מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

Bioengineering
 

Summary

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst, B., Vandekerckhove, P., Feys, H. B., Compernolle, V. A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time. J. Vis. Exp. (120), e55351, doi:10.3791/55351 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מודלי microfluidic של המוסטאסיס להעריך תפקוד טסיות בתנאים של גזירה הידרודינמית, אך בנוכחות של תרופות נגד קרישת דם, ניתוח זה מוגבל בתצהיר טסיות בלבד. הקשר המסובך בין פונקצית הקרישה הטסיות התלויה 2+ Ca דורש recalcification זהיר ומבוקר של דם לפני הניתוח. ההגדרה שלנו משתמשת ערוץ ערבוב בצורת Y, המספק חיץ Ca 2 + / Mg מרוכז 2+ זורם בדם רק לפני זלוף, מה שמאפשר recalcification המהיר ללא קיפאון מדגם. הבדל של פי עשר מהירויות זרימה בין שני מאגרי ממזער דילול. הדם recalcified הוא perfused אז בתא ניתוח מצופה קולגן, וסימון ההפרש מתיר הדמיה בזמן אמת של שניהם בתצהיר טסיות הפיברין באמצעות מיקרוסקופ וידאו הקרינה. המערכת משתמשת רק כלים זמינים מסחרית, להגדיל את הסיכויים של סטנדרטיזציה. כינון של throדם mbocytopenic עם טסיות הפקידה מתרכז יתר דגמים עירוי טסיות, המוכיח את השימוש בו בתחום מחקר זה. נתונים למופת הוכיחו כי התפרצות קרישה בתצהיר הפיברין היו תלויים באופן ליניארי על ריכוז טסיות, המאשר את היחסים בין המוסטאסיס יסודי ותיכון במודל שלנו. בתוך פרק זמן של לפחות 16 זלוף, הפעלת מגע לא התקיימה, למרות recalcification לקדמותו Ca 2+ ורמות Mg 2+. כאשר גורם קרישה XIIa היה עצור על ידי מעכבי טריפסין תירס, מסגרת זמן זו היה אפילו יותר, מה שמעיד על טווח דינמי ניכר בו שינויים באופי procoagulant של טסיות ניתן להעריך. Co-וקיבוע של גורם רקמת קולגן משמעותי את הזמן להופעת קרישה, אבל לא בקצב שלה. האפשרות ללמוד את גורמי רקמה ו / או מסלול הקשר מגדילה את צדדיות שירות של assay.

Introduction

המוסטאסיס יסודי ותיכון היו להמשיג במקור שני תהליכים ביוכימיים הניתנים להפרדה יחסית. המוסטאסיס ראשי נתפס כתורם מרכזי תנאי זרימה עורקת, עם תפקיד מפתח עבור טסיות, בעוד נתפס המוסטאסיס משני לשלוט קרישה תחת זרימת דם מוריד, המאפשר מפל פרוטאז לגבש הפיברין מסיס. בעשורים האחרונים אשר עצבו השקפה מסורתית זו באופן משמעותי, והודה כי הפעלת טסיות וקרישה תלויות זה בזה הם תהליכים חשובים באותה מידה במהלך המוסטאסיס פיסיולוגי ופתולוגיים בכל (לא קיצוניים) בחוגים הידרודינמית. השקפה זו תורגמה למרפאת, שם מבחנים המציאו כדי למדוד כל-דם קרישה באופן מקיף יותר ויותר בשימוש, אם כי עם הרבה שאלות שנותרו רלוונטית, תחולה וקהילה 1.

פרסמנו לאחרונה אנליזה פונקציונלית של טסיותמרכזת באמצעות תאי זרימה microfluidic מצופה קולגן סיבי במודל במבחנה של עירוי 2, עם דגימות המכילות כמויות רגילות של כדוריות דם אדומות, פלסמה וטסיות דם. שיטה זו משתמשת הפרין או הירודין anticoagulated דם, רומז שום או מעורבות מוגבלת של המוסטאסיס משנית, אשר תלויה הדור תרומבין וסידן מיונן (Ca 2 +). כדי לתמוך היווצרות תרומבין וכך לכלול את כל ההיבטים של המוסטאסיס תחת זרם microfluidic, פיתחנו שיטה משלימה על אותה פלטפורמה טכנית, עכשיו כולל חינם Ca 2 +. בדרך זו, בתצהיר טסיות והיווצרות הפיברין ניתן ללמוד, שוב במודל של עירוי טסיות, כדי להעריך את איכות תרכיז הטסיות.

בשיטה זו, טסיות ו פיברינוגן מסומנים עם fluorophores כי יש להפריד ספקטרום פליטה מלאה. צבע כפול, מיקרוסקופיה וידאו בזמן אמת ואז מתיר ניתוחהידבקות טסיות עיקרית, וכן ייזום קרישה בתצהיר הפיברין. משתנה חשוב בסוג זה של assay הוא recalcification, כי התוספת של Ca 2 + לדם סטטי, לפני זלוף, בהכרח תגרום קרישת קשר ביוזמת בתוך המכל. חניכה זה תהיה להטות את ההודעה עקב סתימת פתחי כניסת צינורות biochip לפני זלוף. לכן, בשיטה שלנו, ציטרט anticoagulated דם וכרית המכילה Ca 2 + נשאבת בנפרד דרך הרגליים העליונות של תא מפרצון בצורת Y. הרכיבים מעורבבים במהלך זלוף לפני הכניסה תא ניתוח מצופה קולגן לבד או בשילוב עם גורמי רקמה אנושי רקומביננטי (rhTF). על ידי התאמת מהירויות הזרימה של משאבות נפרדות ואת הריכוז של Ca 2 + למאגר, דילול 10% מהמדגם דם הסופי מתרחש.

שימוש בפרוטוקול מורחב זה, אנחנו מדגימים את תרומת coagulaXII גורם tion (FXII) וריכוז טסיות לפנות ייזום קרישת מסלול תחת זרם. הנתונים שלנו מראים גם כי על ידי ציפוי rhTF לצד קולגן, מסלול גורמי רקמה ניתן למדוד בו זמנית.

Protocol

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות אתיות המוסדיות למחקר על דגימות אנושיות, והסכמתם התקבלה מכל התורמים מעורבים. אישור הניסויים שתוארו כאן הושג מלוח הסקירה המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי של אנטוורפן (מספר אישור 16/10/120).

הערה: סימנים טמפרטורה הם תמיד בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין.

התקנת 1. מיקרופלואידיקה

  1. הכן את ערוצי תא הזרימה microfluidic, צינורות, וסיכות המחבר
    1. Resuspend הבקבוקון המניות קולגן על ידי ערבוב מערבולת, ולאחר מכן לדלל בפתרון גלוקוז איזוטוני שסיפק היצרן לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
      הערה: קולגן גיד סוסים השתמשו, בעיקר מורכב מסוג I סיבים. אני קולגן מסוג הסוס הוא המכונה לעתים קרובות כמו "הורם" קולגן הוא תקן הזהב עבור סוג זה של assay, הן הסטוריותסיבות ביולוגיות. סוג האדם קולגן III יכול לשמש גם, אבל מעיל הסיבים האלה פחות טוב, והתגובה טסיות אינה כה חזקה. משטחי ציפוי אחרים יכולים לשמש גם, כגון גורם פון Willebrand, פיברינוגן, פיברונקטין, laminin, vitronectin, thrombospondin-1, או שילובים של 3 אלה.
    2. קח biochip microfluidic חדש, חד פעמי עם שמונה ישר, ערוצים מקבילים ממדים, מ"מ, 0.4 W x 0.1 H x 20 ל Pipet 0.8 μL של קולגן לתוך התעלה (ים) של biochip בצד אחד תווית זו המשקע. למלא רק 5/6 של אורך הערוץ, כך סיבי קולגן אינם מצופים על כניסת הערוץ, כיוון שהדבר עלול לגרום סתימה, חוסם זלוף ויעיל.
    3. דגירה biochip ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות במיכל humidified וחתום.
    4. כדי ללמוד גורם רקמה (חיצונית) קרישה בתיווך בשילוב עם מסלול מגע (פנימי), מעיל הערוצים עם collagen גורם רקמות אנושי רקומביננטי (rhTF).
      1. לדלל rhTF ב 10 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) -buffered מלוחים (HBS; 0.9% (w / v) NaCl, pH 7.4, 1: 3,000, ריכוז המניות: 4.5 ננומטר).
      2. הסר את פתרון הציפוי-קולגן באמצעות משקע. Pipet 0.8 μL של rhTF ב HBS (דילול 1/500 של ריכוז המניות, ריכוז סופי: 9 PM) לשקע של הערוץ, מילוי 5/6 של אורך הערוץ, בדומה לאסטרטגיה קולגן-ציפוי.
      3. דגירה biochip עבור 30 דקות נוספות במיכל humidified וחתום.
    5. מלאו את ערוצי מצופה חסימת חיץ (1.0% (w / v) אלבומין בסרום שור ו -0.1% (w / v) גלוקוז HBS), החל מהקצה השני (שכותרתו מפרצון). מלאו מספר שווה של תעלות בצורת Y עם אותו למאגר החסימה בתוך biochip ערבוב.
      1. ודא שכל הערוצים וזרועות ערוץ מלאים לחלוטין עם חסימת חיץ. דגירה היא biochipים עבור 1 שעות לפחות במיכל humidified וחתום.
    6. לכל ערוץ בשימוש, להכין שני צינורות של 8 ס"מ, אחד 2 ס"מ ארוך, ארוך 46 ס"מ. מניח סיכה בקצה אחד משלושת הצינורות הקטנים בשני הקצוות של הצינור הארוך.
  2. הכן את משאבת שטיפה
    1. יש לשטוף את כל fluidics המשאבה ואת צינורות הקשורים במים מזוקקים.
    2. Degrease הליהוק של biochip עם דיוק ללא אבק לנגב ואלכוהול מפוגל להסיר הדפסים ואבק.
    3. מלא את כל הצינורות עם חיץ חסימה לפני חיבורם אל biochips.
    4. תקן את biochip מצופה על במת מיקרוסקופ האוטומטית. תקן את biochip הערבוב באותו הגובה כמו במת מיקרוסקופ, באמצעות תקע מספרי מעבדה.
    5. חבר את biochip מצופה עם biochip הערבוב באמצעות הצינורות הארוכים, ארוכים 46 סנטימטר. ודא שני biochips הוא במרחק כך הצינורות יוצרים קו גמיש אך ישר. צרף פיני מזרק לתוך צינורות Luer התואמים של משאבת השטיפה. חבר אותו את הקצה החופשי של צינור 2 סנטימטר ולתקן את הקצה השני לשקע של biochip המצופה.
    6. תקן את צינורות 8 ס"מ שנתיים עד כניסת biochip ערבוב באמצעות סיכות שלה. מכניסים את הקצה החופשי של כל צינורות בבקבוקון של HBS. יש לשטוף את כל צינורות וכל ערוצי עם 1 מ"ל HBS.
      הערה: HBS זורם מהבקבוקון דרך צינורות 8 סנטימטר לשבב הערבוב דרך צינורות 46 סנטימטר לשבב והמצופה (נובעת הציפוי לחלק מהצופה) בשל כוח המשיכה של משאבת השטיפה. צעד זה מסיר את חיץ החסימה גרוע קולגן הדבק (או rhTF ב biochips פעמים המצופות).
  3. הכן את משאבות זלוף
    1. פתח את תוכנת מנהל ההתקן של משאבות זלוף. אתחל את המשאבות על ידי לחיצה כפולה על סמל המזרקים בתוכנה.
    2. בחר את סוג המזרק אשר ישמש: 1 מזרקי מיליליטר עבור B הקרישהuffer ו -2 מזרקים מ"ל על הדם מחדש.
  4. חבר את המזרקים בניית biochip
    1. נתק את משאבת שטיפה וכל צינורות, למעט אחד המחבר בין שני biochips. הצינורות המנותקים הוא שימוש חוזרים בשלבים הבאים.
    2. חבר את צינורות 2 סנטימטר עם פיני מזרק שלה למנעול Luer של צינורות פסולת עבי חומה. מלאו את הצינור עבה חומה עם פתרון פפסין רגיל באמצעות מזרק.
      הערה: התוספת של פפסין אל מעכב צינורות הפסולים lyses קרישה שלאחר זלוף ולכן מונעת סתימת המערכת בסוף בחזרה.
    3. אבטח את הקצה הפתוח של הצינור עבה חומה עם מלחציים קוצ'ר. מניחים מיכל פסולת מתאים עם מתחת אקונומיקה כדי לאסוף את הזרימה דרך.
    4. תקן את הצינורות עם הסיכה שלה לשקע של biochip המצופה.

