בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

למרות היתרונות של תחולה קלה ויעילות עלות, מודלים עכברי תת עוריים יש מגבלות חמורות לא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר Orthotopic כבר הציג להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים אלה הם תובעניים מבחינה טכנית, במיוחד איברים חלולים כגון המעיים הגדולים. כדי לייצר גידולים אחידים אשר לגדול באופן אמין גרורות, טכניקות סטנדרטיות של הכנת תאים סרטניים הזרקה הם קריטיים.

פיתחנו מודל עכבר אורטוטופי של סרטן המעי הגס (CRC), אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. תאים סרטניים משני גידולים ראשוניים, תאים דו מימדיים (2D) או תאים תלת מימדיים (3D) מוזרקים לתוך cecum, בהתאם לפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים מוזרקים, יוצרים גידולים גרורתיים מאוד. בנוסף,CTCs ניתן למצוא באופן קבוע. אנו מתארים כאן את הטכניקה של הכנת תאים סרטניים משני שורות תאים דו-ממדיים ואורגנואידים תלת-ממדיים, כמו גם ברקמת הגידול הראשית, טכניקות ההזרקה וההזרקה, כמו גם בידוד של CTCs מן העכברים הנושאים גידולים, ומציעים עצות לפתרון בעיות.

Introduction

סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות סרטן במדינות מערביות. 1 בעוד הגידול הראשוני יכול לעיתים קרובות להיות resected, את התרחשות גרורות רחוקות באופן דרמטי מחריף את הפרוגנוזה ולעתים קרובות מוביל למוות. 2 , 3 מתאם ביולוגי של גרורות הוא מחזורי תאים סרטניים, אשר לנתק מן הגידול, לשרוד במחזור, לצרף את אפיתל באיבר היעד, לפלוש לאיבר ובסופו של דבר להתגבר על נגעים חדשים. 4 למרות שמדובר בחומר CTC ידוע בעל רלוונטיות פרוגנוסטית, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 הביולוגיה שלהם מובנת חלקית רק כתוצאה מן הנדירות הקיצונית שלהם ב- CRC. 10

מודלים עכבר הם לא חזקOol ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של סרטן. מודלים קלאסיים, תת עוריים מיוצרים על ידי הזרקה תת עורית של תאים סרטניים לעכברים הנמענים, אשר יכול להיות גם immunocompetent (אם תאים סרטניים Murine syngeneic משמשים) או immunodeficient. מודלים גידול תת-עוריים הם זולים ומייצרים נתונים במהירות; צמיחת הגידול של נקודת הסיום שלהם יכולה להיות נמדדת בקלות ובלא פולשניות. עם זאת, 88% של תרכובות חדשות שהפגינו פעילות אנטי-סרטנית במודלים כאלה נכשלות בניסויים קליניים. 11 זה בחלקו בשל הבדלים בין בני-אדם בין עכברים לעכברים; עם זאת, חלק גדול של כישלון זה נובע ערך מנבא נמוך של מודלים עכבר תת עורית.

מודלים עכבר Orthotopic, שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך איבר המוצא ובכך לגדול microenvironment המקורי שלהם, ולכן משמשים יותר ויותר במחקר סרטן. 11 , 12 , 13 , 14 מודלים אורתופטיים לא רק לדמות את התנאים גידול הגידול המקומי; כתוצאה מהאתר האנטומי של גידול הגידול, מודלים של עכבר אורטוטופיים מאפשרים גם סימולציה מציאותית של גרורות, ולכן הם משתמשים כדי לחקור את הביולוגיה של CTC 8 , 15 , 16 או את תגובתם לטיפולים שונים ב- CRC. 13 , 17

החיסרון העיקרי של מודלים עכבר אורתוטופיים היא המורכבות הטכנית שלהם. בהתאם האיבר שבו תאים להיות מוזרק, עקומת למידה עד הנסיין הוא מסוגל לגדל גידולים לשחזור הוא ארוך למדי. זה במיוחד חל על מודלים של סרטן המעי הגס, כמו תאים סרטניים צריך להיות מוזרק לתוך דופן המעיים, אשר לעתים קרובות התוצאות ניקוב, דליפת תא הגידול או הפסד endoluminal תא הגידול. זהRticle מיועד לתאר את השיטה של ​​הכנת תאים דגימות רקמה ראשונית, שורות תאים 2D ותרבות אורגנואידית 3D הזרקתם לתוך cecum של עכברים. הטכניקה המתוארת כאן מוביל לגידולים אחידים מאוד, בהתאם לביולוגיה הגידול של קו התא המשמש להזרקת, היווצרות של גרורות מרוחקות ו CTCs בעכברים הנמען. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים שהוצגו כאן נבדקו באופן עצמאי והותר על ידי מוסד וועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים ונערכו על פי הנחיות הפדרציה של המעבדה למדעי בעלי חיים (FELASA). כל האמצעים האפשריים נלקחו כדי למזער את הסבל כולל הרדמה ומשכך כאבים או, אם יש צורך, המתת חסד מוקדמת.

1. הכנת תאים ואורגנואידים

הערה: השתמש בנפח של 20 μL עם 100,000 תאים עבור כל זריקה. השתמש במטריצה ​​קרום במרתף (BMM) על מנת למנוע דליפה ו להבטיח הזרקת סטנדרטי. על מנת להבטיח תוצאות לשחזור, לנהל מבחני אימות קו התא ( למשל , באמצעות פרופיל STR) במרווחי זמן קבועים.

  1. הכנת השעיות תא ראשוני מ רקמות טריות
    הערה: תמיד לעבוד בתנאים סטריליים. העברה מיידית של טרירקמות resected מחדר הניתוח למעבדה על הקרח נדרש כדי להבטיח את הכדאיות של התאים.
    רווחת המטופל והטיפול המיטבי חייבים להיות תמיד העדיפות הראשונה. לכן, דגימות רקמות למחקר חייב להתקבל באופן שאינו מפריע לעבודת הפתולוגי שלאחר מכן ובימוי של הגידול resected. ברוב המקרים, לכן סביר לקבל את דגימות למחקר שהושג על ידי הפתולוג מאומן על מנת להבטיח אי-הפרעה עם האבחון הפתולוגי.
    1. מיד לאחר הסרת סטרילית מן הדגימה resected (אידיאלי ~ 1 ס"מ 3 ), במקום מדגם רקמות בצינור 50 מ"ל מראש מלא עם 20-30 מ"ל של מלוחים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). חנות הצינור על הקרח ולהעביר את המעבדה מיד.
    2. שים את הרקמה בצלחת פטרי לשטוף אותו פעמיים עם הרבה PBS כדי להסיר את הדם הנותר.
    3. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות (~ 2-4 מ"מ) עם scaLpel ( לדוגמה , עם להב מס '20 או # 36).
    4. השתמש דיסוציאטור על פי הוראות היצרן על מנת לנתק עוד את רקמת הגידול אל ההשעיה תא בודד. לחלופין, להשתמש בפרוטוקולים אחרים של עיכול הגידול האנזימטי.
    5. ספירת התאים של ההשעיה תא בודד וכתוצאה מכך ( למשל , בדלפק coulter או hemocytometer).
    6. צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS.
    7. Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ולשמור אותם על הקרח.
  2. הכנת שורות תאים להזרקה
    1. לגדל את כל שורות תאים סרטניים המעי הגס תחת תנאים קולטורינג סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) ולהכין אותם ביום הניתוח.
    2. קציר התאים על פי תקן פרוטוקולים תרבות התא, לספור את התאים ( למשל , ב coulter הדלפק או hemocytometer) ולחשב את reqUired כמות עבור כל זריקות בהתאם למספר בעלי חיים להיות מוזרק.
    3. הכן 3-5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה.
    4. צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 גרם) לשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS.
    5. Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ולשמור אותם על הקרח.
  3. הכנה אורגנואידית
    הערה: כל התרבויות האורגנואידים 3D גדלים בתנאים רגילים culturing (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). פרוטוקולים מפורטים לתרבות אורגנואידית פורסמו לפני כן. 18 , 19 , 20 בדומה שורות תאים קונבנציונאלי, אנו ממליצים נפח של 20 BMM μL עם 100,000 תאים לכל הזרקת. האורגנואידים מוכנים ביום הניתוח כדלקמן:
    1. הכן את המדיום הבא (בהפניה הבאהכדי DMEM / F12 + +): מתקדם Dulbecco השתנה בינוני של הנשר (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% גלוטמין (200 מ"מ) + 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
    2. טרום מילוי צינורות 15 מ"ל עם 1 מ"ל DMEM / F12 + +.
    3. בזהירות לשאוב את האורגנואים מפני השטח של צלחת התרבות ולהעביר את התוכן של 3 עד 5 בארות לתוך צינור 15 מ"ל אחד.
    4. בזהירות לשבור את organoids לתוך חתיכות קטנות יותר על ידי pipetting אותם למעלה ולמטה עם פיפטה זכוכית ממושכת.
    5. הוסף 5 מ"ל DMEM / F12 + + אל הצינור, ואחריו צנטריפוגה ב XG 1000 במשך 5 דקות.
    6. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, resuspend גלולה ב 600 μL חיץ דיסוציאציה μL ולהעביר את ההשעיה היטב אחד של צלחת 6-היטב.
    7. דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות ולאחר מכן בזהירות pipet ההשעיה מעלה ומטה על מנת להמיס את האורגנואידים.
      הערה: בדוק את העיכול באמצעות מיקרוסקופ; הוא שלם כאשר כל אשכולות התא היו לנתקד לתאים בודדים.
    8. עם אכול מוצלח, להוסיף 1.4 מ"ל של DMEM / F12 + + כדי לעצור את העיכול. ואז להעביר את כל הבארות של אורגנואידים מתעכל צינור 50 מ"ל.
    9. לספור את התאים ולחשב את הסכום הנדרש עבור כל הזריקות.
    10. הכן 3 - 5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה
    11. צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS.
    12. Resuspended התאים BMM לריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ולשמור אותם על הקרח.

2. דגם עכבר Orthotopic

  1. הכנת חיות הנמען לניתוח
    הערה: השתמש 6-8 שבועות בן NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD גמא SCID, NSG) עכברים כמקבל. 21 NSG הם בין עכברים immunocompromised ביותר, חסר בוגרים, T ו- NK תאים יחד עם מספר רב של חיסון אחר De. 21 הם לגדול באופן אמין גידולים גם אם מספר תאים נמוך מוזרקים והם נוטים מאוד גרורות רחוקות. עכברי NSG הם מגדלים מעולה יכול להישמר קונבנציונאלי ספציפי פתוגן חינם (SPF) יחידות.
    1. לפני החתך הראשון, להזריק 0.05 מ"ג / ק"ג של בופרנורפין תת עורי.
    2. השתמש sevoflurane ב 3-3.5 כרך% עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס קמצוץ הבוהן מעיד על הרדמה מספקת.
    3. מכסים את העיניים של עכברים הרדים עם משחה עיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
    4. לרסן את העכברים במצב שכיבה על שולחן קטן.
    5. לגלח את הבטן עם מכונת גילוח חשמלית (קרם דפילציה ניתן להשתמש לחילופין) לחטא עם לפחות 3 פעמים clorhexidine / יוד ו 70% אלכוהול לחילופין.
    6. לכסות את שדה כירורגי עם וילונות סטריליים.
      הערה: השימוש באנטיביוטיקה perioperative הוא אופציונלי ובכפוף להנחיות מוסדיות.
  2. Midline laparotomy וחשיפה של cecum
    1. השתמש במספריים (אזמלים ניתן להשתמש לחילופין) לעשות חתך קו האמצע קטן (3 - 5 מ"מ) של העור על הבטן התחתונה. להרים את שרירי דופן דופן הבטן עם מלקחיים בזהירות לחתוך אותו במספריים, ובכך לפתוח את חלל הבטן.
    2. לזהות בזהירות exteriorize את cecum עם מלקחיים atraumatic. מקם את העטיפה הסופית העיוורת של cecum על הבטן הצביע cranially.
    3. לאחר exteriorized, לשמור על cecum לחות באמצעות מלוחים חמים מלוחים בכל עת.
  3. זריקה אורתופטית, סגירת הבטן והחלמה לאחר הניתוח
    1. להזרקת intracecal, להשתמש מזרק 1 מ"ל רגיל עם צינורית 30 G. הר זה מזרק על משאבת microinjection, אשר בתורו רכוב על micromanipulator.
    2. בזהירות לתפוס את קצה cecum עם מלקחיים atraumatic בעדינות להחליק אותו על ידי stroking אותו למטהד עם קבוצה שנייה של מלקחיים מולחמים עם מלוחים חמים.
    3. מקם את הצינור ישירות מעל cecum.
    4. בצע את השלבים הבאים תחת שליטה חזותית עם מיקרוסקופ כירורגי בינוקולרי.
    5. בזהירות לתפוס את cecum עם שני מלקחיים atraumatic בשני הקצוות של החלק exteriorized של cecum, מעט למתוח אותו ואז לאט למשוך אותו על צינורית אשר ממוקם מקביל ומעל ישירות. זה חיוני לא לנקב את כל דופן המעי (ובכך להזריק את התאים לתוך לומן), כמו גם לא לחורר את serosa מעבר לנקודת החדירה הראשונית, כמו זה יוביל דליפה והפצה הצפק.
      1. להזיז את המעיים לכיוון הצינורית, לא את הצינורית לכיוון המעיים. החזק ו למתוח את המעיים בין שני מלקחיים. הידיים של המנתח חייב להיות מונח על משטח כדי להפחית את הרעד.
    6. להזריק את התאים בין serosa (כפי שנראה דק מאוד, בטנה שקוף מעל thE כלי הדם intramural) ואת השרירים. צינורית ולכן יש להציב ויזואלית מעל כלי הדם מתחת מתחת לממברנה שקוף שקוף.
    7. השתמש במתג רגל כדי להתחיל את הזריקה כדי להפחית את הרעידות בזמן צינורית היא בתוך דופן המעיים.
    8. לאחר צינורית נמצאת בעמדה, להתחיל את הזריקה. השתמש משך של 20 s, וכתוצאה מכך 1 μL / s הגדרה על יחידת הבקרה של המשאבה.
      הערה: הזריקה לתוך או ליד כלי דם פגום מוביל להפצה intravascular ישיר גרורות רחוק ולכן יש להימנע.
    9. לאחר השלמת הזריקה, להסיר בזהירות את הצינור על ידי משיכת אותו לאחור.
    10. מניחים ספוגית יבשה מתחת cecum, ולאחר מכן לשטוף היטב את cecum עם מים מזוקקים על מנת lyse leaked תאים ובכך למנוע הפצה מלאכותית הצפק.
  4. סגירת הבטן והתאוששות לאחר הניתוח
    1. אחרי רמזיזים בעדינות את הצואה לחלל הבטן.
    2. סגור את דופן הבטן עם 6-0 התפרים פועל במהירות absorbable.
    3. סגור את העור עם קליפ הפצע כירורגי.
    4. מניחים את העכבר על המפה חימום להגדיר 38 מעלות צלזיוס עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
    5. בקפידה להתבונן במצב שלאחר הניתוח של העכברים במשך 48 שעות הבאות. במקרה של מצוקה, לטפל עם 0.05 מ"ג / ק"ג buprenorphine כל 12 שעות.
    6. לפקח על העכברים לפחות פעם אחת ביום עבור סימנים של מצוקה בשל הגידול בגידול.

3. בידוד של תאים סרטניים במחזור מ דוגמאות דם מלא

הערה: השגת דם על ידי לנקב קרדיאלי עור על עכברים מורדמים, ואחריו המתת חסד. באופן אידיאלי, 1000 μL של דם נמשכים לתוך מזרק prefilled עם μL 100 של נוגדי קרישה (חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או הפרין). השתמש אנטי אנושי, EpCAM (דלקת תא אפיתלמולקולה) נוגדן כדי לזהות את CTCs. זה עובד טוב מאוד אם אנושיים שורות תא אפיתל משמשים את המודל העכבר. עבור מכשירים אחרים, נוגדנים שונים עשויים להיות נדרשים.

  1. העשרת CTC:
    1. לפני מילוי צינורות 15 מ"ל עם 5 מ"ל צפיפות בינוני שיפוע בזהירות להעביר את הדם לתוך צינור 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה (30 דקות ב 300 xg ללא בלימה) בזהירות להסיר את supernatant העליון.
    3. יוצקים את השאר לתוך צינור חדש 15 מ"ל ו צנטריפוגה (15 דקות, 300 XG עם הבלם).
    4. לשחזר את interfase המכיל את התאים mononuclear (להשליך את שאר) ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
    5. Resuspend גלולה 200 μL PBS / 1% EDTA ולהוסיף 4 μL של נוגדן EpCAM. דגירה 20 דקות על הקרח בחושך.
  2. הקרנה וקטיף
    1. הכן את המאגר הבא (הנקרא להלן חיץ לקטוף): PBS + 10% עגל בסרום בסרום (FCS) + 1% פניצילין / Sטרפטומיצין (1%) + 0.8% EDTA.
    2. השתמש בעט PAP לצייר מעגל ~ 1 ס"מ בצלחת פטרי 6 ס"מ סטרילי (מונע את הנוזל מפיזור בצלחת), ו 700 μL pipet של לקטוף למאגר לתוך מעגל זה.
    3. הוסף 50 μL ההשעיה התא למאגר 700 μL לקטוף בתוך המעגל. בדוק את צפיפות התאים עם המיקרוסקופ. פיצול המדגם לתוך מנות שונות אם הוא צפוף מדי.
    4. המתן לתאים להתיישב (~ 5 דקות).
    5. מסך טיפת ההשעיה התא עבור מוכתם (= EpCAM חיובי) תאים.
    6. לאחר התא נמצא, לבחור את התא עם micromanipulator ולשים אותו חיץ 50 μL בהתאם ניתוח במורד המיועד ( למשל , חיץ RNA החילוץ או בינוני culturing).
    7. בהתאם לנתונים במורד הזרם המיועד, לבודד תאים שליליים של EpCAM ו / או בינוני כבקרות שליליות.
    8. המשך ניתוח במורד הזרם ( למשל , תרבות התא, PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מוצלח לשעתקו של גידולים המעי הגס במודל זה באופן ביקורתי תלוי הזרקת מדויק של תאים ללא דליפה או דליפה. אם זה הושג, מודל זה הוא אמין מאוד ורק לעתים רחוקות תוצאות ההפצה הצפק מלאכותית. קינטיקה הצמיחה של גידולים כמו גם דפוסי ההפצה שלהם תלויים בביולוגיה של אורגנואידים בשימוש ותאים. 15 בעוד HCT116 תאים גרורות באופן אמין לכבד במודל זה, SW620 תאים טופס גידולים אורטוטופיים, אבל לא גרורות. 15

השימוש HCT116 תאים במודל זה אמין תוצאות עכברים moribund בתוך 35 ימים של הזרקת תאים סרטניים. גידולים ראשוניים למדוד על 10 מ"מ בגודל ( איור 1 א ו איור 2 א ), גרורות בכבד ( איור 1 ב Ong> ו איור 2 ב ), גרורות ריאות ( איור 1 ג ו איור 2 ג ) ו מחזור תאים סרטניים ( איור 3 ) נמצאים כמעט תמיד. ב עכברים הנושאים HCT116 גידולים, 35 ימים לאחר הזרקת תאים סרטניים CTCs נמצאים בתדירות גבוהה וכמות והוא יכול להיות מבודד בקלות עבור ניתוחים במורד הזרם ( איור 3 ).

איור 1
איור 1: תמונות Macroscopic לאחר ניתוחים 35 ימים לאחר הזרקת אורתופטי של HCT116 תאים CRC האדם לתוך עכברים NSG. ( א ) הגידול הראשוני (קו מקווקו) ב cecum. ( ב ) כבד עם גרורות מרובות. ( ג ) גרורות ריאות (חיצים).1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תמונות היסטולוגיות של האורגנים המוצגות באיור 1 . ( א ) הגידול הראשוני (H & E). ( B ) גרורות כבד (H & E). ( ג ) גרורות ריאות (אימונוהיסטוכימיה נגד APCAM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מחזורי תאים סרטניים (HCT116 תאים בעכברים NSG, 35 ימים לאחר הזרקת תא הגידול). שדה בהיר ( א B )) תמונות של CTCs בתא דם monopuclear הפריפריאלי (PBMC) חלק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות הפעילות המוכחת שלהם במודלים עכבריים תת-עוריים, הרוב הגדול של המרכיבים החדשים נכשל בניסויים קליניים ומעולם לא הגיע למרפאה. 11 זה חוסר ברור של מודלים עכבר תת עוריים כדי לדמות במדויק את הביולוגיה ואת דפוסי הצמיחה של גידולים הובילה לפיתוח מודלים עכבר orthotopic מבוסס על הזרקה של תאים סרטניים ישירות לתוך האיבר המקורי.

מודלים עכבר Orthutic מסוגלים לדמות את הביולוגיה והפצה של גידולים מוצקים הרבה יותר מדויק מאשר מודלים תת עוריים. 15 עם זאת, החסרונות העיקריים הם reproducibility עניים במיוחד באיברים תובעניים מבחינה טכנית כגון איברים חלולים כמו גם ניטור תובעני מבחינה טכנית של הגידול הגידול. במודל שלנו, יש לנו ולכן התמקד בגודל הגידול בנקודת זמן מוגדרת מראש ולא בהליכי הדמיה חוזרת, אשר מגבילה את מספר טכניאני משוכללת ובדיקות מלחיץ של בעלי החיים. המודל המתואר כאן יכול לשמש עבור יישומים שונים כגון אפיון של שורות תאים סרטניים, 15 חקירה של ביולוגיה הגידול והפצה כמו גם ניסויים טיפוליים. 17 נקודות קצה ברורות הן גודל הגידול הראשוני ומספר הגרורות הרחוקות, אך ניתן להשתמש גם בנקודות קצה משוכללות יותר, כגון מספרי CTC 17 או שיטות הדמיה.

השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול שלנו הוא הזרקת תא הגידול תת. זה דורש בפועל חייב להתבצע בכל עת תחת שליטה חזותית ישירה. אם ההפקדה היא בכל מקום אחר אבל מתחת serosa אבל מעל הרירית, לא תהיה שום גידול גידול בכלל או צמיחה בלתי צפויות והפצה, עיבוד תוצאות שאין כמוהו. סיבות אפשריות אחרות לחוסר התפתחות הגידול כוללות תאים לא קיימא ( למשל </ Em>, בשל טווח זמן ארוך בין הקציר הזרקת של התאים) או לא לגמרי עכברים סיגני. זה אפשרי אם C57Bl / 6 עכברים משמשים; כפי שיש מספר רב של תחמוצות של C57Bl / 6 ( למשל , C57Bl / 6J ו C57Bl / 6N) אשר מראים הבדלים גנטיים פנוטיפי שונים 22 אשר משתקפים גם הגידול לקחת שיעורי. 23

כאן מתואר טכניקה הזרקת מבוקרת מאוד מוביל לגידול גידול מאוד הפצה והפצה ומבדיל את המודל הזה מן המודלים שתוארו לעיל. 24 בנוסף, שטיפת cecum עם מים מזוקקים לאחר הזרקת תא הגידול מפחיתה באופן דרמטי את קצב הפצה הצפק מלאכותי; לכן, אם carcinomatosis peritoneal מתרחשת במודל שלנו, היא ככל הנראה תוצאה של הביולוגיה של קו התא ולא דלקת תא הגידול iatrogenic.

מגבלות של זה מ 'Odel הם עכברים הנמענים אשר צריך להיות immunodeficient אם שורות תאים אנושיים יש להשתמש. זה מגביל מאוד את היישום של המודל במחקרים אימונולוגיים. עם זאת, מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש של תאים תאיים Murine תא או אורגנואידים (נתונים שלא פורסמו). מגבלה נוספת היא השימוש של שורות תאים עצמם. תאים תאים סרטניים הם לעתים קרובות מאוד anaplastic, אשר משאירים שאלות לגבי ייצוג שלהם של הביולוגיה של הגידול המקורי. הגבלה זו אינה קיימת במודלי עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), המפתחים גידול חדש על ידי הכנסת מוטציות אונקוגניות ספציפיות לרקמות. 12 GEMMs כאלה מבוססים בדרך כלל על מוטציות מותנות של קו נבט ( כגון גן Apc מנוקב) וקריאה בתיווך ההפעלה של המוטציות, או על ידי זיהום מקומי עם adeno-cre 25 , 27 , 28 או יזם ספציפי רקמה נהיגהביטוי. 29 , 30 , 31 עם זאת, מודלים כאלה דורשים לעתים קרובות מעברים רבים יש ביולוגיה משתנה מאוד. אם קווי התא העיקרי משמשים המודל המוצג כאן, מגבלה של ייצוג נמוך ניתן להתגבר ללא הפסד של יתרונות אחרים של המודל שלנו כגון שחזור ואת עלות יחסית יעילות.

מגבלה נוספת של הטכניקה המוצעת כאן היא התלות ב- EpCAM כסמן פני השטח. זה ידוע היטב כי EpCam יכול ללכת לאיבוד במהלך EMT וכי יש חלק של CTCs כי הם EpCAM שלילי. 10 , 15 לכן, בהתאם למטרת הניסוי וקווי התא המשמש להזרקת, אמצעים אחרים של הזיהוי ( למשל , GFP תיוג של התאים לפני ההזרקה) ניתן להשתמש.

לסיכום, המודל המוצג כאן געל כלי גמיש ללמוד התפתחות הגידול והפצה בהקשר של microenvironment הגידול המקורי במעי הגס. אם קווי תאים גרורתיים משמשים, זה בנאמנות מדמה הפצת תאים סרטניים בכל האתרים הרלוונטיים עבור CRC כולל CTCs בזרם הדם. לכן כלי שימושי כדי ללמוד את השינויים פנוטיפי במהלך הגידול והפצה הגידול ומאפשר בידוד חוזר ואפיון של CTCs ב CRC. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (WE 3548 / 4-1) ו- Roland-Ernst-Stiftung for Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365, (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1, (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397, (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20, (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112, (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19, (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263, (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138, (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74, (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5, (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33, (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6, (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4, (11), e1042201 (2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7, (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6, (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74, (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159, (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100, (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14, (7), R82 (2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347, (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7, (351), ra107 (2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61, (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8, (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (42), 11859-11864 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics