / V) 포도당 w), (입구로 표시) 타단부터. 혼합 바이오칩 동일한 블로킹 완충액으로 Y 자형 채널들의 동일한 수를 채운다.
      1. 모든 채널 및 채널 팔 확인 완전히 차단 버퍼로 가득합니다. 모두 바이오칩을 품어가습 밀봉 용기에 적어도 1 시간 동안의.
    6. 사용중인 각 채널에 대해, 하나 2cm 길이 길이 8cm, 길이 한 46cm의 두 개의 튜브를 준비합니다. 세 개의 작은 튜브의 한쪽 끝에서 가장 긴 튜브의 양단에 핀을 배치합니다.
  2. 헹굼 펌프를 준비
    1. 모든 펌프 유체 및 증류수로 연결된 튜브를 씻어.
    2. 지문과 먼지를 제거하는 먼지없는 닦아 정밀도와 변성 알코올과 바이오 칩의 캐스팅을 탈지.
    3. 바이오칩에 연결하기 전에 버퍼를 차단하는 모든 튜브를 입력합니다.
    4. 자동화 된 현미경 무대에 코팅 된 바이오칩을 수정합니다. 실험실 가위 잭을 이용하여 현미경 스테이지와 동일한 높이로 혼합 바이오칩 수정.
    5. 46cm 길이 가장 긴 튜브를 사용하여 혼합 바이오 칩에 코팅 된 바이오 칩을 연결합니다. 튜브는 유연하지만 직선을 형성 있도록 모두 바이오칩은 거리에 있는지 확인합니다. 헹굼 펌프의 루어 호환 튜브에 주사기 커넥터 핀을 연결합니다. 2 cm 튜브의 자유 단에 연결하고 코팅 된 바이오 칩의 콘센트에 다른 쪽 끝을 고정합니다.
    6. 그 핀을 사용하여 혼합 바이오칩 입구에 2 개의 8 cm 튜브를 고정합니다. HBS의 유리 병에 각 튜브의 끝을 넣습니다. 모든 배관 및 1 mL의 HBS 모든 채널을 씻어.
      주 : HBS 때문에 헹굼 펌프의 견인력에 혼합 칩 8 cm 튜브를 통해 (코팅 부에 코팅에서 흐르는) 코팅 된 칩에 46 cm 튜브를 통해 바이알에서 흐른다. 이 단계는 (이중 코팅 된 바이오칩 또는 rhTF) 차단 버퍼와 제대로 부착 된 콜라겐을 제거합니다.
  3. 관류 펌프를 준비
    1. 관류 펌프의 드라이버 소프트웨어를 엽니 다. 소프트웨어의 주사기 아이콘을 두 번 클릭하여 펌프를 초기화합니다.
    2. 1 ML의 주사기를 응고 B에 대한 : 사용되는 주사기의 유형을 선택uffer 및 재구성 된 혈액 2 ML의 주사기.
  4. 바이오칩 건설에 주사기를 연결합니다
    1. 두 바이오칩을 연결하는 일을 제외하고 헹굼 펌프 및 모든 튜브를 분리합니다. 연결이 끊긴 튜브는 다음 단계에서 재사용된다.
    2. 두꺼운 벽 폐기물 튜브의 루어 잠금의 주사기 커넥터 핀 2 cm 튜브를 연결합니다. 주사기를 사용하여 표준 펩신 용액으로 두꺼운 벽 튜브를 입력합니다.
      주 : 상기 폐 튜브 억제 펩신의 첨가 후 재관류 응고 lyses 따라서 백엔드 시스템에서의 막힘을 방지한다.
    3. KOCHER 클램프와 두꺼운 벽 튜브의 개방 단부를 고정합니다. 플로우 스루를 수집하기 위해 표백제 아래에 적합한 폐기물 용기를 놓습니다.
    4. 코팅 된 바이오칩의 콘센트의 핀 튜브를 고정합니다.

혈액 샘플 2. 준비

  1. 건강한 지원자에서 혈액을 수집 및 해당 구성 요소를 분리 (4)
    1. 배기 된 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용기에 혈액을 수집합니다. 만 자동 혈액 분석기를 사용하여 완전한 혈액 카운트 (CBC)를 수행하기 위해이 샘플을 사용합니다.
    2. 대피 구연산 나트륨 용기에 혈액을 수집합니다. 혈액 5 mL를 채널별로 필요합니다.
    3. 수평 회전 대기중인 혈액 재구성에 샘플 (들)을 놓습니다.
      참고 :이 분석은 정맥 절개의 3 시간 이내에 완료해야합니다. 혈소판 농축 및 전체 혈액 샘플은 ABO / RHD의 혈액형이 일치합니다.
    4. 250 XG에 13 분 동안 원심 분리기는 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)를 제조 하였다. 느슨하게 포장 된 펠릿의 교란을 방지하기 위해 원심 브레이크를 사용하지 마십시오.
    5. 신선한 원뿔 원심 분리 튜브에 PRP를 전송합니다. 혈소판 펠렛 및 혈소판 가난한 플라즈마를 준비하는 (브레이크) 4,500 XG에 10 분 (PPP)에 대한 원심 분리기. plat입니다 폐기elet 펠렛. 37 ℃에서 수욕에서 PPP 부화.
    6. 21 G 바늘 원래의 바닥을 관통하여 새로 원추형 튜브에 충전 적혈구 전송.
      참고 : 포장 붉은 세포 분획의 잔여 혈소판 수는 μL 당 11 ± 4 × 10 (3) (SD ± 의미, N = 10)입니다.
  2. 피를 재구성
    1. 자동 혈액 분석기를 사용하여 단계 2.1.6에서 제조 한 포장 적혈구 용적률을 결정한다.
    2. 자동 혈액 분석기를 사용하여 분석을 위해 사용되는 혈소판 농축 혈소판 농도를 결정한다.
    3. 2.5 ㎖의 최종 부피로 40 %의 적혈구 용적 및 250 × 103 혈소판 / μL를 수득한다 포장 적혈구, 혈소판 농축 물, 및 PPP의 체적을 계산한다. 재구성 된 혈액을 준비하고 CBC를 수행하려면 다음을 섞는다.
      주의 : 다른 타겟 셀 역가 번째에 따라 사용될 수있다전자 연구 질문입니다.
    4. 혈소판 농축 물 볼륨이 "내생"소판 (즉, 비 - 혈액 은행 혈소판)의 농도를 결정하기 위해 식염수 같은 볼륨으로 대체하는 "블랭크"대조 샘플을 준비한다.
  3. 혈소판과 피브리노겐의 재구성 혈액 레이블
    1. 피펫 (13) 시험관에서 알렉사 플 루어 (405) 표지 피브리노겐 (70 μg의 / mL의 최종 농도)의 10.7 ㎎ / ㎖ 솔루션의 μL 및 재구성 피 1 mL를 넣어.
      참고 : 피브리노겐 제조업체의 설명서에 따라 시판 키트를 사용하여 표시 하였다.
    2. 1mM의 DIOC 6 (1 μM 최종 농도)을 2 μL를 함유하는 5 mM의 칼 세인 AM (5 μM 최종 농도)을 2 μL를 함유하는 시험관에 재구성 된 혈액의 다른 1 mL를 섞는다. 피브리노겐의 혈소판의 두 용액의 최종 부피를 제공 피브리노겐과 혈액을 함유하는 튜브에 이것을 추가tained 혈액.
      참고 : 염료의 선택은 연구 질문 또는 연구원 (5)의 선호도에 따라 달라질 수 있습니다. 어떤 염료의 여기가 광화학 유물이 발생할 수 있음을 유의하십시오.
    3. 부드럽게 반전으로 섞는다. 37 ° C에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션.
  4. 응고 버퍼를 준비
    1. 10 mM의 염화칼슘 2 HBS에서 3.75 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 응고 버퍼를 준비합니다. 하나의 채널에 대한 응고 버퍼 1 ㎖를 준비합니다.
    2. 필터 멸균 0.2 ㎛의 필터를 통해 응고 버퍼. 37 ° C에이 사전 따뜻하게.

3. 관류 분석

  1. 채널의 하단에 부착 된 콜라겐 섬유의 현미경 광학 초점. 위상차 또는 미분 간섭 대비 (DIC)를 사용합니다. 디지털 선택된 초점을 해결하기 위해 실험 소프트웨어 "를 선택한 타일 영역에 대한 설정 현재 Z"를 선택합니다.
  2. 현미경의 수집 소프트웨어를 이용하여 상기 선택된 채널에서의 ROI를 정의한다.
    참고 : ROI가 임의로 관류 채널 내에서 선택하는 표면적이 될 수 있습니다. 편재 혈전의 이미지를 획득 피하기 위해 혈전 형성 및 입구 및 출구 부근 피브린 생성을 분석하지 의뢰한다. 관심 영역의 표면적은 각각의 소판에 의한 신호 변화 중 평준화 있도록 혈전가 많이 함유한다. 채널의 XY 평면 내에서 ROI의 위치가 항상 고정 관류하기 전에 결정된다. 필요한 경우, 채널의 코팅되지 않은 부분은 혈소판 바이오칩 플라스틱에 비특이적으로 결합 여부를 결정하는 분석을 포함 할 수있다.
  3. 관류에 대한 샘플을 준비
    1. 관류 펌프 예열 응집 완충액 1 ㎖를 함유하는 1 ml 주사기를 탑재.
    2. 부드럽게 반전로드 2m에 의해 미리 예열 재구성 혈액을 혼합2 ML의 주사기에 L.
    3. 모든 공기가 모두 주사기에서 제거하고 주사기 커넥터 핀을 사용하여 8 cm 튜브에 각각 연결되어 있는지 확인합니다.
    4. 프라임 커넥터 및 고속 (400 μL / 분)에서 모두 주사기의 튜브와 모든 것이 응고 버퍼 또는 혈액으로 가득 할 때 중지합니다.
      주 : 상기 실험 시작 관류 챔버에 공기의 도입을 방지 할 때 배관을 프라이밍함으로써 응고 버퍼 및 재구성 혈액 즉시 혼합 바이오칩의 Y 자형 통로 내에서 혼합한다.
  4. 핀을 사용하여 혼합 바이오칩의 Y 자형 통로의 분할 다리 모두 튜브의 타 단부를 고정한다. 아래쪽 다리는 응고 버퍼와 재구성 피를 위쪽 다리를 관류하는 데 사용됩니다.
  5. 응고 버퍼 4.4 μL / 분, 재구성 된 혈액 44 μL / 분으로 관류를 시작하여 실험을 시작합니다. 허용하는 폐기물 튜브의 출구 perfu에서 KOCHER 클램프를 제거시온.
    주 : 유량은 연구 문제에 따라 변경 될 수있다. 실험 개시 실시간 화상 획득의 시작 사이의 시간을 결정하기위한 스톱워치를 시작한다.
  6. 이미지를 기록 매 10 초 현미경의 수집 및 실험 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 30 분간. 재구성 된 혈액 응집 완충액 믹스 현미경 스테이지 상에 코팅 된 바이오 칩에 진입 할 때, 기록을 시작한다.
    주의 : 다른 시계열 실험 구성에 따라 사용될 수있다. 100X 배율 (10 배 목표와 10 배 렌즈)를 사용합니다.

4. 종단 실험

  1. 신호가 포화되어있는 경우, 앞서 30 분 후에 펌프 화상 취득을 종료하거나. 모든 튜브와 주사기를 분리하고 생물학적 폐기물로 폐기합니다.

5. 데이터 분석

  1. 혈전 성장 (녹색 형광)과 섬유소 형성을 결정 (보라색 fluorescence) 상기 화상 해석 소프트웨어 동력학. 다음 명령은 여기에 사용되는 소프트웨어에 대한 특정 :
    1. 플러그인 처리를 엽니 시점마다 나란히 이미지를 스티치 바느질.
    2. 혈소판의 표면 적용 범위를 결정하기 위해 플러그인 이미지 분석을 엽니 다.
    3. 플러그인 측정을 엽니 다. 모든 혈전과 섬유소 섬유를 포함하는 사각형 영역을 그림으로써 투자 수익 (ROI)을 정의; 이 프로토콜에서, ROI는 637mm 2를 측정하는 사각형입니다.
      모든 기록 된 시점을 포함하는 탭 모두보기를 선택합니다.
    4. 자동적으로 각 시점의 선택된 사각형 영역의 평균 형광 강도 값을 포함하는 스프레드 시트를 생성하기 위해 테이블을 만들어 사용한다.
    5. XML 형식으로 스프레드 시트를 저장합니다.
  2. 더 계산을위한 스프레드 시트 프로그램에서 스프레드 시트를 엽니 다.
    1. 초기 (backgrou 하 빼기모든 데이터의 차) 값입니다.
    2. 녹색 (혈소판) 및 자외 (피브린) 염료 모두 재관류 시간의 함수로서 상기 형광 신호를 그린다.
      참고 : 계정에 펌프 초기화 및 이미지 수집의 실제 시작 지점 사이의 시간을 가지십시오. 혈전 형성은 일반적으로이 모델에서 두 단계 : (1) (즉, 접착) 결합 모두 혈소판의 "빠른"증가 (2) 응고 구동 혈전 성장 하였다 고정화 콜라겐 (혈소판 부착을 "느린" 즉, 축적) 및 섬유소 증착 (즉, 응고) (그림 1).
    3. 혈소판 유착 및 선형 회귀 축적의 기울기를 계산하게하고; 이 경사는 형성의 각 단계에서 혈소판 혈전 성장 속도론을 산출한다.
    4. 개시의 순간을 결정 피브린 응고의 기울기를 계산하고, X 축을 가로 채기 위해 줄을 추정.

Representative Results

실시간 미가공 데이터의 분석은도 1에 설명된다. 첫째, 혈소판이 기록 된 녹색 형광 꾸준히 증가 (그림 1A, i)에서의 결과, 반응 표면에 부착, 부착했다. 이 단계에서는, 피브린이 없거나 단지 가장자리 (도 1b)에 형성되어있는 것을 나타내는 작은 보라색 형광있다. 응고 개시시에, 형광 바이올렛 빠르게 피브린 침착 (III) 및 그 시간 동안 혈소판 축적 여기 지정된 대한 동일한 비율로 혈소판 녹색 형광 증가 (II). 하나의 실험에 따라서 형광 증가 세 요금 반환 (I, II, 그리고 ⅲ) 혈소판과 섬유소 침착이 모델에서 발생하는 속도에 대한 대리 마커로서. 또한, 응고 개시 (순간의 발병 (IV))의 순간은 혈소판의 결정 인 추정된다응고 가능성.

TF의 부재에서, 응고 개시 속도가 느립니다 주로 고유 tenase 단지가 FXI 및 / 또는 FXII에 의해 FIX 6의 직접적인 활성화를 통해 FX를 활성화 접촉 경로를 통해 실행됩니다. FXII 의존성을 설명하기 위해, 옥수수 트립신 억제제의 4 μM (CTI)가 활성화 FXII을 억제하기 위해 추가되었습니다 (FXIIa) 7. 이 억제는 혈소판 접착 (그림 2A)에 영향을 미치지 않았지만, 응고는 관류 실험 (그림 2B보충 비디오 1)의 임의로 정의 된 전체 기간 동안 시작되지 않았습니다.

시험관 내에서, 접촉 경로는 고령토와 같은 무기물 재료를 사용하여 유리 등의 임상 분석에 이물질에 의해 개시 될 수있다. 생체 내에서, 활성화 된 혈소판은 음전하를 제공 8 </ SUP> 및 / 또는 폴리 인산염의 릴리스 (폴립) (10), (11)을 통해 산성 인지질 (9), 포스파티딜 세린 등의 막 노출을 통해. 우리 미세 실시간 분석 모방 후자 때문에 혈소판 농도 범위에서, 지혈 반응은 혈소판 (도 3)에 의존한다. 재구성 된 샘플에서 혈소판의 개수를 증가시킴으로써, 접착 율 (도 3A), 축적 (녹색,도 3b), 응집 (도 3b, 바이올렛) 선형 증가 하였다. 순간 -의 발현은 유의 (활성화) 증착 혈소판의 임계 개수가 응고를 트리거 할 필요가 있음을 시사 증가 된 혈소판 농도 (도 3c)을 단축.

생체 내에서 조직 손상에, 그러나, TF 베어링 세포가 나는 것칼슘의 존재에 FVIIa-TF 외부 tenase 단지를 통해 혈액의 응고를 nitiate. 이렇게하여 우리의 실험 설정에서 모방한다 후 코팅 지질 화 rhTF와 콜라겐 함유 관류 챔버. 콜라겐 전용 또는 rhTF와 함께 코팅 채널 쌍 분석에서 응고 발병 속도가 매우 빠르고 (그림 4A)이었다. 혈소판 부착 율은 선형 아니었다 그래서 선형 회귀 (데이터는 제시하지 않음)를 수행 할 수 없었다. 모두 응고와 혈소판 축적의 속도는 조건 (그림 4B-4C, 보충 비디오 2) 사이에 차이가 없었다.

그림 1
그림 1 : 미세 관류 챔버에서 혈소판 부착 및 응집의 회귀 분석. 이 도면은 실시간 형광 원 데이터로부터 유도 된 파라미터들을 명확히 반응 표면 recalcified 혈액의 흐름 동안 인수했다. 녹색 형광의 (A) 평균 강도는 관류 시간의 함수 혈소판 침착을 보여줍니다. 곡선 천천히 (II) 급성장 선형 축적 하였다 선형 혈소판 부착을 증가 (I)으로 시작하는 바이 모달 프로세스를 설명. 곡선의 두 직선 부분 퇴행 이들의 기울기 혈소판 형광에 의한 혈전 형성의 두 가지 요금을 설명된다; (ⅰ) 접착 성 및 (ii) 축적. (B) 보라색 형광의 강도가 시간의 함수 섬유소의 침착을 보여줍니다 평균. 신속 응고 개시 다음 개발 중에 혈소판 유착 동안 형광 바이올렛은 기본적으로 존재하지 않는다. 제 (Ⅳ) 모멘트의 발병은 응고 여기 지정된 피브린 형광에 의한 혈전 형성의 (ⅲ) 제 2상의 외삽 선형 회귀의 x 축 절편으로 정의된다.EF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 : TF의 부재에서 콜라겐 - 코팅 된 관류 챔버에서 응고 FXIIa에 의존한다. CTI 또는 제어 버퍼 (CONTROL)를 포함하는 재구성 된 혈액 관류 미세 1,000 s의 전단 속도에서 30 분 -1의 총 행 하였다. (A) 혈소판 부착 율은 (S-1) CTI에 의존하지 않았다. (B) 순간-의 발병 CTI 처리 된 샘플이 매개 변수의 FXIIa에 대한 의존도를 보여주는, (점선으로 표시) 실험의 30 분 제한을 초과했습니다. 바, 점 수염이 표준 편차이며, 평균 값입니다. 통계 분석은 쌍을 이루는 t 테스트로했다. (NS = 중요하지, n은 ≥삼). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 흐름에서 응고는 혈소판 수에 따라 달라집니다. 미세 관류 실험은 칼슘 이온의 존재 하에서 다양한 재구성 된 혈액의 혈소판 농도 (N ≥3)를 콜라겐 코팅 챔버에서 수행 하였다. (A) 평점 혈소판 축적 (녹색) 및 응집 (보라색), 및 (C) 모멘트의 발병 혈소판 유착 (B) 레이트 재구성 혈중 혈소판 농도의 함수로 나타낸다. 점은 수염이 표준 편차이며, 평균 값입니다. 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의에.

그림 4
그림 4 : 모두 TF와 접촉 경로 응고의 활성화는 크게 순간-의 발병 응집을 단축. 칼슘 이온의 존재 하에서 피 재구성 콜라겐 단독으로 또는 단독으로 접촉 경로 또는 접촉 TF 경로의 조합을 연구하기 콜라겐 rhTF와 코팅 챔버를 통해 관류 하였다. (A) 순간-의 발병 응집이 크게 TF 함유 흐름 챔버에 단축된다. (B) 응고 속도가 전용 또는 콜라겐 및 rhTF 코팅 유동 챔버 콜라겐과 크게 다르지 않다 응고 및 (C) 중 혈소판 축적 비율. 바, 점 평균 값이다; 수염은 표준 편차입니다. 통계 분석은 쌍을 이루는 t 테스트로했다. (NS는 * P <아니라 상당한 = 0.05, n은 ≥3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1
보조 비디오 1 : TF의 부재에서 콜라겐 - 코팅 된 관류 챔버에서 응고 FXIIa에 의존한다. 상기 접촉 경로의 역할은 콜라겐 코팅 관류 챔버에서 결정된다. CTI의 부재하에 혈소판 (녹색) 및 피브린 (ogen) (보라색)의 증착 (A) 오버레이 형광 이미지 시퀀스. (B) 패널 (A)로하지만 녹색 채널과 같은 순서가 꺼져. 혈소판 (녹색) 및 피브린 (ogen) CTI의 존재 (보라색)의 증착 (C) 오버레이 형광 이미지 시퀀스. (D) 패널 C로하지만 녹색 채널과 같은 순서가 꺼져.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "대상 ="_ 빈 ">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2
보조 비디오 2 : TF 모두의 활성화와 접촉 경로는 크게 응집에게 순간의 발병을 단축시킨다. TF의 역할을 연구하기 위해, 단독으로 또는 콜라겐 콜라겐 rhTF와 코팅 유동 챔버를 사용 하였다. 혈소판 (녹색) 및 섬유소 (ogen) 만 콜라겐으로 코팅 흐름 챔버에서 (보라색) 증착 (A) 오버레이 형광 이미지 시퀀스. (B) 패널 (A)로하지만 녹색 채널과 같은 순서가 꺼져. 혈소판 (녹색) 및 섬유소 (ogen) 콜라겐과 rhTF 모두 코팅 흐름 챔버에서 (보라색) 증착 (C) 오버레이 형광 이미지 시퀀스. (D) 패널 C로하지만 녹색 채널 switc와 같은 순서전원을 hed. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

혈소판의 수혈 방지하거나 출혈을 멈추게하는 혈소판 환자에 대한 처방 집중하고 있습니다. 임상 적 영향은 최근 60 년대와 70 년대 소아 환자의 증가 생존율이 (혈소판) 수혈 의학 개선에 크게 기인이라고 불러, 급성 백혈병 (12)의 역사적 검토 강조했다. 혈소판 농축액은 급성 외상이나 수술 중 출혈을 막기 위해 사용됩니다. 이러한 조건에서, 신속하게 지혈을 시작 우수한 응고 특성을 가진 혈소판이 바람직하지만, 혈소판 농축액은 약리학 적 약물과는 달리, 만,하지 (화학) 조성 준비에 의해 표준화되어, 자발적 기부자의 기부에서 준비하고있다. 따라서, 혈액 은행의 분야에서 몇 가지 질문 최적의 기부 양식, 보관 조건 및 수혈 관행에 포함, 답이 있습니다. (PL)의 필드atelet (수혈) 생물학, 혈액 순환의 세포 간극에 대한 많은 질문은 지혈에 수혈 혈소판의 기여, 또는 면역학도 답이 남아있다.

혈소판 기능 분석을위한 수많은 실험 기법을 사용할 수 있지만, 이들의 대부분이 응집 탈과립 (13)와 같은 혈소판 기능의 단일 측면을 다룬다. 크게 혈소판 및 혈소판 농축을 평가하기 위해, 지혈의 포괄적 인 모델은 필수이며, 이러한 유체 역학을 포함해야합니다. 혈액 응고는 레올 칼슘 방지 2+ 및 / 또는 트롬빈은 헤파린 또는 시트 레이트, 각각 2의 존재에 참가하는 경우에도, 올바르게 지혈 14, 15 또는 16 중 혈소판 혈전 행동을 해석하는 것이 중요하다. 흐름 (17)에서 응고와 혈소판 기능 사이의 상호 작용을 연구하려면18 정상 트롬빈 생성이 자유 CA는 물론 2+ 따라서 요구하고있다. 대책 "아티팩트"또는 응고의 제어되지 작동을 최대한주의해야 방지하기 때문에 이러한 조건에서 지혈을 연구하는 실험 구성은 복잡하다. 또한, 많은 전문 연구 그룹이 사용하는 맞춤형 하드웨어 19, 20, 실질적인 실험실 간 변동의 원인 (5). 이 방법의 전형적인 제한은 직사각형 용기의 비 맥동 유동 프로파일 및 인간이 아닌 표면 코팅 (5)의 사용이다. 우리가 여기서 설명하는 분석은 상업적으로 사용 가능한 도구를 사용하기 때문에 표준화에 적합 할 수있다.

혈액이 신체 내에서 포함되어 있지 않은 일단 응고 캐스케이드 반응을 쉽게 활성화되어 있기 때문에, 제어가 재석 선회 공정이다. 티ㅇ이를 연기 할 필요가 2 + 칼슘 첨가에 바로 반응 콜라겐 표면 관류 전에 칼슘 2 + 버퍼가 정적 혈액을 대량으로 공급 될 때 때문에, 응고은 필연적으로 결국 튜브를 막힘과 데이터를 바이어스, 발생 해석 (데이터 미도시). 이 문제에 대한 해결책은 분석 챔버 길에 재관류 중에 대류 및 확산 힘에 의해 혼합을 허용 별도로 칼슘 버퍼 혈액 펌프이다. 완전한 혼합은 혼합 및 분석 챔버 사이의 튜브 46 cm 세그먼트에서 얻을 수있다. 이 길이는 시약의 최적 지속 시간에 대해 계산 된 사용 유속 재관류 동안 대류 질량 수송 (21)의 기본 법칙 (1000 S-1)에 기초하여 믹스. 이 방법은 제어 및 재현성이 입증되었다.

응고 접촉 활성화는 때때로 간단한의 유물로 간주됩니다응고 시간을 해석 할 때 혈액 샘플링과는 피해야합니다. 따라서, 우리는 억제제의 부재, 접촉에 의한 응고가 관류의 16.7 분 (± 3.7 분)에서 시작 있음을 보여 주었다. FXIIa 매개 접촉 활성화를 억제하는 CTI의 존재 하에서 응집 실험 (30 분)의 임의로 정의 과정 개시되지 않는다. 실험이 창은 프로 또는 항 혈전있는 샘플을 식별 할 수있을만큼 충분히 길다. 연락처를 활성화하여 응고 혈액이 인공 표면을 접촉 원치 않는 결과가 될 수 있지만, 우리의 데이터는 혈소판의 명확한 생물학적 선량 효과를 보여줍니다. FXII에 대한 최근의 연구 결과는, 혈소판, 10 폴리 인산 포스파티딜 세린 분배 (22), 혈소판 미세 입자 (23)가 실제로 지혈, 전자에 중요한 기여로 접촉 경로 응고를 재평가 한 때문에, 수혈 의학 중요 할 수있다특히 혈전증 (24)의 상황이다. 성공적인 응고가 이러한 요인에 의존 표시되는 경우 예를 들어, 환자의 혈소판 수혈의 변수 수율 또는 뱅크 혈소판의 변수 포스파티딜 세린의 발현 따라서 치료 효과에 변동성을 야기 할 수 있음.

콜라겐, 외적 응고 경로, 또는 TF 경로와 지질 화 rhTF 공동 고정화, 콜라겐에 혈소판 증착 동안 활성화됩니다. 이 TF 베어링 세포와 조직과의 접촉으로 혈액을 가져 부상 모델로, 가장 포괄적 인 모드로 분석을 확장합니다. 우리의 데이타는 콜라겐과 TF 공동 고정화 응고 개시의 순간을 감소하지만, 응고 속도를 변경하지 않는 것을 나타낸다. 참고로, 표면에 고정화 된 rhTF의 양이 모델 (25), (26)에있어서 중요한 변수로 주어진 연구에서 표준화되어야한다. presen에서접촉 활성화가 억제되기 때문에 CTI의 CE가 상기 TF 경로를 배타적으로 연구 될 수있다 (도시되지 않음).

결론적으로, 우리의 실험 장치는 뱅크 혈소판과 혈소판 혈액의 재구성 및 유체 흐름에서 칼슘 의존 혈소판 증착 및 섬유소 형성하여 지혈의 모델로 수혈의 모델을 결합합니다. 이 분석은 뱅크 혈소판의 응고 자연에 대한 질문에 대답하는 데 사용하고 효과 혈소판 농축액 제조 기술이에해야한다.

Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

이 연구는 연구와 벨기에 적십자 - 플랜더스 혈액 서비스의 개발을위한 재단에 의해 지원되었다. 계약 번호 BOF30290744와 프로젝트에 부여 된 겐트 대학에서 - 우리는 "Bijzonder onderzoeksfond"(특별 연구비 BOF)에서 제공하는 재정 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD A00434
10 mL Syringe BD 309604
2 mL Syringe BD 307727
Alexa Fluor 405 Life Technologies A30100 The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Coagulation buffer in house preparation in house preparation 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15 mL Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 mL Greiner bio-one 227261
Corn trypsin inhibitor (CTI) Enzyme Research Laboratories CTI
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
DiOC6 Sigma-Aldrich 318426 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump Cellix EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer Sysmex pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Incubation water bath GFL 1013
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8
Pipette Brand A03429
Pipette tips 100-1000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Platelet concentrate orbital shaker Helmer PF-48i
Precision wipes Kimtech 5511
Pepsin solution  Hanna instrument HI7073L  2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin Dade Berhing B4212-40 rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vena8 syringe connector pin Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Coated biochip
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips Cellix VDY1-400-100-01-02 Mixing biochip
Vortex mixer VWR 58816-121
ZEN2012 software Zeiss

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References

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