A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

Bioengineering
 

Summary

Cet article décrit un modèle expérimental d'hémostase qui permet de mesurer simultanément la fonction plaquettaire et de la coagulation. Plaquettaires et de la fluorescence de la fibrine est mesurée en temps réel et le taux de plaquettes d'adhérence, la vitesse de coagulation, et le début de la coagulation sont déterminés. Le modèle est utilisé pour déterminer les propriétés des plaquettes procoagulantes sous flux de concentrés pour la transfusion.

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Six, K. R., Devloo, R., Van Aelst, B., Vandekerckhove, P., Feys, H. B., Compernolle, V. A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time. J. Vis. Exp. (120), e55351, doi:10.3791/55351 (2017).

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Abstract

microfluidiques modèles de hémostatique évaluer la fonction plaquettaire dans des conditions de cisaillement hydrodynamique, mais en présence d'anticoagulants, cette analyse est limitée à un dépôt de plaquettes seulement. La relation complexe entre la fonction de coagulation et des plaquettes dépendant de Ca nécessite recalcification prudent et contrôlé de sang avant l'analyse. Notre configuration utilise un canal de mélange en forme de Y, qui fournit Ca 2+ / Mg 2+ tampon concentré à l' écoulement du sang juste avant la perfusion, permettant recalcification rapide sans échantillon stase. Une différence de dix fois de la vitesse d'écoulement entre les deux réservoirs minimise la dilution. Le sang recalcifié est ensuite perfusé dans une chambre d'analyse revêtu de collagène et de marquage différentiel permet une imagerie en temps réel à la fois des plaquettes et de la fibrine le dépôt en utilisant la fluorescence vidéo-microscopie. Le système utilise uniquement des outils disponibles dans le commerce, ce qui augmente les chances de normalisation. Reconstitution de throsang mbocytopenic avec les plaquettes de banked se concentre en outre des modèles transfusion de plaquettes, ce qui prouve son utilisation dans ce domaine de recherche. Des exemples de données ont démontré que la coagulation et le début du dépôt de fibrine étaient linéairement dépendante de la concentration des plaquettes, ce qui confirme la relation entre l'hémostase primaire et secondaire dans notre modèle. Dans un délai de 16 perfusion min, activation de contact n'a pas eu lieu, en dépit de recalcification Ca 2+ et normale niveaux Mg 2+. Lorsque le facteur de coagulation XIIa a été inhibée par l'inhibiteur de trypsine de maïs, ce laps de temps est encore plus longue, ce qui indique une plage dynamique importante dans laquelle les changements dans la nature procoagulante des plaquettes peuvent être évaluées. Co-immobilisation du facteur tissulaire au collagène a réduit significativement le temps d'apparition de la coagulation, mais pas son taux. La possibilité d'étudier le facteur tissulaire et / ou la voie de contact augmente la polyvalence et l'utilité du dosage.

Introduction

hémostase primaire et secondaire ont été initialement conceptualisé comme deux processus biochimiques relativement séparables. hémostase primaire a été considéré comme un contributeur majeur dans des conditions d'écoulement artériel, avec un rôle clé pour les plaquettes, tandis que l'hémostase secondaire a été vu pour dominer la coagulation dans le flux sanguin veineux, permettant la cascade de protéase pour former la fibrine insoluble. Les dernières décennies ont transformé cette vision traditionnelle sensiblement, en reconnaissant que l'activation plaquettaire et la coagulation sont interdépendants et sont des processus aussi importants pendant l'hémostase physiologique et pathologique dans tous les (non extrêmes) milieux hydrodynamiques. Ce point de vue a été traduit à la clinique, où des essais conçus pour mesurer globalement la coagulation du sang entier sont de plus en plus utilisés, mais avec beaucoup d'autres questions sur la pertinence, l' applicabilité et l' utilité 1.

Nous avons récemment publié une analyse fonctionnelle des plaquettesles concentrés en utilisant des chambres d'écoulement microfluidique revêtues de collagène fibrillaire dans un modèle in vitro de transfusion 2, avec des échantillons contenant des quantités normales de globules rouges, le plasma et les plaquettes. Cette méthode utilise l' héparine ou l' hirudine anticoagulant du sang, ce qui implique non ou participation limitée de l' hémostase secondaire, qui dépend de la génération de thrombine et le calcium ionisé (Ca 2+). Afin de soutenir la formation de thrombine et donc d'inclure tous les aspects de l' hémostase sous flux microfluidique, nous avons développé une méthode complémentaire sur la même plate - forme technique, y compris maintenant libre Ca 2+. De cette manière, le dépôt plaquettaire et la formation de fibrine peuvent être étudiés, encore une fois dans un modèle de transfusion de plaquettes, afin d'évaluer la qualité du concentré de plaquettes.

Dans ce procédé, les plaquettes et le fibrinogène sont marquées avec des fluorophores qui sont complètement séparés les spectres d'émission. Double couleur, vidéo en temps réel la microscopie permet alors l'analyse desl'adhésion primaire des plaquettes, ainsi que l'initiation et la coagulation du dépôt de fibrine. Une variable importante dans ce type de dosage est recalcification, parce que l'addition de Ca 2+ au sang statique, avant la perfusion, va inévitablement provoquer un contact initié par la coagulation dans le récipient. Cette initiation biaiser la lecture en raison de l'obstruction des tubes et des biopuces entrées avant perfusion. Par conséquent, dans notre procédé, le citrate anticoagulé de sang et d' un tampon contenant Ca2 + sont pompés séparément par les branches supérieures d'une chambre d'entrée en forme de Y. Les composants sont mélangés pendant la perfusion avant d'entrer dans une chambre d'analyse revêtue de collagène seul ou en combinaison avec un facteur tissulaire humain recombinant (rhTF). En adaptant les vitesses d'écoulement des pompes séparées , et la concentration de Ca 2+ dans la mémoire tampon, une dilution à 10% de l'échantillon de sang final a lieu.

En utilisant ce protocole étendu, nous démontrons la contribution de coagulafacteur de tion XII (FXII) et la concentration de plaquettes pour contacter la voie de coagulation initiation sous flux. Nos données montrent également que par revêtement rhTF le long du collagène, de la voie du facteur tissulaire peut être mesurée de façon concomitante.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices éthiques institutionnelles pour la recherche sur des échantillons humains, et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les bailleurs de fonds impliqués. Approbation pour les expériences décrites ici a été obtenu à partir de la commission d'examen institutionnel de l'Hôpital universitaire d'Anvers (numéro d'homologation 16/10/120).

REMARQUE: les indications de température sont toujours la température ambiante, sauf indication contraire.

1. Microfluidics Setup

  1. Préparer les canaux microfluidiques de la chambre d'écoulement, des tubes et des broches de connexion
    1. Resuspendre le collagène disponible flacon en mélangeant au vortex, puis diluer dans la solution de glucose isotonique fournie par le fabricant à une concentration finale de 50 pg / mL.
      REMARQUE: Utiliser tendon équin collagène, principalement composé de type fibrilles I. Le équin du collagène de type I est souvent désigné comme "Horm" collagène et est l'étalon-or pour ce type d'essai, à la fois historique etraisons biologiques. Humain du collagène de type III peut également être utilisé, mais ces fibrilles manteau moins bien, et la réponse plaquettaire ne soit pas aussi forte. D' autres surfaces de revêtement peuvent également être utilisés, tels que le facteur de Willebrand, le fibrinogène, la fibronectine, la laminine, la vitronectine, la thrombospondine-1, ou des combinaisons de ceux - 3.
    2. Prenez une nouvelle biopuce microfluidique jetable avec huit canaux, et les dimensions parallèles droites, en mm, de 0,4 W x 0,1 H x 20 L. Pipet 0,8 pi de collagène dans le canal (s) de la biopuce à une extrémité et étiqueter ce que la sortie. Il suffit de remplir 5/6 de la longueur du canal, de sorte que les fibrilles de collagène ne sont pas revêtues à l'entrée du canal, car cela peut entraîner le colmatage, ce qui fait obstacle à une perfusion efficace.
    3. Incuber la biopuce à 4 ° C pendant au moins 4 h dans un récipient scellé et humidifiée.
    4. Pour étudier le facteur tissulaire (extrinsèque) coagulation médiée en combinaison avec la voie de contact (intrinsèques), enduire les canaux avec collagen et le facteur tissulaire humain recombinant (rhTF).
      1. Diluer rhTF dans 10 mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) -buffered saline (HBS; 0,9% (p / v) de NaCl, pH 7,4, 1: 3000, la concentration en stock: 4,5 nM).
      2. Retirer la solution de collagène de revêtement par la sortie. Pipet 0,8 pi de rhTF dans HBS (dilution 1/500 de la concentration des stocks, concentration finale: 21 heures) dans la sortie du canal, le remplissage 5/6 de la longueur du canal, similaire à la stratégie de collagène revêtement.
      3. Incuber la biopuce pour encore 30 minutes dans un récipient scellé et humidifiée.
    5. Remplir les canaux revêtus avec un tampon de blocage (1,0% (p / v) de sérum-albumine bovine et 0,1% (p / v) de glucose dans du HBS), à partir de l'autre extrémité (appelée l'entrée). Remplir un nombre égal de canaux en forme de Y, avec le même tampon de blocage dans une biopuce de mélange.
      1. Assurez-vous que tous les canaux et bras de canal sont complètement remplis de tampon de blocage. Incuber les deux biopuces pendant au moins 1 h dans un récipient scellé et humidifiée.
    6. Pour chaque canal en cours d'utilisation, de préparer deux tubes de 8 cm de longueur, une longueur de 2 cm et une 46 cm de long. Placer une broche à une extrémité du tube plus petit et trois dans les deux extrémités du tube le plus long.
  2. Préparer la pompe de rinçage
    1. Rincez tous les fluidiques de la pompe et le tube relié à l'eau distillée.
    2. Dégraisser la coulée de la biopuce avec une précision essuyez la poussière et l'alcool dénaturé pour éliminer les traces et la poussière.
    3. Remplissez tous les tubes avec un tampon bloquant avant de les raccorder aux biopuces.
    4. Fixer la biopuce revêtue sur la platine du microscope automatisé. Fixer le biopuce mélange à la même hauteur que la platine du microscope à l'aide d'une prise laboratoire de ciseaux.
    5. Branchez la biopuce revêtue avec la biopuce de mélange en utilisant le plus long tube, 46 cm de long. Assurez-vous que les deux biopuces sont à une distance de telle sorte que le tube forme une ligne flexible, mais droite. Fixer une broche de connecteur de la seringue dans la tubulure luer compatible avec la pompe de rinçage. Le connecter à l'extrémité libre du tube de 2 cm et fixer l'autre extrémité à la sortie de la biopuce revêtue.
    6. Fixer les deux de 8 cm tube à l'entrée de biopuce de mélange en utilisant ses broches. Placez l'extrémité libre de chaque tube dans un flacon de HBS. Rincer tous les tuyaux et tous les canaux avec 1 mL HBS.
      REMARQUE: HBS circule à partir du flacon à travers le tuyau de 8 cm à la puce de mélange et à travers le tube de 46 cm à la puce revêtue (découlant de la non revêtue de la pièce revêtue) en raison de la force de traction de la pompe de rinçage. Cette étape supprime le tampon de blocage et de collagène mal adhéré (ou rhTF en biopuces double enrobage).
  3. Préparer les pompes de perfusion
    1. Ouvrez le logiciel pilote des pompes de perfusion. Initialisez les pompes en double-cliquant sur l'icône de seringues dans le logiciel.
    2. Sélectionnez le type de seringue qui sera utilisé: 1 seringues mL pour la coagulation buffer et 2 seringues mL pour le sang reconstitué.
  4. Connecter les seringues à la construction de biopuce
    1. Débrancher la pompe de rinçage et toutes les tubulures, à l'exception de celui qui relie les deux biopuces. La tubulure déconnectée est réutilisée dans les étapes suivantes.
    2. Connectez le 2 cm tube avec sa broche de connecteur de seringue à la serrure Luer d'un tuyau d'évacuation à paroi épaisse. Remplir le tube à paroi épaisse avec une solution de pepsine standard à l'aide d'une seringue.
      NOTE: L'addition de pepsine pour les tubes inhibe les déchets de post-lyse et la perfusion de la coagulation et empêche donc le colmatage du système à l'extrémité arrière.
    3. Fixez l'extrémité ouverte du tube à paroi épaisse avec une pince de Kocher. Placez un conteneur à déchets approprié avec l'eau de Javel en dessous pour recueillir l'écoulement.
    4. Fixer le tube avec son axe à la sortie de la biopuce revêtue.

2. Préparation des échantillons de sang

  1. Recueillir le sang d'un volontaire sain et séparer ses composants 4
    1. Recueillir le sang dans un vide acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) contenant. Utilisez cet exemple que pour effectuer une numération globulaire complète (CBC) en utilisant un analyseur d'hématologie automatisé.
    2. Recueillir le sang dans des contenants de citrate de sodium évacués. 5 ml de sang sont nécessaires pour chaque canal.
    3. Placer l'échantillon (s) sur une reconstitution du sang rotateur horizontal en attente.
      NOTE: Le test doit être terminé dans les 3 h de saignées. concentré de plaquettes et de sang total des échantillons sont le groupe sanguin ABO / Rh correspondait.
    4. Centrifugeuse pour 13 min à 250 xg pour préparer plasma riche en plaquettes (PRP). Ne pas utiliser le frein de la centrifugeuse pour éviter de perturber le culot légèrement tassées.
    5. Transférer le PRP à un tube de centrifugation conique frais. Centrifuger pendant 10 min à 4500 xg (avec frein) pour sédimenter les plaquettes et préparer plasma pauvre en plaquettes (PPP). Jeter le platculot elet. Incuber le PPP dans un bain d'eau à 37 ° C.
    6. Transférer les globules rouges concentrés dans un nouveau tube conique en perforant le fond de l'original avec une aiguille 21G.
      REMARQUE: le nombre de plaquettes résiduelles dans la fraction de globules rouges est de 11 ± 4 x 10 3 par ml (moyenne ± écart type, n = 10).
  2. reconstituer sang
    1. Déterminer le taux d'hématocrite des globules rouges concentrés préparés à l'étape 2.1.6 à l'aide d'un analyseur hématologique automatisé.
    2. Déterminer la concentration de plaquettes du concentré de plaquettes qui sera utilisée pour l'analyse à l'aide d'un analyseur hématologique automatisé.
    3. Calculer le volume de cellules tassées de globules rouges, un concentré de plaquettes et de PPP qui produira 40% d' hématocrite et 250 x 10 3 plaquettes / ul dans un volume final de 2,5 ml. Mélanger ces pour préparer le sang reconstitué et d'effectuer une CBC.
      NOTE: D'autres titres cibles de cellules peut être utilisé, selon le the question de recherche.
    4. Préparer un "blanc" échantillon de contrôle dans lequel le volume de concentré plaquettaire est remplacé par le même volume de solution saline pour déterminer la concentration de plaquettes «endogènes» (c. -à- plaquettes bancaires non-sang).
  3. Etiqueter le sang reconstitué pour les plaquettes et le fibrinogène
    1. Pipet 13 pi d'une solution de 10,7 mg / ml de fibrinogène Alexa Fluor 405 marqué (70 pg / ml concentration finale) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de sang reconstitué.
      NOTE: Le fibrinogène a été marquée à l'aide d'un kit disponible dans le commerce selon le manuel du fabricant.
    2. Mélanger encore 1 ml de sang reconstituées dans un tube à essai contenant 2 ul de 1 mM DIOC 6 (1 pM concentration finale) , ou contenant 2 pl de 5 mM de calcéine AM (5 uM de concentration finale). Ajouter à cela le tube contenant le sang avec du fibrinogène, ce qui donne un volume final de 2 ml de fibrinogène et platelet-sle sang contenait.
      NOTE: Le choix du colorant peut dépendre de la question de recherche ou la préférence du chercheur 5. Soyez conscient que l'excitation de tout colorant peut provoquer des artefacts photochimiques.
    3. Mélanger doucement en inversant. Incuber l'échantillon pendant 10 min à 37 ° C.
  4. Préparer le tampon de coagulation
    1. Préparer un tampon de coagulation contenant 10 mM de CaCl2 et 3,75 mM de MgCl2 dans du HBS. Préparer 1 ml de tampon de coagulation pour un seul canal.
    2. Filtre à stériliser le tampon de coagulation à travers un filtre de 0,2 um. Préchauffer ceci à 37 ° C.

3. Perfusion Assay

  1. Concentrer l'optique du microscope sur les fibres de collagène adhérant au fond du canal. Utilisez contraste de phase ou de contraste d'interférence différentiel (DIC). Sélectionnez "Set Z courant pour les régions de tuiles sélectionnées" dans le logiciel d'expérimentation pour corriger numériquement la mise au point sélectionnée.
  2. Définir une région d'intérêt (ROI) dans le canal sélectionné à l'aide du logiciel d'acquisition du microscope.
    NOTE: Le ROI peut être toute surface choisie arbitrairement dans un canal de perfusion. Il est conseillé de ne pas analyser la formation de thrombus et de la génération de fibrine à proximité de l'entrée et de sortie afin d'éviter l'acquisition d'images de thrombus inégalement répartie. La surface spécifique du ROI doit contenir un nombre important de thrombus pour permettre le nivellement de la variabilité d'un signal par les plaquettes individuelles. La localisation de la ROI dans le plan xy du canal est toujours fixe et déterminée avant la perfusion. Si nécessaire, la partie non revêtue du canal peut être inclus dans l'analyse afin de déterminer si les plaquettes se lient de façon non spécifique à la matière plastique de la biopuce.
  3. Préparer des échantillons pour perfusion
    1. Monter une seringue de 1 ml contenant 1 ml de tampon de coagulation préchauffée dans la pompe de perfusion.
    2. Mélanger le sang préchauffé reconstitué en retournant doucement et la charge 2 mL dans une seringue de 2 ml.
    3. Assurez-vous que tout l'air est retiré des deux seringues et connecter chacune à un tube de 8 cm en utilisant une broche de connecteur de seringue.
    4. Prime les connecteurs et les tubes des deux seringues à grande vitesse (400 pi / min) et arrêter quand tout est rempli avec un tampon de coagulation ou de sang.
      REMARQUE: par l'amorçage de la tubulure, le tampon de coagulation du sang reconstitué et seront immédiatement mélangés dans le canal en forme de Y sur la biopuce de mélange lors du démarrage de l'expérience, ce qui évite l'introduction d'air dans les chambres de perfusion.
  4. En utilisant des broches, fixer l'autre extrémité des deux tubes fendus sur les jambes du canal en forme de Y dans la biopuce de mélange. Le bas de la jambe est utilisée pour perfuser tampon de coagulation et la jambe supérieure pour le sang reconstitué.
  5. Commencez l'expérience en lançant une perfusion de 4,4 ul / min pour le tampon de coagulation et 44 ul / min pour le sang reconstitué. Retirer la pince de Kocher à la sortie du tuyau d'évacuation pour permettre perfusion.
    NOTE: Le débit peut être modifié en fonction de la question de recherche. Lancer un chronomètre pour déterminer le temps entre le début de l'expérience et le début de l'acquisition d'images en temps réel.
  6. Enregistrement des images toutes les 10 s pendant 30 min en temps réel en utilisant le logiciel d'acquisition et de l'expérience du microscope. Commencer l'enregistrement lorsque le mélange de sang reconstitué et le tampon de coagulation entre la biopuce revêtue monté sur la platine du microscope.
    NOTE: D'autres séries de temps peut être utilisé en fonction de la configuration expérimentale. Utilisez un grossissement 100X (objectif 10X et 10X lentilles).

4. Finalisation Experiment

  1. Termine les pompes et l'acquisition d'image après 30 min ou plus tôt, si le signal est saturé. Détachez tous les tubes et les seringues et les jeter comme des déchets infectieux.

Analyse 5. Données

  1. Déterminer la croissance du thrombus (fluorescence verte) et la formation de fibrine (violette fluorescence) la cinétique avec le logiciel d'analyse d'images. Les commandes suivantes sont spécifiques pour le logiciel utilisé ici:
    1. Ouvrez le traitement du plugin: couture pour assembler les images côte à côte par point de temps.
    2. Ouvrez l'analyse plugin image pour déterminer la couverture de surface des plaquettes.
    3. Ouvrez la mesure du plugin. Définir le retour sur investissement en traçant une zone de rectangle, y compris toutes les fibres de thrombus et de fibrine; dans ce protocole, le retour sur investissement est un rectangle mesurant 637 mm 2.
      Sélectionnez l'onglet Toutes les vues à inclure tous les temps enregistrés.
    4. Utilisez Créer des tables pour générer automatiquement une feuille de calcul qui contiendra la valeur moyenne de la région de rectangle sélectionné de chaque point de temps de l' intensité de fluorescence.
    5. Enregistrer les feuilles de calcul au format xml.
  2. Ouvrez une feuille de calcul dans un programme de feuille de calcul pour d' autres calculs.
    1. Soustraire la première (backgroue) la valeur de toutes les données.
    2. Tracer le signal fluorescent en fonction du temps de perfusion tant pour le vert (plaquettes) et le violet (fibrine) des colorants.
      NOTE: Prendre en compte le temps entre la pompe initialisation et le point de départ réel de l'acquisition d'images. La formation de thrombus est généralement un processus en deux étapes dans ce modèle: (1) "ralentir" l' adhésion des plaquettes (c. -à- adhérence) au collagène immobilisé suivie (2) la croissance du thrombus entraîné la coagulation avec une augmentation "rapide" à la fois la liaison plaquettaire ( c. -à- accumulation) et le dépôt de fibrine ( par exemple, la coagulation) (figure 1).
    3. Calculer la pente de l'adhésion des plaquettes et de l'accumulation par régression linéaire; cette pente donne une cinétique de croissance de thrombus plaquettaires dans chaque phase de sa formation.
    4. Calculer la pente de la fibrine coagulation et extrapoler cette ligne pour intercepter l'axe X, pour déterminer l'instant d'apparition.

Representative Results

L'analyse en temps réel des données brutes est décrite sur la figure 1. Tout d' abord, les plaquettes adhèrent à la surface réactive, ce qui entraîne une augmentation constante de la fluorescence verte enregistrée (Figure 1A, i), appelé adhérence. Pendant cette phase, il y a peu de fluorescence violette, ce qui indique que la fibrine est pas ou que de façon marginale formée (figure 1B). Dès l' ouverture de la coagulation, violet-fluorescence rapide des dépôts de fibrine (iii), et pendant ce temps, la fluorescence verte des plaquettes augmente à peu près au même taux, désigné ici comme l' accumulation de plaquettes (ii). Une expérience unique revient donc trois taux d'augmentation de fluorescence (i, ii, iii) comme marqueur de substitution pour la vitesse à laquelle des plaquettes et la fibrine dépôt a lieu dans ce modèle. Par ailleurs, un moment de début de la coagulation (moment d'apparition (iv)) est extrapolée, qui est un déterminant de la plaquettepotentiel procoagulant.

En l'absence de TF, la coagulation initiation est lente et traverse la voie de contact où le complexe tenase intrinsèque active FX via l' activation directe de FIX 6 par FXI et / ou FXII principalement. Pour démontrer la dépendance FXII, 4 uM d'inhibiteur de trypsine de maïs (CTI) ont été ajoutés pour inhiber FXII activé (FXIIa) 7. Cette inhibition n'a pas affecté l' adhésion plaquettaire (figure 2A), mais la coagulation n'a pas commencé pour la durée totale définie arbitrairement de l'expérience de perfusion (figure 2B et complémentaire vidéo 1).

In vitro, la voie de contact peut être initiée par des matières étrangères comme le verre, ou dans des essais cliniques en utilisant un matériau minéral comme le kaolin. In vivo, les plaquettes activées fournissent la charge négative 8 </ sup> à travers l'exposition de la membrane des phospholipides acides 9, comme la phosphatidylsérine, et / ou par le biais de la libération de polyphosphates (polype) 10, 11. Nos microfluidiques mimétiques d'analyse en temps réel parce que ce dernier, dans une gamme de concentrations de plaquettes, la réaction hémostatique dépendait du nombre de plaquettes (figure 3). En augmentant le nombre de plaquettes dans l'échantillon de lait reconstitué, le taux d'adhérence (figure 3A), l' accumulation (figure 3B, vert), et de la coagulation (figure 3B, violet) a augmenté de façon linéaire. Le moment d'apparition réduite de manière significative (figure 3C) en augmentant la concentration de plaquettes, ce qui suggère qu'un nombre de seuil (activé) déposé plaquettes est nécessaire pour déclencher la coagulation.

Lors de lésions des tissus in vivo, cependant, les cellules TF portant sera initiate la coagulation du sang via le FVIIa-FT extrinsèque complexe tenase en présence de Ca 2+. Ceci est imité dans notre dispositif expérimental par post-revêtement des perfusion chambres contenant du collagène avec lipidée rhTF. Dans une analyse paire de canaux revêtus de collagène seul ou en combinaison avec rhTF, la coagulation apparition était significativement plus rapide (figure 4A). Le taux d'adhérence des plaquettes n'a pas été linéaire, donc pas de régression linéaire pourrait être réalisée (données non présentées). À la fois le taux de coagulation et de l' accumulation des plaquettes ne sont pas différents entre les conditions (figure 4B-4C, la vidéo supplémentaire 2).

Figure 1
Figure 1: Analyse de régression de l' adhésion des plaquettes et de la coagulation dans des chambres de perfusion microfluidiques. Ce chiffre clarifie les paramètres dérivés en temps réel des données brutes de fluorescence acquise au cours de recalcifié flux sanguin sur une surface réactive. (A) Intensité moyenne de fluorescence verte indique le dépôt de plaquettes en fonction du temps de perfusion. La courbe décrit un procédé bimodal en commençant par (i) en augmentant progressivement l' adhésion des plaquettes linéaire suivie d' une accumulation linéaire (ii) de plus en plus rapidement. Les deux parties linéaires de la courbe sont régression et la pente de ceux-ci décrit les deux taux de formation d'un thrombus plaquettaire par fluorescence; (I) l'adhérence et (ii) d'accumulation. (B) l' intensité moyenne de la fluorescence violette montre le dépôt de fibrine en fonction du temps. Pendant l'adhésion des plaquettes, la fluorescence violette est essentiellement absent, alors qu'il se développe rapidement l'initiation suivante de la coagulation. Le (iv) l' apparition de moment d'est défini comme étant l'intersection avec l'axe x de la régression linéaire extrapolée (iii) la seconde phase de formation d' un thrombus par la fibrine fluorescence désignée ici comme la coagulation.ef = cible "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: En l'absence de TF, la coagulation dans des chambres d'écoulement de perfusion revêtu de collagène dépend FXIIa. Perfusion microfluidique de sang reconstitué contenant CTI ou un tampon de commande (CONTROL) a été réalisée à un taux de cisaillement de 1000 s -1 pour un total de 30 min. (A) Le taux de l' adhésion des plaquettes (s -1) ne dépend pas de CTI. (B) Le moment d'apparition des échantillons CTI-traités était au - delà de la limite de 30 min de l'expérience (présentée comme une ligne en pointillés), ce qui démontre la dépendance FXIIa de ce paramètre. Bars et des points sont des valeurs moyennes, moustaches sont l'écart type. L'analyse statistique a été par le test t apparié. (NS = non significatif, n ≥3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: Coagulation sous flux dépend du nombre de plaquettes. Expériences de perfusion microfluidique ont été effectuées dans des chambres revêtues de collagène reconstitué avec du sang en présence de Ca 2+ et des concentrations variables de plaquettes (n ≥3). (A) Taux d'adhésion des plaquettes (B) taux d'accumulation des plaquettes (vert) et la coagulation (violet), et (C) moment d'apparition sont présentées en fonction de la concentration de plaquettes dans le sang reconstitué. Les points sont des valeurs moyennes, les moustaches sont les écarts-types. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand versisur ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Activation des deux TF et la voie de contact coagulation raccourcit de façon significative le moment d'apparition de la coagulation. Reconstituer le sang, en présence de Ca 2+, a été perfusée à travers des chambres revêtues de collagène seul ou avec du collagène et rhTF pour étudier la voie de contact , seul ou une combinaison des voies de contact et Tf. (A) le moment d'apparition de la coagulation est réduite de façon significative dans les chambres d'écoulement contenant TF. (B) Le taux d'accumulation des plaquettes pendant la coagulation et (C) le taux de coagulation ne sont pas significativement différents entre le collagène seulement ou chambres d'écoulement Collagène et rhTF revêtus. Bars et des points sont des valeurs moyennes; moustaches sont les écarts-types. L'analyse statistique a été par le test t apparié. (NS = non significatif, * P < 0,05, n ≥3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1
Vidéo supplémentaire 1: En l'absence de TF, la coagulation dans des chambres d'écoulement de perfusion revêtu de collagène dépend FXIIa. Le rôle de la voie de contact est déterminée en chambres d'écoulement de perfusion revêtu de collagène. (A) une séquence d'images de fluorescence Overlaid des plaquettes (vert) et de la fibrine ( du fibrinogène) (violet) le dépôt en l'absence de CTI. (B) même séquence que le panneau A , mais avec le canal vert éteint. (C) Overlaid séquence d'images de fluorescence des plaquettes (vert) et de la fibrine ( du fibrinogène) (violet) le dépôt en présence de CTI. (D) Même séquence que le panneau C , mais avec le canal vert éteint.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2
Complémentaire vidéo 2: Activation des deux TF et la voie de contact raccourcit significativement la coagulation moment d'apparition. Pour étudier le rôle du TF, des chambres d'écoulement revêtues de collagène seul ou avec du collagène et rhTF ont été utilisés. (A) une séquence d'images de fluorescence Overlaid des plaquettes (vert) et de la fibrine ( du fibrinogène) (violet) le dépôt dans les chambres d'écoulement revêtues uniquement avec le collagène. (B) même séquence que le panneau A , mais avec le canal vert éteint. (C) Overlaid séquence d'images de fluorescence des plaquettes (vert) et de la fibrine ( du fibrinogène) (violet) le dépôt dans les chambres d'écoulement revêtues de collagène et rhTF. (D) Même séquence que le panneau C , mais avec le canal switc verthed off. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

La transfusion de concentrés plaquettaires est prescrit pour le patient thrombocytopénique pour prévenir ou arrêter le saignement. Son impact clinique a récemment été mis en évidence dans un examen historique de la leucémie aiguë 12, rappelant que l' augmentation des taux de patients pédiatriques dans les années soixante et soixante - dix survie étaient en grande partie attribuable à l' amélioration de la (plaquettes) de la médecine transfusionnelle. Les concentrés plaquettaires sont également utilisés pour enrayer un saignement dans un traumatisme aigu ou pendant la chirurgie. Dans ces conditions, les plaquettes avec d'excellentes propriétés coagulantes qui déclenchent rapidement hémostase sont préférés, mais concentrés plaquettaires sont préparés à partir de dons de donneurs volontaires et, contrairement à un médicament pharmacologique, sont normalisés par la préparation, et non par (chimique) composition. Par conséquent, plusieurs questions dans le domaine de la banque de sang sont sans réponse, y compris celles concernant les modalités optimales de dons, les conditions de stockage, et les pratiques de transfusion. Dans le domaine de la platelet (transfusion) biologie, de nombreuses questions sur la clairance des cellules de la circulation, la contribution des plaquettes transfusées à l'hémostase, l'immunologie ou leur restent également sans réponse.

Techniques de laboratoire nombreuses pour l' analyse de la fonction plaquettaire sont disponibles, mais ceux - ci portent la plupart du temps un aspect singulier de la fonction plaquettaire, comme l' agrégation ou la dégranulation 13. Pour évaluer globalement les plaquettes et les concentrés de plaquettes, des modèles globaux de l'hémostase sont indispensables, et ceux-ci doivent inclure hydrodynamisme. La rhéologie du sang est essentielle pour interpréter correctement le comportement des plaquettes au cours de l' hémostase 14, 15 ou 16 thrombose, même si un traitement anticoagulant empêche Ca2 + et / ou de la thrombine pour participer à la présence d' un citrate ou héparine, respectivement 2. Pour étudier l'interaction entre la coagulation et la fonction plaquettaire sous flux 1718, la génération de thrombine normale est requise, et par conséquent libre de Ca2 + aussi bien. Le dispositif expérimental pour l'étude de l'hémostase dans ces conditions est complexe, car les mesures de prévention «artefact» ou l'activation incontrôlée de la coagulation doivent être prises, autant que possible. En outre, de nombreux groupes de recherche spécialisés utilisent du matériel 19, 20, ce qui provoque importante variabilité inter-laboratoire sur -mesure 5. Limitations typiques de cette approche sont l'utilisation de navires rectangulaires, des profils d'écoulement non pulsatiles et revêtements de surface non humains 5. Le test que nous décrivons ici utilise des outils disponibles dans le commerce et peut donc être adapté à la normalisation.

Comme la réaction de coagulation en cascade est facilement activé une fois que le sang ne se trouve pas dans le corps humain, recalcification contrôlée est une étape essentielle. To atteindre cet objectif, l' addition de Ca 2+ doit être reportée à juste avant la perfusion sur la surface de collagène réactive, parce que quand le tampon 2+ Ca est fourni en vrac au sang statique, la coagulation prend inévitablement lieu, éventuellement obstruer la tubulure et de sollicitation de données interprétation (données non présentées). La solution à ce problème consiste à pomper le tampon de Ca 2+ et le sang séparément, ce qui permet de mélanger des forces convectifs et diffusifs pendant la perfusion sur son chemin vers la chambre d'analyse. Le mélange complet est réalisé dans un segment de 46 cm de tube entre les chambres de mélange et d'analyse. Cette longueur a été calculée pour le temps de séjour optimal des réactifs à mélange à base sur les lois fondamentales de la masse et de transport convectif 21 au cours de la perfusion au débit utilisé (1.000 s -1). Cette approche a été contrôlable et reproductible.

Contacter l'activation de la coagulation est parfois considérée comme un artefact d'une simplele prélèvement de sang et à éviter lors de l'interprétation des temps de coagulation. Par conséquent, nous avons démontré que, en l'absence d'inhibiteurs, la coagulation induite par contact, à partir de 16,7 min (± 3,7 min) de la perfusion. En présence de CTI pour inhiber l'activation de contact FXIIa médiation, la coagulation ne sont pas initié au cours défini arbitrairement de l'expérience (30 min). Cette fenêtre d'expérimentation est suffisamment longue pour distinguer des échantillons qui sont pro- ou anti-thrombotique. Même si la coagulation par activation de contact peut être une conséquence indésirable de contact avec le sang des surfaces artificielles, nos données montrent un effet de dose biologique claire des plaquettes. Cela peut être important pour la médecine transfusionnelle, car les découvertes récentes sur FXII, plaquettes polyphosphates 10, la distribution de phosphatidylsérine 22, et des microparticules de plaquettes 23 ont effectivement réévalué le contact voie coagulation comme un facteur important de l' hémostase, espécialement dans le contexte de la thrombose 24. Par exemple, le rendement variable de transfusions de plaquettes chez les patients ou l'expression de la phosphatidylsérine variable de plaquettes mis en réserve peuvent donc induire une variabilité de l'efficacité thérapeutique, si la coagulation est montré avec succès à dépendre de ces facteurs.

Par co-immobilisant lipidée rhTF avec du collagène, de la voie extrinsèque de la coagulation, ou une voie de TF, est activé au cours du dépôt des plaquettes sur le collagène. Ceci étend le test dans son mode le plus complet, en tant que modèle pour des blessures qui amènent le sang en contact avec les cellules et les tissus TF porteurs. Nos données montrent que la co-immobilisation du collagène et TF diminue le moment de la coagulation apparition, mais ne modifie pas le taux de coagulation. Il faut noter que la quantité de rhTF immobilisée à la surface est une variable importante dans ce modèle , 25, 26 et devrait être normalisée dans une étude donnée. Dans la présence de CTI, la voie TF peut être étudiée uniquement (non représentée) car l'activation du contact est empêchée.

En conclusion, notre dispositif expérimental combine un modèle de transfusion de sang par reconstitution avec les plaquettes thrombocytopénique mis en réserve et d'un modèle de l'hémostase par le dépôt de plaquettes dépendante du calcium et la formation de fibrine sous un flux hydrodynamique. Ce test sera utilisé pour répondre à des questions sur la nature procoagulante des plaquettes en banque et les techniques de préparation de concentré de plaquettes effets ont sur ce point.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par la Fondation pour la recherche et le développement du Service belge Blood Red Cross-Flandre. Nous reconnaissons l'appui financier fourni par "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - Fonds spécial de recherche) de l'Université de Gand accordée au projet avec le numéro de contrat BOF30290744.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD A00434
10 mL Syringe BD 309604
2 mL Syringe BD 307727
Alexa Fluor 405 Life Technologies A30100 The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse Becton, Dickinson and Company 368650 Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA  Becton, Dickinson and Company 368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate Becton, Dickinson and Company 366575
Blocking buffer in house preparation in house preparation 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM Molecular probes C1430
Coagulation buffer in house preparation in house preparation 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15 mL Greiner bio-one 1888271
Conical tube 50 mL Greiner bio-one 227261
Corn trypsin inhibitor (CTI) Enzyme Research Laboratories CTI
Denaturated alcohol Fiers T0011.5
DiOC6 Sigma-Aldrich 318426 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump Cellix EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen Sigma-Aldrich F3879 Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer Sysmex pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS) in house preparation in house preparation 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4
Horm Collagen Takeda/Nycomed 1130630 Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box Cellix HUMID-BOX
Incubation water bath GFL 1013
Microscope Zeiss Axio Observer Z1 equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump Cellix 188-MIRUS-PUMP-EVO with Multiflow8
Pipette Brand A03429
Pipette tips 100-1000 Greiner bio-one 740290
Pipette tips 1-10 Eppendorf A08928
Pipette tips 2-200 Greiner bio-one 739280
Platelet concentrate orbital shaker Helmer PF-48i
Precision wipes Kimtech 5511
Pepsin solution  Hanna instrument HI7073L  2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin Dade Berhing B4212-40 rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope  Zeiss N/A ZEN 2012
Sterile docking device Terumo BCT TSCD
Table Top Centrifuge Eppendorf 521-0095
Tube Roller Ratek BTR5-12V
Tubing Sealer Terumo BCT AC-155
Vena8 syringe connector pin Cellix CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips Cellix 188V8CF-400-100-02P10 Coated biochip
Vena8 Needles Cellix SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing Cellix TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips Cellix VDY1-400-100-01-02 Mixing biochip
Vortex mixer VWR 58816-121
ZEN2012 software Zeiss

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References

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