ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Developmental Biology
 

Summary

ここで紹介する方法は、多能性幹細胞からのヒト肝細胞様細胞を生成するための拡張性と優れた製造基準(GMP)-Readyビデオ分化システムを記載しています。これは、基礎および応用ヒト肝臓研究のためのヒト肝細胞様細胞を生成するために、費用対効果の高い標準化されたシステムとして機能します。

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Wang, Y., Alhaque, S., Cameron, K., Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Hay, D. C. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (121), e55355, doi:10.3791/55355 (2017).

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Abstract

ヒト多能性幹細胞(hPSCs)は、生物医学研究のために大きな価値を有しています。 hPSCsは、スケーリングされ、人体で見つかったすべての細胞型に分化させることができます。ヒト肝細胞様細胞(HLCS)にhPSCsの分化は、広く研究されており、効率的な分化プロトコルが確立されています。細胞外マトリックス、成長因子、サイトカイン、および小分子を含む生物学的刺激の組合せにより、初代ヒト肝細胞に似HLCSを生成するようになされています。しかし、手順の大部分は、まだバッチ間変動を生じる、未定義の成分を利用します。これは、技術の応用に大きな障壁となっています。この問題に取り組むために、我々は、無血清分化プロセスと組み合わせて、細胞外マトリックスのようなヒト組み換えラミニンを使用して、肝細胞分化に定義されたシステムを開発しました。高効率な肝細胞の仕様では、デで、達成されましたHLC機能と表現型の両方の改善をmonstrated。重要なことは、このシステムは、研究を使用してスケールアップすることが容易であり、GMPグレードHPSCラインは、細胞ベースのモデリングと治療法の進歩を約束します。

Introduction

初代ヒト組織および誘導体の細胞型は、定期的に、細胞ベースのスクリーニングのため、および診療所の両方で使用されています。しかし、これらの細胞へのアクセスは厳しく不足による臓器提供およびポスト分離1細胞表現型の損失に限定されています。 hPSCsは、一次組織に有望な代替を表し、遺伝的に定義されており、再生可能なヒト体細胞の生成を促進します。 hPSCs由来肝細胞様細胞(HLCS)はすでにこの分野で有望であることを示しています。 HLCSは、薬物およびウイルス2、3、4、5、6、7、8の細胞形態、肝細胞の遺伝子発現、代謝機能、感度などの様々な局面において、一次ヒト肝細胞を、似ています。また、無制限の増殖および両方の研究テーマの自己再生能力およびGMPグレードのhPSCsは、アプリケーション9,10容易にします

研究の十年にわたって効率的な肝細胞の分化手順2、3、5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20の数を生産しています。しかしながら、これらのシステムのほとんどは、肝細胞の仕様を駆動するために、未定義の成分および/またはウイルス形質導入を使用します。スケールでの技術の信頼性を向上させるためには、強固な肝細胞の分化を開発することが重要です本当に、定義された異種非含有、およびGMP互換されているシステム。

ラミニン(LNS)は、細胞接着、増殖、遊走、及び分化に影響を与えることができる重要な細胞外マトリックスタンパク質です。ラミニンは1α、1β、および1つのγ鎖からなるヘテロ三糖タンパク質です。最近、組み換えヒトラミニンを作製し、細胞生物学で使用されてきました。 LN-521及びEカドヘリンの混合物は、クローン誘導およびヒト胚性幹細胞22の拡張を可能にしながら、LN-511は、hPSCs 21のメンテナンスを支援することが示されています。 LN-111は、他の一方で、hPSCs 23由来肝芽細胞様細胞の維持をサポートしています。しかし、私たちのレポートの前に、521と111はhPSCs 10からの成熟特性とHLCSを生成するために利用されていなかったラミニン。

ここでは、LN-521にhPSCsを培養するための我々の詳細手順およびLN-521またはLN-521およびLN-111(LN-521 / LN-111)のブレンドのいずれかにそれらを区別する。私たちは多くのフォーマット14でHLCSの高い再現性、均一な単層を生成するために、単一細胞播種を使用して、分化プロトコルを最適化しました。私たちは、定義された分化システムは、フィールド内の重要な前進を表す、アプリケーションのアクティブHLCSを製造するための簡単かつ費用対効果の高い方法を表していることを信じています。

Protocol

注:このプロトコルで使用される全ての試薬用にベンダー情報は、表1に列挙されています。細胞は、それらとの直接接触を持つようにしている場合、すべてのメディア/プレートは無菌であり、少なくとも室温であるべきです。

1.継代ヒト多能性幹細胞(hPSCs)ラミニン521へ

注:以下に記載する細胞継代手順は、単一の細胞に基づくとhPSCsから肝細胞様細胞の均一な集団の誘導のための理想的です。コロニーめっきも適用可能であり、以前に24に記載されています。

  1. 必要に応じて、ラミニンコーティングしたプレートを準備します。
    1. 4°Cで組換えラミニン521(LN-521)の100μg/ mLのストックを解凍します。
    2. 氷冷1×DPBS中で解凍LN-521を希釈(のCa 2+ / Mgが2+)を5μg/ mL溶液を作製しました。
    3. 6ウェルプレートのコート1ウェルに/ mLのLN-521の溶液を5μgの1 mLを加えそしてウェル中に均等にそれを広めるために岩。
    4. 緊急の使用のための、または一晩4℃の冷蔵庫で4時間- 2、37℃/ 5%CO 2細胞培養インキュベーター中で培養します。
    5. 必要に応じて、4℃の冷蔵庫にラミニンコートプレートを保管してください。平らな面にプレートを維持し、蒸発や汚染を避けるためにそれらを封印。
      注:被覆ウェルを乾燥させないでください。必要に応じて、余分な1×DPBS(のCa 2+ / Mgの2+)とそれらをトップアップ。 2週間以内にプレートを使用してください。
  2. 1時間 - プレコーティングしたプレートの必要な数は、使用前に室温に到達または0.5、37℃でプレートをインキュベートすることを許可します。
  3. 慎重にコーティングされた表面に損傷を与えることなくコーティングLN-521の溶液を吸引します。注:その上に細胞を播種する前に、コーティングされた表面を傷つけないように重要です。
  4. すぐに10μMのRho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y2を補っ予め温め-mTeSR1培地の1 mLを加え6ウェルプレートの1ウェルに7632。セルを受信するために、細胞培養インキュベーター中でプレートを残します。
    注:ラミニン被覆ウェルを乾燥させないでください。
  5. 約75%〜85%の集密度で手入れの行き届いたhPSCsから培地を吸引除去します。室温1X DPBS 1mLの(なしのCa 2+ / Mgの2+)で1回6ウェルプレートの1つのウェルから細胞を洗浄します。
  6. 細胞への1xのAccutaseの0.5 mLを加え6、37℃でインキュベート - 細胞を解離するために8分。
    注:、消化が十分な長さであるかどうかを確認やさしくプレートをタップして、細胞が簡単に取り外すことができるかどうかを確認するには。 yesの場合は、酵素反応を停止する時間です。 2分 - いない場合は、余分な1のための消化を拡張します。
  7. 細胞に10μMのY27632を補った新鮮なmTeSR1培地2mLのを追加することによって解離を終了します。ピペットアップおよび単一細胞懸濁液を作製するためにP1000チップを数回使用してダウン。
  8. 血球計数器を使用して生細胞を数えます。死細胞14を染色し、排除するためにトリパンブルーを使用して、
  9. 必要な細胞の総数を計算します。ルーチンHPSCの継代のために、6ウェルプレートのウェルあたり4×10 5×10 5個の細胞を播種する( すなわち、4.21×10 4、1cm 2当たり5.26×10 4)。肝細胞分化にhPSCsを継代するために、6ウェルプレートのウェルあたり6.5×10 5〜7.5×10 5( すなわち、1cm 2当たり7.89×10 4から6.84×10 4)細胞を播種します。
    注:各細胞株についての播種密度は、肝臓の分化のためにここに与えられた経験的な密度に基づいてマイナーな最適化が必要になる場合があります。
  10. 室温で3分間115×gで滅菌15ミリリットルまたは50-mL遠心チューブと遠心分離機に必要な細胞懸濁液を転送します。
  11. ゆっくり上清を吸引除去した後、10μMのRho関連キナーゼ(ROCK)inhibitoを補った新鮮な、温かいmTeSR1培地中で細胞ペレットを再懸濁R Y27632、所望の細胞密度を作るために適切な培地を用いて。
    注:ROCK阻害剤の使用は、高度に細胞の付着および生存率を高めるために推奨されます。
  12. 準備されたプレートに細胞を播種すると細胞を均一に分配するために前後左右にそれらを揺すります。
    注:細胞がプレートは、ルーチンの細胞培養または肝細胞の分化実験のためであるかどうかのウェルに均等に分配されることを保証することが重要です。
  13. 細胞インキュベーターでプレートを置き、それらを添付して回復できるようにするために24時間、37℃/ 5%CO 2で細胞を維持します。
  14. 翌日、細胞を検査し、細胞 - 細胞接触が確立されている場合にはROCK阻害剤を引き出します。ルーチン培養にmTeSR1培地中で細胞を維持するか、必要に応じて分化培地に切り替えます。
    注:細胞が挙げ密度で接種した場合、密集度は、定期的なメンテナンスや肝細胞のための理想的であるべきdifferentiation個。

2.組換えラミニン上の肝細胞様細胞にhPSCsを区別

  1. 分化培地を準備します。
    1. 人間のアクチビンAの原液を作成します。人間のアクチビンを無菌の0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)/ DPBS中100μg/ mLのストック溶液を作るために粉末を溶かします。少量のアリコートを作成し、-20℃で保管してください。 1で使用してください:1,000。
    2. マウスのWnt 3aの原液を作る:滅菌0.2%BSA / DPBS中10μg/ mLのストック溶液を作るために、マウスのWnt 3aの粉末を溶解します。少量のアリコートを作成し、-20℃で保管してください。 200:1で使用してください。
    3. ヒト肝細胞増殖因子(HGF)のストック溶液を作る:無菌の0.2%BSA / DPBS中の10μg/ mLのストック溶液を作製するために、ヒトHGFの粉末を溶解します。少量のアリコートを作成し、-20℃で保管してください。 1で使用してください:1,000。
    4. オンコスタチンM(OSM)原液を作る:滅菌0.2%BSA / DPBS中に20μg/ mLのストック溶液を作るためにオンコスタチンM(OSM)粉末を溶解します。小分けとsを作ります-20℃でそれらを引き裂きました。 1で使用してください:1,000。
    5. 内胚葉プライミングストック培地500mlを作る:2%のB27サプリメント(50X、 マイナスビタミンA)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ100 IU / mLおよび100μg/ mLの時の最終濃度)。ロズウェルパーク記念研究所1640(1640 RPMI)基礎培地を使用して500 mLにトップアップ。注:4°Cでの在庫を保管し、2週間以内に使用します。アリコートストックからの培地および各培地交換で(それぞれ100 ngの/ mLおよび50 ngの/ mLの最終濃度)新鮮なアクチビンAおよびWnt 3aに追加します。
    6. KSR / DMSO分化培地500mlを作る:80%ノックアウトDMEM(KO-DMEM)、20%ノックアウト血清代替物(KSR)、0.5%グルタ、1%非必須アミノ酸(NEAA)、0.1 mMのβ-メルカプトエタノール、 1%のDMSO、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU / mLおよび100μg/ mLの、それぞれの最終濃度)。真空下でフィルタします。 4℃で保存し、2週間以内に使用します。
    7. 1%のGI:HepatoZYMEの成熟培地の500ミリリットルを作りますutaMAX、10μMのヒドロコルチゾン21-ヘミスクシネートナトリウム塩(HCC)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ100 IU / mLおよび100μg/ mLの最終濃度で)。トップアップHepatoZYME基礎培地を用いて、500 mLです。注:4°Cでの在庫を保管し、2週間以内に使用します。アリコートストックからの培地および各培地交換のための(10ng / mLのおよび20 ng / mLで、それぞれに最終濃度)新鮮なHGFおよびOSMを追加します。
  2. LN-521の肝細胞分化のためのシードhPSCs、項1に記載のようにLN-521 / LN-111を基板として使用する場合、コートLN-521およびLN-111とプレート(1:3比)で5μg/ mlの最終ラミニン濃度;残りの処理は、純粋なLN-521コートプレートと同じである必要があります。
    注:LN-521 / LN-111はhPSCsのルーチン培養のための理想的ではありません。それは、分化実験のために使用されます。
  3. 播種後の細胞集密度24時間を確認してください。細胞集密度が約40%に達すると細胞分化を開始します。 Remove mTeSR1媒体過ごし、100ng / mlのアクチビンAおよび50 ngの/ mLのWntシグナル3aとを補充し、新鮮な内胚葉吸式メディアを追加します。この分化日1呼び出します。
    注:非常に細胞を播種した翌日分化を開始することをお勧めします。
  4. 内胚葉吸式培地にヒト胚性幹細胞(hESC)のための3日間、24時間毎に変更してください。人間の人工多能性幹細胞(hiPSCs)については、胚体内胚葉様細胞に首相に2日間以上の細胞をこの段階を拡張するが、これらの2日間12のみを100ng / mLのアクチビンAを補っ内胚葉プライミング媒体を用います。
    注:成功した内胚葉の仕様を確保するためには、そのようなFOXA2及びSOX17などの内胚葉マーカーの発現を調べることができます。免疫蛍光染色によると、誘導された細胞の80%以上が私たちの研究室で、両方のマーカーに陽性です。
  5. 4日目(hiPSCs用)(ヒトES細胞用)/ 6日目にKSR / DMSO分化培地に切り替えます。媒体Dを変更最初の3日間、その後、この分化段階の5日目aily。
    注:なし給はこの分化段階の4日目に必要とされません。多くの死細胞が存在する場合の培地交換の前に細胞を1回洗浄するために非補足KO-DMEMを使用してください。このステージのための差別化が成功したかどうかを確認するには、1は、AFP、CK19、およびHNF4Aなどの肝前駆細胞マーカーの発現をテストすることができます。細胞の約90%は、我々の経験に基づいて、これらのマーカーに陽性となります。
  6. KSR / DMSOの分化段階の5日後、HepatoZYMEの成熟段階に切り替えます。 KSR / DMSO媒体を除去した後、プレーンHepatoZYME基礎培地で細胞を1回洗浄します。 10ng / mLのHGFおよび20 ng / mLのOSMを補足しHepatoZYMEの成熟培地を追加します。
  7. 細胞は、標準的な特性評価やさらなる使用のために準備ができているこの時点で10日、 - 7用の培地を48時間毎に変更してください。
    注:肝細胞マーカー発現試験、代謝、尿素およびアルブミン分泌試験、糖原テスト、およびインドシアニングリーン(ICG)の取り込み試験(例えば、シトクロムP450活性のような)機能試験は、典型的な特性評価法です。
    注:分化プロトコルのタイムラインは、図5に示されています。私たちの研究室では、我々は日常的に派生HLCS「肝細胞特異的なマーカーの発現レベル、アルブミンの分泌、およびシトクロムP450(CYP)3Aおよび1A2の活性を確認してください。

Representative Results

hPSCsからの肝細胞分化

一つのヒト胚性幹細胞株H9、および1つのヒト誘導多能性幹細胞株33D6は、肝細胞の分化のために使用しました。 図4のものは33D6細胞からであるが、図1〜3の結果は、H9細胞からのものです。ラミニン上に播種し、単一の細胞を24時間後に細胞 - 細胞接触を確立しました。細胞が約40%コンフルエントに達した後、分化過程を( 図1A及び図4A)を開始しました。ラミニン(LN-521およびLN-521 / LN-111の両方)には、これらの細胞は、連続的な形態変化を経て、偏HLCS( 図1および図4A)を生じました。

肝細胞様細胞のキャラクタリゼーション

ダY 18 HLCSを集め、代表的な肝細胞マーカー、HNF4A及びALB( 図2A)の発現について評価しました。 18日HLCSの免疫染色は、細胞のほぼ90%がHNF4α( 図2B)を発現したことが示されました。これらの細胞は、ラミニンに偏し、E-カドヘリンおよびF-アクチンの発現( 図2B)でマークされたとして多角形の外観を示しました。

シトクロムP450(CYP)の活性も評価しました。 CYP450は、肝細胞の重要な代謝機能を行っています。このようなマトリゲル、LN-521、またはLN-521 / LN-111、などのゼラチン状のタンパク質混合物に由来の18日目HLCSは、CYP3A活性について試験しました。 HLCSは、マトリゲル上でよりラミニン基質( 図3)に有意に高いCYP3A活性を示しました。市販のヒト初代肝細胞と比較した場合、重要なのは、(HU1339)これらの基板上に再メッキ、HLCSは、ほぼ10倍高いレベルを持っていますCYP3A活性の10の。

hiPSCsの分化は、hESCのものと同様でした。細胞は、外観( 図4A)で逐次変化を示しました。派生HLCSは、キー肝細胞転写因子、HNF4α( 図4B)を発現し、CYP3A活性および分泌アルブミン( 図4CおよびD)を有していました。特に、33D6由来HLCSは、H9細胞由来のHLCS( 図3)と比較して減少しCYP3Aを表示し、それはまだヒト初代肝細胞10に匹敵しました。しかし、これらのHLCSのアルブミン分泌は、初代肝細胞10よりもはるかに低かったです。

図1
図1:肝分化中のシーケンシャル形態変化。 </ strong>の(A)未分化hESCを播種後40%の密集度で24時間の周りに達した単一細胞として播種しました。 (B)プライミングした後、細胞は肝芽細胞のような段階に到達すると4日目(C)に典型的な内胚葉形態を示し、それらは、成熟段階の後9日目に明確な多角形(D)を示した偏HLCSはのための準備ができていました18日目スケールバー= 200μmの時にここに示されているさらなる特徴付け。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:HLCSのキャラクタリゼーション。 (A)肝細胞特異的マーカーの遺伝子発現、HNF4A(左)及びALB(右)。発現レベルは18 HLCS派生日を使用して分析しましたLN-521およびLN-521 / LN-111の両方の上のhESCから、それはハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化し、ヒトES細胞に対して表します。結果は、3つの生物学的複製を表し、エラーバーは標準偏差(SD)を表します。 * P <0.05、** P <0.01。対応のないt検定。 (B)キー肝臓マーカー、HNF4αのタンパク質発現、及び偏光マーカー、EカドヘリンおよびFアクチン。デイLN-521およびLN-521 / LN-111上の18 HLCSは、上記マーカーについて染色し、陰性コントロールは、対応する免疫グロブリンG(IgG)を用いて実施したヘキスト33342で対比染色しました。 HNF4α陽性細胞の割合とSDが示されています。これは、ビューの4ランダムフィールドから算出しました。画像は、20倍の倍率で撮影しました。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


図3:HLCSの代謝機能のキャラクタリゼーション。マトリゲル(MG)、LN-521、またはLN-521 / LN-111で培養した細胞のCYP3AのシトクロムP450活性を試験しました。データは、3回の生物学的複製を表し、エラーバーはSDを表します。 ** P <0.01。 Tukeyの事後検定で一方向ANOVA。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:HLCSの標準的なキャラクタリゼーション。 LN-521上で培養hiPSCsは、HLCSに分化しました。標準的な特徴付け試験を17日目HLCSで行いました。 (A)肝分化中の細胞の連続形態; rを示した時点 epresent日1、4、9の細胞、およびHNF4α発現の17(B)免疫染色。陽性細胞の割合とSDは、ビューの4ランダムフィールドに基づいて示されています。画像は、20倍の倍率で撮影しました。スケールバー=100μmです。 17日目HLCS上(C)CYP3A活動。データは、6つの生物学的複製を表し、エラーバーはSDを表します。 (D)培養液中で24時間かけて誘導されたHLCSのアルブミン分泌。データは、4つの生物学的複製を表し、エラーバーはSDを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:分化プロトコルの概略タイムライン。トン= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ヒト多能性幹細胞研究および翻訳医療を進めるために、現在の適正製造基準のガイドラインに準拠して異種非含有システムが必要とされています。任意の分化プロセスの鍵は、細胞外マトリックス(ECM)です。 ECMは、細胞の付着をサポートするだけでなく、細胞の決意と表現型25、26影響与える、重要なシグナル要因へのアクセスを提供するだけでなく。

ラミニンは、 インビボでの多機能細胞外マトリックスタンパク質です。肝臓では、ラミニンの分泌は、部分肝切除27後の肝再生のために重要であると肝前駆細胞の維持28のために必要とされます。肝臓のメンテナンスや再生におけるラミニンの重要性は、私たちの肝細胞分化システムでは、市販の組換えヒトラミニンをテストするための基礎となりました。

優れた彼マトリゲルと比較した場合、patocyte分化は、LN-521およびLN-521 / LN-111の基板上に達成されました。派生HLCSは明らかに偏しており、皿に組織され、そのゼラチン状タンパク質混合物の対応と比較した場合に、それらの細胞の機能が大幅に向上しました。これらの改善を根底には線維芽、コロンを汚染のダウンレギュレーションだったと細胞関連ラミニン上の遺伝子、ならびに細胞増殖および移動関連遺伝子の発現の10の減少を食い止めます。

結論として、ここで説明するプロトコルは、成人ヒト肝細胞と性質が近い肝細胞様細胞を生成します。このプロセスは、自動化に適し再現性があり、かつコスト効率よくアプリケーションのためにスケーリングすることができます。重要なことは、バッチ間のばらつきが大きく、このフィールド内の研究のための改良された分化システムをもたらす、マトリゲルを使用する技術と比較して減少しています。

Disclosures

デビッドC.ヘイはStemnovateリミテッドの共同創設者兼ディレクターです。

Acknowledgments

この作品は、英国再生医療プラットフォームから賞(MRC MR / L022974 / 1およびMR / K026666 / 1)と中国の奨学金でサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Human Recombinant Laminin 111 BioLamina LN111-02
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632  Sigma-Aldrich Y0503-1MG
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
DMSO Sigma-Aldrich D5879
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 05850
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Knockout DMEM Life Technologies 10829
HepatoZYME Life Technologies 17705
B27 supplement Life Technologies 12587-010
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
GlutaMax Life Technologies 35050
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
2-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Accutase Millipore SCR005
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133

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References

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