2. הכנת דגימות דם

  1. איסוף הדם מן מתנדב בריא ולהפריד מרכיביו 4
    1. איסוף דם בחומצה ethylenediamine-tetraacetic פונו מיכל (EDTA). השתמש במדגם זה רק לביצוע ספירת דם מלאה (CBC) באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית.
    2. איסוף דם במיכלים נתרן ציטרט פונה. 5 מיליליטר של דם נדרש לכל ערוץ.
    3. מניח את המדגם (ים) על כינון מחדש דם ממתינים אופקי מסובבת.
      הערה: assay אמור להסתיים בתוך 3 שעות של phlebotomy. טסיות להתרכז דגימות כל-דם הם ABO / RHD דם הקבוצה מתאימה.
    4. צנטריפוגה במשך 13 דקות ב 250 XG כדי להכין פלזמה עשירה בטסיות (PRP). אין להשתמש בלם צנטריפוגות כדי למנוע הפרעה של הגלולה הארוזה בצורה רופפת.
    5. מעביר את PRP לצינור צנטריפוגה חרוטים טרי. צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 4500 XG (עם בלם) כדי גלולה טסיות ולהכין פלזמה ירודה טסיות (PPP). מחק את platגלולת elet. דגירה PPP באמבט מים ב 37 ° C.
    6. מעביר את תאי הדם אדום ארוזים צינור חרוטים טרי ידי ניקוב התחתון של אחד המקורי עם מחט 21 G.
      הערה: ספירת הטסיות שיורית בשבריר תא אדום ארוז הוא 11 ± 4 x 10 3 לכל μL (ממוצע ± סטיית תקן, n = 10).
  2. לשקם דם
    1. קבע את ההמטוקריט של כדוריות הדם האדומות הארוזות מוכנות בשלב 2.1.6 באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית.
    2. קבע את הריכוז של טסיות של תרכיז טסיות אשר ישמש לצורך הניתוח באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית.
    3. חשבתי את נפח תאי דם אדום ארז, תרכיז טסיות, PPP שיניב המטוקריט 40% ו -250 x 10 3 טסיות / μL בנפח 2.5 מיליליטר סופי. מערבבים אלה להכין דם מחדש ולבצע CBC.
      הערה: כותרות יעד אחרות של תאים ניתן להשתמש, בהתאם השאלת מחקר דואר.
    4. כן מדגם שליטה "ריק", שבו היקף תרכיז הטסיות מוחלף הנפח הזהה של תמיסת מלח כדי לקבוע את הריכוז של טסיות "אנדוגני" (כלומר, טסיות בנקאית בלתי דם).
  3. לייבל דם מחדש עבור טסיות פיברינוגן
    1. Pipet 13 μL של פתרון 10.7 מ"ג / מ"ל ​​של אלקסה פלואוריד פיברינוגן 405 שכותרתו (70 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי) במבחנה ולהוסיף 1 מ"ל של דם מחדש.
      הערה: Fibrinogen היה שכותרתו באמצעות ערכה זמינה מסחרי בהתאם למדריך של היצרן.
    2. מערבבים עוד 1 מ"ל של דם מחדש במבחנה המכילה 2 μL של 1 מ"מ DiOC 6 (1 מיקרומטר הריכוז הסופי) או המכיל 2 μL של 5 מ"מ Calcein AM (5 מיקרומטר הריכוז הסופי). הוסף את זה את שפופרת המכילה את הדם עם פיברינוגן, נותן נפח סופי של 2 מ"ל של platelet- ו פיברינוגן-sדם מזרקה.
      הערה: הבחירה של צבע יכול לסמוך על שאלת המחקר או ההעדפה של החוקר 5. עליך להיות מודע לכך עירור של כל צבע יכול לגרום להפרעות פוטו.
    3. לערבב בעדינות על ידי היפוך. דגירה המדגם עבור 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. הכן את חיץ הקרישה
    1. הכן חיץ קרישה המכיל 10 מ"מ CaCl 2 ו 3.75 מ"מ MgCl 2 ב HBS. הכן 1 מ"ל של חיץ קרישה עבור ערוץ אחד.
    2. סנן לעקר את החיץ קרישה דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. טרום חמים זה ל -37 מעלות צלזיוס.

3. Assay זלוף

  1. פוקוס אופטיקה מיקרוסקופ אל סיבי קולגן דבקה בתחתית הערוץ. השתמש בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC). בחר "קבע Z הנוכחי עבור אזורי אריח שנבחרו" בתוכנת הניסוי כדי לתקן את המיקוד שנבחר באופן דיגיטלי.
  2. גדר באזור (ROI) עניין הערוץ הנבחר באמצעות תוכנת הרכישה של המיקרוסקופ.
    הערה: ROI יכול להיות כל שטח הפנים נבחר באופן שרירותי בתוך ערוץ זלוף. מומלץ לא לנתח היווצרות פקיק ודור הפיברין קרוב הכניסה והיציאה על מנת למנוע רכישת תמונות של thrombi התחלק באופן אחיד. שטח הפנים ROI צריך להכיל מספר לא מבוטל של thrombi כדי לאפשר את פילוס מתוך השתנות האות על ידי טסיות הפרט. מיקומו של ROI של XY-מטוס של הערוץ הוא קבוע תמיד וקבע לפני זלוף. במידת הצורך, החלק ללא ציפוי של הערוץ ניתן לכלול בניתוח כדי לקבוע אם טסיות לאגד nonspecifically הפלסטיק biochip.
  3. הכינו דגימות עבור זלוף
    1. הר מזרק 1 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ קרישה מחומם מראש ב המשאבה זלוף.
    2. מערבבים את דם טרום חימם מחדש על ידי היפוך בעדינות עומס 2 מ 'L בתוך מזרק מ"ל 2.
    3. ודא שכל האוויר יוסר משני מזרקים לחבר כל אל צינורות 8 ס"מ באמצעות פינים מזרק.
    4. ראש המחברים צינורות של שני מזרקים במהירות גבוהה (400 μL / דקה) ולהפסיק כשהכל מלא חיץ קרישה או דם.
      הערה: על ידי תחול צינורות, למאגר קרישה ודם מחדש יהיה מעורב באופן מיידי בערוץ בצורת האות V של biochip ערבוב כאשר תחילת הניסוי, הימנעות כניסתה של אוויר אל תאי זלוף.
  4. באמצעות סיכות, לתקן את הקצה השני של שני הצינורות לרגלי הפיצול של הערוץ בצורת Y ב biochip הערבוב. הרגל התחתונה משמשת מרוססת חיץ קרישה ואת הרגל העליונה לדם מחדש.
  5. הפעל את הניסוי על ידי ייזום זלוף ב 4.4 μL / דקה עבור חיץ קרישה ו -44 μL / min הדם מחדש. הסר את מהדק קוצ'ר במוצא הצינורות הפסולים להתיר perfuשיאון.
    הערה: שיעור הזרימה יכולה להיות שונה בהתאם לשאלת המחקר. התחל סטופר כדי לקבוע את הזמן בין מועד ההתחלה של הניסוי ואת תחילת רכישת תמונה בזמן אמת.
  6. תמונות שיא כל 10 שניות למשך 30 דקות בזמן אמת באמצעות תוכנת הרכישה ולהתנסות של המיקרוסקופ. התחל הקלטה כאשר תמהיל הדם מחדש חיץ קרישה נכנס biochip המצופה רכוב על במת מיקרוסקופ.
    הערה: סדרות עתיות אחרות יכולות לשמש תלויים בהגדרת הניסוי. השתמש בהגדלת 100x (אובייקטיבי 10X ו 10X עדשות).

ניסוי סיום 4.

  1. לסיים את משאבות רכישת תמונה לאחר 30 דקות או קודם לכן, אם האות רווי. לנתק את כל הצינורות והמזרקים וזורקים אותם כמו פסולת ביולוגית מסוכנת.

ניתוח 5. נתונים

  1. לקבוע צמיחה פקיק (פלואורסצנטי ירוק) והיווצרות הפיברין (סגול fluorescencה) קינטיקה עם תוכנת ניתוח התמונה. הפקודות הבאות הן ספציפיות עבור התוכנה המשמשת כאן:
    1. פתח את עיבוד התוסף: ספרונים לתפור את תמונות Side-by-side לכל נקודת זמן.
    2. פתח את ניתוח תמונת תוסף כדי לקבוע את כיסוי השטח של טסיות.
    3. פתח את מדוד התוסף. הגדר את ההחזר על ההשקעה על ידי ציור באזור מלבן כולל כל סיבי thrombi ו הפיברין; בפרוטוקול זה, ההחזר על ההשקעה הוא מלבן מדידה 637 מ"מ 2.
      בחר בכרטיסייה כל הצפיות לכלול בכל נקודות הזמן המוקלטות.
    4. השתמש צור שולחנות ליצור גיליון אלקטרוני באופן אוטומטי שיכיל את ערך עוצמת קרינה הממוצע של האזור המלבן הנבחר בכל נקודת זמן.
    5. שמור את הגיליונות האלקטרוניים בפורמט XML.
  2. פתח גיליון אלקטרוני בתוכנית גיליון אלקטרוני לחישובים נוספים.
    1. הפחת את הראשונית (background) ערך כל הנתונים.
    2. שרטט את אות הניאון כפונקציה של זמן זלוף הוא ירוק (טסיות) ואת הצבע הסגול (הפיברין).
      הערה: קחו בחשבון את הזמן בין אתחול משאבת ונקודת המוצא בפועל של רכישת התמונה. היווצרות פקיק היא בדרך כלל תהליך בן שני שלבים במודל זה: (1) "איטי" הידבקות טסיות (כלומר, הדבקה) לקולגן המשותקת ואחריו (2) צמיחת פקיק מונחה קרישה עם עלייה "מהירה" בשני טסיות המחייבים ( כלומר, צבירת) בתצהיר הפיברין (כלומר, קרישה) (איור 1).
    3. חשבתי את השיפוע של הידבקות טסיות וצבירה ידי רגרסיה ליניארית; המדרון הזה מניב קינטיקה צמיחה פקיק טסיות בכל שלב של הקמתו.
    4. חשב את השיפוע של קרישה הפיברין ולהקיש את הקו הזה כדי ליירט את ציר ה- X, קביעת רגע התפרצות.

Representative Results

הניתוח של נתונים גולמיים בזמן אמת מתואר באיור 1. ראשית, טסיות לדבוק פני השטח תגובתי, וכתוצאה מכך עלייה מתמדת פלואורסצנטי ירוק רשמה (איור 1 א, ט), שנקרא הידבקות. במהלך שלב זה, יש קרינה סגולה קטנה, המציין כי הפיברין הוא לא או הוא רק נוצר שולי (איור 1B). עם תחילת הקרישה, סגול-קורנים פיקדונות הפיברין במהירות (iii), ובמשך כל הזמן הזה, עליות פלואורסצנטי ירוקות טסיות בערך באותו השיעור, המיועדות כאן הצטברות טסיות (ii). ניסוי בודד ובכך מחזיר שלושה שיעורי גידול קרינה (I, II, ו- III) כסמן פונדקאי עבור המהירות שבה בתצהיר טסיות הפיברין מתקיים במודל זה. יתר על כן, ברגע של הופעת קרישה (רגע-של-onset (iv)) הוא אקסטרפולציה, אשר הוא קובע של טסיותפוטנציאל procoagulant.

בהעדר TF, ייזום קרישה איטי והוא פועל בעיקר דרך מסלול הקשר שם מתחם tenase מהותי מפעיל FX באמצעות הפעלה ישירה של FIX 6 על ידי FXI ו / או FXII. כדי להדגים את תלות FXII, 4 מיקרומטר של מעכבי טריפסין התירס (CTI) נוסף לעכב FXII מופעל (FXIIa) 7. עיכוב זה לא משפיע על הידבקות טסיות (איור 2 א), אבל קרישה לא להתחיל את משך הזמן הכולל מוגדר באופן שרירותי של ניסוי זלוף (איור 2B ו משלים וידאו 1).

במבחנה, מסלול הקשר ניתן ביוזמת חומרים זרים כמו זכוכית, או מבחנים קליניים באמצעות חומר מינרלים כמו קאולין. בשנת vivo, טסיות מופעל לספק את המטען השלילי 8 </ sup> דרך חשיפה הממברנה של פוספוליפידים חומצי 9, כמו phosphatidylserine, ו / או באמצעות שחרור polyphosphates (פוליפ) 10, 11. מחקה assay microfluidic בזמן אמת שלנו הלה כי, בטווח של ריכוזי טסיות, התגובה עוצר דמום תלוי ספירת הטסיות (איור 3). על ידי הגדלת מספר הטסיות במדגם מחדש, שיעור הדבקה (איור 3 א), הצטברות (איור 3B, ירוק), וקרישה (איור 3B, סגול) עלה באופן ליניארי. ברגע-של-onset קצר משמעותי (איור 3 ג) על ידי ריכוז טסיות הגדלה, דבר המצביע על כך מספר סף של (מופעל) שהופקד טסיות נדרש להפעיל קרישה.

עם נזק לרקמות in vivo, לעומת זאת, TF נושאות תאים אקבלnitiate קרישת הדם דרך מתחם tenase חיצוני FVIIa-TF בנוכחות Ca 2 +. זה חיקה ההתקנה הניסיונית שלנו בדואר ציפוי לתאי זלוף המכיל קולגן עם rhTF lipidated. בניתוח לזווג ערוצי מצופה קולגן בלבד או בשילוב עם rhTF, התפרצות קרישה היה מהר יותר באופן משמעותי (איור 4 א). שיעור הידבקות טסיות לא היה ליניארי, ולכן אין רגרסיה ליניארית יכולה להתבצע (מידע לא מוצג). הן שיעור קרישה וצבירת טסיות לא היו שונים בין התנאים (איור 4 ב-4C, משלים וידאו 2).

איור 1
איור 1: ניתוח רגרסיה של הידבקות טסיות וקרישה בתאי זלוף microfluidic. נתון זה מבהיר את הפרמטרים הנגזרים מנתוני גלם קרינה בזמן אמת שנרכש במהלך זרימת דם recalcified מעל משטח תגובתי. (א) ממוצע עוצמת הקרינה ירוקה מראה בתצהיר טסיות בתפקוד זמן זלוף. העקום מתאר תהליך bimodal החל (i) הגדלת הידבקות טסיות ליניארי לאט ואחריו (ii) גדלה הצטברות ליניארי במהירות. שני החלקים ליניארי של עקומת רגרסיה והשיפוע אלה מתארים שני שיעורי היווצרות פקיק ידי קרינה טסיות; (I) דבק (ii) הצטברות. (ב) ממוצע עוצמת הקרינה סגולה תערוכות בתצהיר של הפיברין כפונקציה של זמן. במהלך הידבקות טסיות, קרינה סגולה היא בעצם נעדרת, בזמן שהוא במהירות מפתחת החניכה הבאה של קרישה. ה (iv) רגע-של-onset מוגדרת ליירט עם ציר ה- x של רגרסיה ליניארית אקסטרפולציה של (iii) בשלב השני של היווצרות פקיק ידי הקרינה הפיברין המיועד כאן קרישה.יעד EF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: בהעדר TF, קרישה בתאי זרימה זלוף מצופה קולגן תלוי FXIIa. זלוף microfluidic דם מחדש המכיל CTI או חיץ מלא (CONTROL) בוצע בשיעור גזירה של 1,000 s -1 עבור סכום כולל של 30 דקות. (א) שיעור הידבקות טסיות (s -1) לא היה תלוי CTI. (ב) הרגע-של-onset עבור דגימות שטופלו CTI היה מעבר לגבול 30 דקות של הניסוי (מוצג כקו מקווקו), הוכיח את תלות FXIIa של פרמטר זה. קווים ונקודות הם ערכים ממוצעים, שפם הוא סטיית התקן. ניתוח סטטיסטי היה על ידי מבחן t מזווג. (NS = לא משמעותי, n ≥3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: קרישה תחת זרם תלוי במספר הטסיות. ניסויי זלוף microfluidic בוצעו בתאים מצופים קולגן עם דם מחדש בנוכחות Ca 2 + וריכוזי טסיות משתנים (n ≥3). (א) שערי הידבקות טסיות (B) שיעור צבירת טסיות (ירוק) וקרישה (סגול), ו- (ג) רגע-של-onset מוצגים תפקידי ריכוזים טסיות בדם מחדש. נקודות הן ערכים ממוצעים, שפם מציין את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג versi גדולעל של נתון זה.

איור 4
איור 4: הפעלת שתי קרישת TF ומגע מסלול משמעותי מקצרת את הרגע-של-תחילת הקרישה. מחדש בדם, בנוכחות Ca 2 +, היה perfused דרך התאים מצופים קולגן לבד או עם קולגן rhTF ללמוד את מסלול המגע בלבד או שילוב של מסלולי קשר TF. (א) ברגע-של-תחילת קרישה מתקצר משמעותית בתאי זרימה המכיל TF. (ב) שיעור צבירת טסיות במהלך קרישה ו- (ג) שיעור קרישה אינם שונים משמעותית בין קולגן בלבד או collagen- ותאי זרימת מצופה rhTF. קווים ונקודות הם ערכים ממוצעים; שפם מציין את סטיית התקן. ניתוח סטטיסטי היה על ידי מבחן t מזווג. (NS = לא משמעותי, * P < 0.05, n ≥3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

וידאו 1
וידאו משלים 1: בהעדר TF, קרישה בתאי זרימה זלוף מצופה קולגן תלוי FXIIa. התפקיד של מסלול המגע נקבע תאי זרימת זלוף מצופה קולגן. (א) רצף תמונת קרינה מעולף של טסיות (ירוק) הפיברין (עוגן) בתצהיר (סגול) בהעדר CTI. (ב) רצף זהה פנל אבל עם המסלול הירוק כבוי. (C) רצף תמונת קרינה מעולף של טסיות (ירוק) הפיברין (עוגן) (סגול) בתצהיר בנוכחות CTI. (ד) רצף זהה הפאנל C אבל עם המסלול הירוק כבוי."Target =" ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2
משלים וידאו 2: הפעלת שני TF ואת מסלול הקשר מקצר את הקרישה משמעותית רגע-של-onset. כדי ללמוד את התפקיד של TF, תאי זרימה מצופה קולגן לבד או עם קולגן rhTF שימשו. (א) רצף תמונת קרינה מעולף של טסיות (ירוק) הפיברין (עוגן) (סגול) בתצהיר בתאי תזרים המצופה רק עם קולגן. (ב) רצף זהה פנל אבל עם המסלול הירוק כבוי. (C) רצף תמונת קרינה מעולף של טסיות (ירוק) הפיברין (עוגן) (סגול) בתצהיר בתאי תזרים מצופה הוא עם קולגן rhTF. (ד) רצף זהה הפאנל C אבל עם switc המסלול הירוקהד off. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

Discussion

עירוי טסיות מתרכז רושם למטופל thrombocytopenic למנוע או לעצור את הדימום. ההשפעה הקלינית שלה היה מסומן לאחרונה סקירה היסטורית של לוקמיה חריפה 12, ונזכר כי שיעורי ההישרדות מוגבר מטופלים ילדים בשנות השישים והשבעים היו המיוחס בעיקר לשיפורים (טסיות) רפואה עירוי. תרכיזי טסיות משמשים גם כדי לבלום דימום טראומה חריפה או במהלך ניתוח. בתנאים אלה, טסיות עם תכונות procoagulant מצוינות כי במהירות ליזום המוסטאסיס עדיף, אבל מתרכז טסיות ערוכים מתרומות של תורמים מרצון ושלא כמו תרופות פרמקולוגיות, הם טופלו ע"י הכנה בלבד, ולא על ידי רכב (כימי). לכן, כמה שאלות בתחום בנקאות דם הם ללא מענה, כוללים אלה על שיטות תרומה אופטימליות, תנאי אחסון, ושיטות עירוי. בתחום platelet (עירוי) ביולוגיה, שאלות רבות על אישור התא מהמחזור, תרומת טסיות בעירוי כדי המוסטאסיס, או אימונולוגיה שלהם גם נותרו ללא מענה.

טכניקות מעבדה רבות לניתוח תפקוד טסיות זמינות, אבל אלה בעיקר להתמודד עם היבט מיוחד של תפקוד טסיות, כגון איסוף או degranulation 13. כדי רחב להעריך טסיות ותרכיזים טסיות, מודלים מקיפים של המוסטאסיס הם הכרחיים, ועל אלה לכלול הידרודינמיקה. Rheology דם חיוני לפרש התנהגות טסיות כראוי במהלך המוסטאסיס 14, 15 או פקקת 16, גם אם קרישה מונע Ca 2 + ו / או תרומבין להשתתף במעמד ציטראט או הפרין, בהתאמה 2. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין קרישה ותפקוד טסיות תחת זרם 17, 18, דור תרומבין רגיל נדרש, ולכן, Ca חינם 2 + גם כן. הגדרת הניסוי ללימוד המוסטאסיס בתנאים אלה מורכבת, היות אמצעים למניעה "חפץ" או הפעלה לא מבוקרת של קרישה צריכה לקחת כמה שיותר. יתר על כן, הרבה קבוצות מחקר מיוחדות להשתמש בחומרת מחוייט 19, 20, הגורם השתנות היתר ומעבדה משמעותיות 5. מגבלות טיפוסיות של גישה זו הן את השימוש של כלי מלבני, פרופילי זרימה בלתי pulsatile, וציפויי משטח שאינו אדם 5. את assay המתואר כאן משתמש בכלים זמינים מסחרי ולכן עשוי להיות מתאים סטנדרטיזציה.

בגלל תגובת מפל הקרישה מופעלת בקלות ברגע דם ולא בתוך גוף האדם, נשלטה recalcification היא צעד מכריע. To להשיג זאת, תוספת של Ca 2 + צריכה להידחות עד ממש לפני זלוף על פני קולגן תגובתי, כי כאשר מאגר Ca 2+ מסופק בכמויות גדולות לדם סטטי, באופן בלתי נמנעת הקרישה מתרחשת, בסופו של דבר סתימת צינורות הטיית נתונים פרשנות (מידע לא מוצג). הפתרון לבעיה זו הוא להגביר את חיץ Ca 2 + והדם בנפרד, המאפשר ערבוב ידי כוחות הסעה ו מתרחבים במהלך זלוף בדרכה אל חדר הניתוח. ערבוב מלא מושגת קטע 46 ס"מ של צינורות בין תאי ערבוב וניתוח. אורך זו חושבה בפעם להתעכב אופטימלי של ריאגנטים לערבב מבוסס על חוקי היסוד של המוני ותחבורה הסעה 21 במהלך זלוף בשיעור הזרימה משמש (1,000 s -1). גישה זו הוכיחה לשליטה לשחזור.

הפעלה של קרישה לתקשר לפעמים נתפסה כמוצר של פשוטדגימת דם כדי להימנע כאשר לפרש פעמי קרישה. לכן, הראינו כי, בהעדר מעכבי קרישה נגרם קשר מתחילה ב 16.7 דקות (± 3.7 דקות) של זלוף. בנוכחות CTI לעכב הפעלת מגע בתיווך FXIIa, קרישה ולא הוחל במהלך מוגדר באופן שרירותי של הניסוי (30 דק '). חלון של ניסויים זה ארוך מספיק כדי להבחין דגימות כי הם בעד או אנטי-תרומבוטי. למרות קרישה על ידי הפעלת קשר יכולה להיות תוצאה לא רצויה של דם למחלקת משטחים מלאכותיים, הנתונים שלנו ומוכיחות השפעה במינון ביולוגית ברורה של טסיות. זה יכול להיות חשוב עבור רפואת עירוי, כי ממצאים אחרונים על FXII, טסיות polyphosphates 10, הפצת phosphatidylserine 22, ו microparticles טסיות 23 יש המשוערך למעשה קרישת מסלול מגע בתור תורם חשוב המוסטאסיס, דוארבמיוחד בהקשר של פקק 24. למשל, התשואה המשתנה של עירויי טסיות בחולים או ביטוי phosphatidylserine משתנה של טסיות פקידה ניתן אפוא לגרום השתנות יעילות טיפולית אם מוצגת קרישה מוצלחת תלוי בגורמים אלה.

על ידי שיתוף משתק lipidated rhTF עם קולגן, תוואי הקרישה החיצוני, או מסלול TF, מופעל במהלך בתצהיר טסיות על קולגן. זה מרחיב את assay למצב המקיף ביותר שלה, כמודל פציעות המביאים דם במגע עם תאים TF נושאות ורקמות. הנתונים שלנו מראים כי שיתוף וקיבוע של קולגן TF מקטין את רגע הופעת קרישה אך אינו משנה את קצב קרישה. מן הראוי לציין כי כמות rhTF משותקת על פני השטח היא משתנה חשוב במודל זה 25, 26 ויש טופל בתוך מחקר נתון. ב presence של CTI, מסלול TF ניתן ללמוד באופן בלעדי (לא מוצג) כי הפעלת מגע נמנעת.

לסיכום, הגדרת הניסוי שלנו משלבת מודל של עירוי על ידי כינון מחדש של דם thrombocytopenic עם טסיות פקידה ודגם של המוסטאסיס ידי בתצהיר טסיות סידן תלוי היווצרות הפיברין תחת זרם הידרודינמית. assay זה ישמש כדי לענות על שאלות על טבע procoagulant של טסיות פקידה ואת הטכניקות הכנה להתרכז השפעות טסיות יש על זה.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי הקרן למחקר ופיתוח של שירות דם חוצת פלנדריה האדומה הבלגי. אנו מכירים תמיכה פיננסית הניתנת על ידי "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - קרן מחקר מיוחדת) מאונ' גנט שהוענקה הפרויקט עם BOF30290744 מספר החוזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD A00434
10 mL Syringe BD 309604
2 mL Syringe BD 307727
Alexa Fluor 405 Life Technologies A30100 The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Coagulation buffer in house preparation in house preparation 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15 mL Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 mL Greiner bio-one 227261
Corn trypsin inhibitor (CTI) Enzyme Research Laboratories CTI
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
DiOC6 Sigma-Aldrich 318426 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump Cellix EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer Sysmex pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Incubation water bath GFL 1013
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8
Pipette Brand A03429
Pipette tips 100-1000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Platelet concentrate orbital shaker Helmer PF-48i
Precision wipes Kimtech 5511
Pepsin solution  Hanna instrument HI7073L  2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin Dade Berhing B4212-40 rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vena8 syringe connector pin Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Coated biochip
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips Cellix VDY1-400-100-01-02 Mixing biochip
Vortex mixer VWR 58816-121
ZEN2012 software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13, (11), 1960-1967 (2015).
  2. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
  3. Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
  4. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
  5. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9, (11), 2322-2324 (2011).
  6. Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376, (3), 433-453 (1998).
  7. Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4, (5), 1160-1161 (2006).
  8. Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79, (2), 380-388 (1992).
  9. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122, (2), 429-436 (1982).
  10. Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139, (6), 1143-1156 (2009).
  11. Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, (4), 903-908 (2006).
  12. Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375, (1), 96-97 (2016).
  13. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8, (1), 221-224 (2013).
  14. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279, (5714), 636-638 (1979).
  15. Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81, (5), 1263-1276 (1993).
  16. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, (6), 665-673 (2009).
  17. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121, (10), 1875-1885 (2013).
  18. Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100, (6), 748-756 (2015).
  19. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21, (1), 27-40 (2000).
  20. Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8, (9), 1486-1495 (2008).
  21. Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50, (33), 7502-7519 (2011).
  22. Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. Blood. (2016).
  23. Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10, (7), 1355-1362 (2012).
  24. Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126, (11), 1379-1389 (2015).
  25. Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111, (7), 3507-3513 (2008).
  26. Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, (11), 2035-2041 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics