Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Developmental Biology
 

Summary

Den metod som presenteras här beskriver en skalbar och god tillverkningssed (GMP) -färdig differentiering system för att generera humana hepatocyt-liknande celler från pluripotenta stamceller. Den fungerar som en kostnadseffektiv och standardiserat system för att generera humana hepatocyt-liknande celler för grundforskning och tillämpad humanlever forskning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, Y., Alhaque, S., Cameron, K., Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Hay, D. C. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (121), e55355, doi:10.3791/55355 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) har stort värde för biomedicinsk forskning. hPSCs kan skalas och differentieras till alla celltyper som finns i människokroppen. Differentieringen av hPSCs till humana hepatocyt-liknande celler (HLCs) har studerats ingående, och effektiva differentieringsprotokoll har upprättats. Kombinationen av extracellulär matris och biologiska stimuli, inklusive tillväxtfaktorer, cytokiner, och små molekyler, har gjort det möjligt att generera HLCs som liknar primära mänskliga hepatocyter. Men de flesta av förfarandena fortfarande använder odefinierade komponenter, vilket ger upphov till sats till sats variationer. Detta fungerar som ett betydande hinder för tillämpning av tekniken. Att ta itu med detta problem har vi utvecklat ett utarbetat system för hepatocyte differentiering med användning av humana rekombinanta lamininer som extracellulära matriser i kombination med ett serumfritt differentieringsprocess. Högeffektiv hepatocyte specifikation uppnåddes med demonstrated förbättringar i både HLC funktion och fenotyp. Viktigare, är lätt att skala upp med hjälp av forskning och GMP-grade hPSC linjer lovande framsteg inom cellbaserad modellering och terapier detta system.

Introduction

Primära mänskliga vävnader och derivatcelltyper används regelbundet, både för cellbaserad screening och i kliniken. Dock är tillgång till dessa celler starkt begränsad på grund av otillräcklig organdonation och förlust av cell fenotyper efter isolering ett. hPSCs utgör ett lovande alternativ till primär vävnad och underlätta bildandet av genetiskt definierade och förnybara humana somatiska celler. Hepatocyte-liknande celler (HLCs) härledda från hPSCs har redan visat lovande resultat i detta område. HLCs likna primära mänskliga hepatocyter i olika aspekter, inklusive cellmorfologi, hepatocyte genuttryck, metabolisk funktion och känslighet för läkemedel och virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dessutom den obegränsade proliferation ochsjälvförnyelse kapacitet både forsknings- och GMP-kvalitet hPSCs underlättar deras tillämpning 9, 10.

Över ett decennium av forskning har producerat ett antal effektiv hepatocyt differentiering förfaranden 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Men de flesta av dessa system använder odefinierade komponenter och / eller viral transduktion för att driva hepatocellulär specifikation. För att förbättra tillförlitligheten i tekniken i stor skala, är det viktigt att utveckla en robust hepatocyte differentieringsystem som verkligen är definierad, xeno-fri, och GMP-kompatibla.

Lamininer (LNS) är viktiga extracellulära matrisproteiner som kan påverka celladhesion, tillväxt, migration och differentiering. Lamininer är heterotrimera glykoproteiner som består av en α, β en och en γ kedja. På senare tid har rekombinanta humana lamininer tagits fram och används i cellbiologi. LN-511 har visat att stödja upprätthållandet av hPSCs 21, medan en blandning av LN-521 och E-cadherin kan klon härledning och utbyggnad av stamceller från mänskliga embryon 22. LN-111, å andra sidan, stöder upprätthållandet av hepatoblast liknande celler härledda från hPSCs 23. Men innan vår rapport, lamininer 521 och 111 hade inte använts för att generera HLCs med mogna egenskaper från hPSCs 10.

Här, vi detalj förfaranden för odling hPSCs på LN-521och differentiera dem antingen LN-521 eller en blandning av LN-521 och LN-111 (LN-521 / LN-111). Vi optimerat differentieringsprotokoll med användning av single-cellsådd för att generera en mycket reproducerbar och homogen monoskikt av HLCs i många format 14. Vi anser att vår definierade differentieringssystem utgör en enkel och kostnadseffektiv metod för att tillverka aktiva HLCs för applicering, vilket innebär en betydande steg framåt när det gäller.

Protocol

OBS: Vendor information för alla reagenser som används i detta protokoll har tagits upp i tabell 1. All media / plattor bör vara steril och åtminstone vid rumstemperatur när celler är att ha direktkontakt med dem.

1. Passaging Human pluripotenta stamceller (hPSCs) på laminin 521

OBS: Cell passage förfarande som beskrivs nedan bygger på enskilda celler och är idealisk för härledning av en homogen population av levercell-liknande celler från hPSCs. Koloni plätering är också tillämpbar och har beskrivits tidigare 24.

  1. Förbered laminin-belagda plattor som behövs.
    1. Tina 100 mikrogram / ml lager av rekombinant laminin 521 (LN-521) vid 4 ° C.
    2. Späd tinade LN-521 i iskall 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +) för att göra en 5 mikrogram / ml lösning.
    3. Tillsätt 1 ml av 5 mikrogram / ml LN-521 lösning för att belägga en brunn i en 6-brunnars plattaoch rock för att sprida det jämnt i brunnen.
    4. Inkubera plattorna i en 37 ° C / 5% CO2 cellodlingsinkubator för 2 - 4 h för akut användning eller i en 4 ° C kylskåp över natten.
    5. Lagra laminin-belagda plattor i en 4 ° C kylskåp efter behov. Hålla plattorna på en plan yta och försegla dem för att undvika avdunstning och förorening.
      OBS: Låt aldrig de belagda brunnarna torka ut; fylla dem med extra 1x DPBS (med Ca2 + / Mg2 +) om det behövs. Använd plattorna inom 2 veckor.
  2. Låt erforderligt antal förbelagda plattor uppnå rumstemperatur före användning eller Inkubera plattorna vid 37 ° C under 0,5-1 h.
  3. aspirera noggrant beläggnings LN-521 lösning utan att skada den belagda ytan. Obs: Det är viktigt att inte skada den belagda ytan innan sådd celler på det.
  4. Omedelbart lägga ett mL förvärmda-mTeSR1-medium kompletterat med 10 | iM Rho-associerat kinas (ROCK) inhibitor Y27632 till en brunn i en 6-brunnsplatta. Lämnar plattan i cellodlingsinkubator för att ta emot celler.
    OBS: Låt aldrig laminin-belagda brunnar för att torka.
  5. Aspirera mediet från välskötta hPSCs vid ca 75% till 85% konfluens. Tvätta cellerna från en brunn i en 6-brunnars platta en gång med 1 mL rumstempererat 1x DPBS (inga Ca2 + / Mg2 +).
  6. Tillsätt 0,5 ml 1x Accutase till cellerna och inkubera vid 37 ° C under 6-8 min för att dissociera cellerna.
    OBS: För att kontrollera om matsmältningen är tillräckligt lång eller inte, knacka försiktigt på plattan och kontrollera om cellerna kan lossna lätt. Om ja, då är det dags att stoppa den enzymatiska reaktionen; om inte förlänga matsmältningen för en extra 1-2 min.
  7. Avsluta dissociationen genom att tillsätta 2 ml av färskt mTeSR1-medium som kompletterats med 10 | iM Y27632 till cellerna. Pipettera upp och ned med hjälp av en P1000 spets flera gånger för att göra en enkel-cellsuspension.
  8. Räkna livskraftiga celler med användning av en hemocytometer.Använd trypanblått till fläcken och utesluta döda celler 14
  9. Beräkna det totala antalet celler som behövs. För rutinmässig hPSC passaging, utsäde 4 x 10 5 till 5 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnsplatta (dvs 4,21 x 10 4-5,26 x 10 4 per cm 2). För passage hPSCs för hepatocyte differentiering, utsäde 6,5 x 10 5 till 7,5 x 10 5 (dvs, 6,84 x 10 4 till 7,89 x 10 4 per cm 2) celler per brunn i en 6-brunnar.
    OBS! Såddtäthet för varje cellinje kan behöva mindre optimering baserad på empiriska täthet som anges här för lever differentiering.
  10. Överföra den nödvändiga cellsuspension i en steril 15-ml eller 50-ml centrifugrör och centrifugera vid 115 xg under 3 min vid rumstemperatur.
  11. Aspirera supernatanten långsamt och sedan återsuspendera cellpelleten i färskt, varmt mTeSR1 medium kompletterat med 10 | iM Rho-associerat kinas (ROCK) inhibitor Y27632, med adekvat medel för att göra den önskade celltätheten.
    OBS: Användning av ROCK-inhibitor rekommenderas starkt för att förbättra cellvidhäftning och överlevnad.
  12. Seed cellerna till de preparerade plattorna och rock dem fram och tillbaka och från sida till sida för att fördela cellerna.
    OBS: Det är viktigt att se till att celler fördelas jämnt i brunnarna om plattan är för rutin cellodling eller hepatocyte differentiering experiment.
  13. Placera plattorna i cellen inkubatorn och bibehålla cellerna vid 37 ° C / 5% CO2 under 24 h för att ge dem möjlighet att fästa och återhämta sig.
  14. Undersök cellerna nästa dag och dra ROCK-hämmare om cell-cell kontakt har etablerats. Behåll cellerna i mTeSR1 medium för rutinmässig kultur eller byta till differentieringsmedium som behövs.
    OBS: Om celler såddes med nämnda densitet bör konfluens vara perfekt för rutinmässigt underhåll eller hepatocyte differentiation.

2. Skilja hPSCs till hepatocyte-liknande celler på rekombinanta Lamininer

  1. Förbereda differentieringsmedium.
    1. Göra humant Aktivin A stamlösning: Lös humant Aktivin A pulver för att göra en 100 | j, g / ml förrådslösning i steril 0,2% bovint serumalbumin (BSA) / DPBS. Göra små alikvoter och lagra dem vid -20 ° C. Använd på 1: 1000.
    2. Göra mus Wnt 3a stamlösning: lös mus Wnt 3a pulver för att göra en 10 | j, g / ml förrådslösning i steril 0,2% BSA / DPBS. Göra små alikvoter och lagra dem vid -20 ° C. Använd på 1: 200.
    3. Göra human hepatocyt tillväxtfaktor (HGF) stamlösning: Lös human HGF-pulver för att göra en 10 | j, g / ml förrådslösning i steril 0,2% BSA / DPBS. Göra små alikvoter och lagra dem vid -20 ° C. Använd på 1: 1000.
    4. Gör Oncostatin M (OSM) stamlösning: Lös Oncostatin M (OSM) pulver för att göra en 20 mikrogram / ml stamlösning i steril 0,2% BSA / DPBS. Gör små portioner och srev sönder dem vid -20 ° C. Använd på 1: 1000.
    5. Gör 500 ml endoderm sugande lager medium: 2% B27 supplement (50x, minus vitamin A) och 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 IU / ml och 100 mikrogram / ml, respektive); top upp till 500 ml med hjälp av Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basalt medium. OBS: Förvara lager vid 4 ° C och använd inom två veckor. Alikvotera mediet från lager och lägg färska Activin A och Wnt 3a (slutkoncentrationer på 100 ng / ml och 50 ng / ml, respektive) vid varje medium förändring.
    6. Göra 500 ml KSR / DMSO differentieringsmedium: 80% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% knockout serumersättning (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanol, 1% DMSO, och 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 lE / ml och 100 pg / ml, respektive). Filtrera under vakuum. Förvaras vid 4 ° C och använd inom två veckor.
    7. Gör 500 ml HepatoZYME mognadsmedium: 1% GlutaMAX, 10 ^ M hydrokortison 21-hemisuccinat-natriumsalt (HCC), och 1% penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer på 100 lE / ml och 100 pg / ml, respektive); top upp till 500 ml med hjälp av HepatoZYME basalmedium. OBS: Förvara lager vid 4 ° C och använd inom två veckor. Alikvotera mediet från lager och lägga till färsk HGF och OSM (slutliga koncentrationer på 10 ng / ml och 20 ng / ml, respektive) för varje medium förändring.
  2. Seed hPSCs för hepatocyte differentiering på LN-521, som beskrivs i avsnitt 1. Om LN-521 / LN-111 ska användas som substrat, belägga plattorna med LN-521 och LN-111 (1: 3 förhållande) på den slutliga laminin koncentration av 5 | ig / ml; resten behandlingen ska vara densamma som rena LN-521-belagda plattor.
    OBS: LN-521 / LN-111 är inte idealisk för rutinkultur hPSCs; Det används endast för differentieringsexperiment.
  3. Kontrollera cell confluency 24 timmar efter sådd. Initiera cellulär differentiering när cellen confluency når omkring 40%. REFlytta det använda mTeSR1 mediet och tillsätt färsk endoderm sugande medium kompletterat med 100 ng / ml Aktivin A och 50 ng / ml Wnt 3a. Kalla denna differentiering dag ett.
    OBS: Det rekommenderas att initiera differentiering dagen efter sådd av cellerna.
  4. Ändra endoderm sugande medium var 24 h för 3 dagar för mänskliga embryonala stamceller (hESCs). När det gäller mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) förlänga detta skede ytterligare 2 dagar att prima cellerna slutgiltiga endoderm liknande celler, men använda endoderm sugande endast medium kompletterat med 100 ng / ml Activin A för dessa två dagar 12 .
    OBS: För att säkerställa ett framgångsrikt endoderm specifikation, kan man undersöka uttrycket av endodermala markörer, såsom FOXA2 och SOX17. Enligt immunofluorescensinfärgning, över 80% av de framställda cellerna är positiva för båda markörerna i vårt labb.
  5. Växla till KSR / DMSO differentieringsmedium på dag 4 (för hESCs) / dag 6 (för hiPSCs). Ändra mediet dAily för de 3 första dagarna och sedan på den femte dagen av denna skillnad skede.
    OBS: Ingen matning behövs på den fjärde dagen av denna skillnad skede. Använda okompletterat KO-DMEM för att tvätta cellerna en gång innan mediumbyte om det finns många döda celler. För att kontrollera om differentieringen för detta steg är framgångsrik eller inte, kan man testa uttrycket av leverstamceller markörer, såsom AFP, CK19 och HNF4A. Nästan 90% av cellerna kommer att vara positivt för dessa markörer baserat på vår erfarenhet.
  6. Efter 5 dagar i KSR / DMSO differentieringsstadiet, växla till HepatoZYME mognadsstadiet. Tvätta cellerna en gång med vanligt HepatoZYME basala mediet efter avlägsnande av KSR / DMSO medium. Lägga HepatoZYME mognadsmedium kompletterat med 10 ng / ml HGF och 20 ng / ml OSM.
  7. Ändra mediet var 48 timmar för 7 - 10 dagar, vid vilken tidpunkt cellerna är redo för standard karakterisering eller vidare användning.
    OBS: hepatocyte markör uttryck undersökningar, metabolafunktionstester (t.ex. cytokrom P450-aktivitet), urea och albumin utsöndringstester, tester glykogen lagring och indocyaningrönt (ICG) upptagstester är typiska metoder för karakterisering.
    OBS: tidslinjen för differentiering protokoll visas i fig 5. I vårt labb, rutinmässigt kontrollerar vi de härledda HLCs "hepatocyt-specifik markör uttrycksnivåer, albumin sekretion och cytokrom P450 (CYP) 3A och 1A2 aktivitet.

Representative Results

Hepatocellulär Differentiering från hPSCs

En human embryonal stamcellslinje, H9, och en människa inducerade pluripotenta stamceller linje, 33D6, användes för hepatocyte differentiering. Resultaten i fig 1-3 är från H9-celler, medan de i fig 4 är från 33D6-celler. Enskilda celler ympas på lamininer etablerade cell-cellkontakt efter 24 h. Efter att cellerna nått cirka 40% konfluens, var differentieringsprocessen inletts (Figur 1A och Figur 4A). På lamininer (både LN-521 och LN-521 / LN-111), dessa celler genomgick sekventiella morfologiska förändringar och gav upphov till polarise HLCs (Figur 1 och Figur 4A).

Hepatocyte-liknande Cell karakterisering

day 18 HLCs samlades och bedömdes för att uttrycka representativa hepatocyt markörer, HNF4A och ALB (Figur 2A). Immunfärgning av dag 18 HLCs visade att nästan 90% av cellerna uttryckte HNF4α (Figur 2B). Dessa celler polaris på lamininer och uppvisade en polygonal utseende, som kännetecknas av E-cadherin och F-aktin uttryck (Figur 2B).

Cytokrom P450 (CYP) -aktivitet bedömdes också. De CYP450 genomföra en viktig metabolisk funktion av hepatocyter. Dag 18 HLCs härletts en geléform proteinblandning, såsom Matrigel, LN-521, eller LN-521 / LN-111, testades för CYP3A aktivitet. HLCs uppvisade signifikant högre CYP3A aktivitet på laminin substrat än på Matrigel (Figur 3). Viktigt, jämfört med kommersiella humana primära hepatocyter (HU1339) åter pläterade på dessa substrat, HLCs har nästan 10 gånger högre nivåerav CYP3A aktivitet 10.

Differentieringen av hiPSCs var liknande den för hESCs. Cellerna uppvisade sekventiella förändringar i utseende (Figur 4A). Härledda HLCs uttryckte en nyckel hepatocyt transkriptionsfaktor, HNF4α (Figur 4B), och besatt CYP3A-aktivitet och utsöndras albumin (figur 4C och D). Notably HLCs härledda från 33D6 som visas reducerat CYP3A i jämförelse med H9-celler härledda HLCs (figur 3), men det var fortfarande jämförbar med humana primära hepatocyter 10. Men albuminsekretion av dessa HLCs var mycket lägre än i primära hepatocyter 10.

Figur 1
Figur 1: Den sekventiella morfologiska förändringarna under lever differentiering. </ strong> (A) diverse hESCs seedade som enskilda celler nått cirka 40% konfluens 24 timmar efter sådd. (B) Efter priming, celler uppvisade typiska endodermalt morfologi på dag 4. (C) Vid ankomsten till den hepatoblast liknande stadium, visade de en klar polygonal form på dag 9. (D) Efter mognadsstadiet, polarise HLCs var redo för ytterligare karakterisering visas här på dag 18. Skala bar = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Karakterisering av HLCs. (A) Gene expression av hepatocyt-specifika markörer, HNF4A (till vänster) och ALB (höger). Expressionsnivån analyserades med användning dag 18 HLCs härleddafrån hESCs på både LN-521 och LN-521 / LN-111, och det normaliserades till housekeepinggen GAPDH och uttrycktes relativt till hESCs. Resultaten representerar tre biologiska replikat, och de felstaplarna representerar standardavvikelsen (SD). * P <0,05, ** p <0,01; oparat t-test. (B) Proteinexpression av en nyckel levermarkör, HNF4α, och polariserings markörer, E-cadherin och F-aktin. Dag 18 HLCs på LN-521 och LN-521 / LN-111 färgades för ovanstående markörerna och motfärgades med Hoechst 33342. En negativ kontroll utfördes med motsvarande immunglobulin G (IgG). Den procentuella andelen av HNF4α-positiva celler och SD visas. Detta beräknades från fyra slump synfält. Bilder togs vid 20X förstoring. Skalstreck = 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 3: metabolisk funktion Characterization of HLCs. Cytokrom P450-aktivitet av CYP3A av celler odlade på Matrigel (MG), LN-521, eller LN-521 / LN-111 testades. Data representerar tre biologiska replikat, och felstaplar representerar SD. ** P <0,01; en-vägs ANOVA med Tukeys post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Standard karakterisering av HLCs. hiPSCs odlade på LN-521 var differentierade i HLCs. Standardtester för karakterisering utfördes på dag 17 HLCs. (A) Den sekventiella morfologi hos cellerna under lever differentiering; tidpunkterna visas r epresent celler på dag 1, 4, 9, och 17. (B) immunfärgning av HNF4α uttryck. Andelen positiva celler och SD visas baserat på fyra slump synfält. Bilder togs vid 20X förstoring. Skalstreck = 100 | j, m. (C) CYP3A aktivitet på dag 17 HLCs. Data representerar sex biologiska replikat, och felet stapel representerar SD. (D) Albumin utsöndring av härledda HLCs över 24 timmar i kultur. Data representerar fyra biologiska replikat, och felet stapel representerar SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Schematisk Tidslinje för differentiering protokollet.t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Att främja mänskliga pluripotenta stamceller och translationell medicin, Xeno fria system som uppfyller gällande riktlinjer för god tillverkningssed krävs. Nyckeln till alla differentieringsprocess är den extracellulära matrisen (ECM). ECM inte bara stödjer cellvidhäftning, men ger också tillgång till signalnyckelfaktorer, som påverkar cellbestämning och fenotyp 25, 26.

Lamininer är multifunktionella extracellulära matrixproteiner in vivo. I levern, är avgörande för leverregenerering laminin utsöndring efter en partiell hepatektomi 27 och krävs för lever stamceller underhåll 28. Vikten av lamininer lever underhåll och förnyelse var grunden för att testa kommersiellt tillgängliga rekombinanta humana lamininer i vårt hepatocyte differentiering systemet.

överlägsen hanpatocyte differentiering uppnåddes på LN-521 och LN-521 / LN-111 substrat jämfört med Matrigel. Härledda HLCs var klart polariserad och organiseras i skålen, och deras cellulära funktion förbättrades signifikant jämfört med deras gelatinösa proteinblandning motsvarigheter. Bakom dessa förbättringar var nedreglering av förorenande colon-, fibroblast- och stamcellsassocierade gener på lamininer, liksom en minskning i celltillväxt och migration associerade genuttryck 10.

Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs här genererar hepatocyt-liknande celler som är närmare sin natur vuxna humana hepatocyter. Processen är reproducerbar, mottaglig för automatisering, och kan vara ett kostnadseffektivt sätt skalas för ansökan. Viktigt har sats till sats variationer har minskat betydligt jämfört med tekniker som använder Matrigel, vilket resulterar i en förbättrad differentiering system för forskare inom detta område.

Disclosures

Dr David C. Hay är en av grundarna och chef för Stemnovate Limited.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes med utmärkelser från Storbritannien regenerativ medicin Platform (MRC MR / L022974 / 1 och MR / K026666 / 1) och ett Kina stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Human Recombinant Laminin 111 BioLamina LN111-02
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632  Sigma-Aldrich Y0503-1MG
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
DMSO Sigma-Aldrich D5879
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 05850
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Knockout DMEM Life Technologies 10829
HepatoZYME Life Technologies 17705
B27 supplement Life Technologies 12587-010
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
GlutaMax Life Technologies 35050
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
2-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Accutase Millipore SCR005
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62, (1 Suppl), S157-S169 (2015).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning Stem Cells. 9, (1), 51-62 (2007).
  4. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2, (7), 505-509 (2013).
  5. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3, (2), 141-148 (2014).
  6. Zhou, X., et al. Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Reports. 3, (1), 204-214 (2014).
  7. Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function. Arch Toxicol. 90, (7), 1757-1761 (2016).
  8. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5, (6), 764-772 (2016).
  9. Wang, Y., Hay, D. C. Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (7), 769-771 (2016).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5, (6), 1250-1262 (2015).
  11. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45, (5), 1229-1239 (2007).
  12. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, (1), 329-335 (2010).
  13. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25, (12), 3058-3068 (2007).
  14. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120, (9), 3127-3136 (2010).
  16. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, (1), 297-305 (2010).
  17. Touboul, T., et al. Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology. 51, (5), 1754-1765 (2010).
  18. Touboul, T., et al. Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes. J Hepatol. 64, (6), 1315-1326 (2016).
  19. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).
  20. Takayama, K., et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther. 20, (1), 127-137 (2012).
  21. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, (6), 611-615 (2010).
  22. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  23. Takayama, K., et al. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 1, (4), 322-335 (2013).
  24. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations. J Vis Exp. (56), e2969 (2011).
  25. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, (1 Suppl), I193-I199 (2006).
  26. Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction. Stem Cells. 31, (10), 2084-2094 (2013).
  27. Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest. 64, (2), 157-166 (1991).
  28. Lorenzini, S., et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver. Gut. 59, (5), 645-654 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics