Выделение циркулирующих опухолевых клеток в модели ортотопической мыши колоректального рака

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем установление ортотопических колоректальных опухолей путем инъекции опухолевых клеток или органоидов в слепую кишку мышей и последующее выделение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из этой модели.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, подкожные мышиные модели имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены модели ортотопической мыши; Однако такие модели технически требуются, особенно в полых органах, таких как толстая кишка. Для получения однородных опухолей, которые надежно растут и метастазируются, стандартизированы методы подготовки и инъекции опухолевых клеток.

Мы разработали ортотопическую модель мышиного колоректального рака (CRC), которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Опухолевые клетки из первичных опухолей, двумерных (2D) клеточных линий или трехмерных (3D) органоидов вводятся в слепую кишку и, в зависимости от метастатического потенциала инъецированных опухолевых клеток, образуют высокометастатические опухоли. К тому же,КТК можно найти регулярно. Здесь мы описываем методику получения опухолевых клеток как с 2D клеточными линиями, так и с 3D-органоидами, а также с первичной опухолевой тканью, хирургическими и инъекционными методами, а также с отделением CTC от опухолевых мышей и представляем советы по устранению неполадок.

Introduction

Колоректальный рак (CRC) является одной из наиболее распространенных причин смерти от рака в западных странах. 1 В то время как первичная опухоль может часто быть иссекают, возникновение отдаленных метастазов значительно ухудшает прогноз и часто приводит к смерти. 2 , 3. Биологический коррелятор метастаза - это циркулирующие опухолевые клетки (CTC), которые отделяются от опухоли, выживают в обращении, прикрепляются к эпителию в органе-мишени, вторгаются в орган и в конечном итоге перерастают в новые очаги. 4 Хотя известно, что CTC имеют прогностическую значимость, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 их биология лишь частично понимается как результат их крайней редкости в CRC. 10

Модели мышей - мощные tOol для изучения различных аспектов биологии рака. Классические, подкожные опухолевые модели продуцируются путем подкожной инъекции опухолевых клеток мышам-реципиентам, которые могут быть либо иммунокомпетентными (если используются сингенные мышиные опухолевые клетки), либо иммунодефицитом. Модели подкожных опухолей являются недорогими и быстро производят данные; Их конечный рост опухоли может быть легко и неинвазивно измерен. Однако 88% новых соединений, которые продемонстрировали противоопухолевую активность в таких моделях, не проходят в клинических испытаниях. 11 Это отчасти связано с межвидовыми различиями между людьми и мышами; Однако большая часть этого отказа объясняется низким прогностическим значением подкожных моделей мыши.

Модели ортотопических мышей, в которых опухолевые клетки вводятся в орган происхождения и, таким образом, растут в их первоначальном микроокружении, поэтому все чаще используются в исследованиях рака. 11 , 12 , 13 , 14 Ортотопические модели не только моделируют местные условия роста опухоли; В результате анатомически правильного участка роста опухоли модели ортотопической мыши также позволяют реалистичное моделирование метастазов и поэтому используются для изучения биологии 8 , 15 , 16 CTC или их реакции на различные методы лечения в CRC. 13 , 17

Основным недостатком ортотопических моделей мыши является их техническая сложность. В зависимости от органа, в который должны вставляться клетки, кривая обучения до тех пор, пока экспериментатор не сможет индуцировать воспроизводимые опухоли, довольно длительный. Это особенно относится к колоректальным раковым моделям, поскольку опухолевые клетки необходимо вводить в стенку кишечника, что часто приводит к перфорации, утечке опухолевых клеток или потере эндолюминальной опухолевой клетки. ЭтоЦелью настоящего изобретения является описание способа подготовки клеток из образцов первичной ткани, двумерных клеточных линий и трехмерной органоидной культуры и их инъекции в слепую мышь. Описанная здесь методика приводит к высокоравномерным опухолям и, в зависимости от биологии опухоли клеточной линии, используемой для инъекций, воспроизводимому образованию отдаленных метастазов и КТК у реципиентных мышей. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Представленные здесь эксперименты на животных были независимо рассмотрены и разрешены институционным и правительственным комитетом по уходу и использованию животных и проводились в соответствии с руководящими принципами Федерации ассоциаций лабораторий животных (FELASA). Были приняты все возможные меры для сведения к минимуму страданий, включая анестезию и обезболивание, или, в случае необходимости, преждевременную эвтаназию.

1. Подготовка клеток и органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте объем 20 мкл с 100 000 клеток для каждой инъекции. Используйте базовую мембранную матрицу (BMM), чтобы предотвратить утечку и обеспечить стандартизированную инъекцию. Чтобы обеспечить воспроизводимые результаты, проводите проверки подлинности клеточной линии ( например , через профилирование STR) через регулярные промежутки времени.

  1. Получение суспензий первичных клеток из свежей ткани
    ПРИМЕЧАНИЕ. Всегда работайте в стерильных условиях. Немедленная передача свежегоДля обеспечения высокой жизнеспособности клеток требуется резецированная ткань из операционной в лабораторию на льду.
    Благополучие пациента и оптимальное лечение всегда должны быть первоочередными. Поэтому образцы тканей для исследования должны быть получены таким образом, чтобы не мешать последующей патологической обработке и постановке резецированной опухоли. Поэтому в большинстве случаев разумно иметь образцы для исследований, полученных квалифицированным патологом, чтобы обеспечить невмешательство в патологический диагноз.
    1. Сразу же после стерильного удаления из резецированного образца (в идеале ~ 1 см 3 ) поместите образец ткани в пробирку объемом 50 мл, предварительно заполненную 20-30 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Храните трубку на льду и немедленно переведите в лабораторию.
    2. Положите ткань в чашку Петри и дважды промойте ее большим количеством PBS, чтобы удалить оставшуюся кровь.
    3. Разрежьте ткань на мелкие кусочки (~ 2-4 мм) с помощью scaLpel ( например , с лезвием № 20 или # 36).
    4. Используйте диссоциатор в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы далее диссоциировать опухолевую ткань с одноклеточной суспензией. Альтернативно, используйте другие протоколы ферментативного расщепления опухоли.
    5. Подсчитайте клетки полученной одноклеточной суспензии ( например , в сошнике или гемоцитометре).
    6. Центрифуга (5 мин при 1500 мкг) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
    7. Повторно суспендируйте клетки в BMM в концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и держите их на льду.
  2. Подготовка клеточных линий для инъекций
    1. Растите все клеточные линии колоректального рака в стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% CO 2 ) и подготовьте их в день операции.
    2. Убирайте клетки в соответствии со стандартными протоколами клеточной культуры, подсчитывайте клетки ( например , в сошнике или гемоцитометре) и вычисляйте reqДля всех инъекций в зависимости от количества вводимых животных.
    3. Подготовьте 3-5х фактически необходимого объема для учета потерь на пипетке и мертвого объема инъекционного шприца.
    4. Центрифуга (5 мин при 1500 г) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
    5. Повторно суспендируйте клетки в BMM в концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и держите их на льду.
  3. Подготовка органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Все трехмерные органоидные культуры выращивают в стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% CO 2 ). Подробные протоколы для органоидной культуры были опубликованы ранее. 18 , 19 , 20 Подобно обычным клеточным линиям, мы рекомендуем объем 20 мкл BMM с 100 000 клетками на инъекцию. Органоиды готовятся в день операции следующим образом:
    1. Подготовьте следующую среду (в следующем(DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Глутамина (200 мМ) + 1% пенициллина / стрептомицина.
    2. Предварительно заполните 15 мл пробирки 1 мл DMEM / F12 +++.
    3. Осторожно аспирируйте органоиды с поверхности культуральной пластины и перенесите содержимое 3 - 5 лунок в одну пробирку объемом 15 мл.
    4. Осторожно сломайте органоиды на мелкие кусочки, пипетируя их вверх и вниз с помощью удлиненной стеклянной пипетки.
    5. Добавить 5 мл DMEM / F12 +++ в пробирку с последующим центрифугированием при 1000 мкг в течение 5 мин.
    6. После центрифугирования удаляют супернатант, ресуспендируют гранулу в 600 мкл ферментативного диссоциационного буфера и переносят суспензию в одну лунку 6-луночного планшета.
    7. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1-5 минут, а затем тщательно пипетируйте суспензию вверх и вниз, чтобы растворить органоиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Проверьте пищеварение с помощью микроскопа; Он завершен, когда все клеточные кластеры диссоциируютD к отдельным ячейкам.
    8. После успешного пищеварения добавьте 1,4 мл DMEM / F12 +++, чтобы остановить переваривание. Затем перенесите все лунки переваренных органоидов на 50 мл пробирку.
    9. Подсчитайте ячейки и рассчитайте необходимое количество для всех инъекций.
    10. Подготовьте 3 - 5x фактически необходимого объема для учета потерь на пипетке и мертвого объема инъекционного шприца
    11. Центрифуга (5 мин при 1500 мкг) и дважды промывают суспензию клеток PBS.
    12. Ресуспендировали клетки в BMM до концентрации 5 × 10 6 клеток / мл и удерживали их на льду.

2. Модель ортотопической мыши

  1. Подготовка животных-реципиентов для хирургии
    ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте в качестве получателей 6-8-недельные мыши NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG). 21 NSG относятся к числу наиболее иммунокомпрометированных мышей, у которых отсутствуют зрелые B, T и NK-клетки, а также несколько других иммунных дефекты. 21 Они надежно вырабатывают опухоли, даже если низкие числа клеток вводятся и сильно подвержены отдаленным метастазам. Мыши NSG являются прекрасными селекционерами и могут храниться в обычных специальных патогенных (SPF) единицах.
    1. Перед первым разрезом вводят 0,05 мг / кг бупренорфина подкожно.
    2. Используйте севофлуран при 3-3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря рефлекса пальцевого пальца указывает на достаточную анестезию.
    3. Накройте глаза анестезированных мышей офтальмологической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
    4. Удерживайте мышей в положении лежа на маленьком столе.
    5. Бритье живота с помощью электробритвы (в качестве альтернативного варианта можно использовать депиляционный крем) и дезинфицировать, по крайней мере, в 3 раза клорексидин / йод и 70% спирта.
    6. Покройте хирургическое поле стерильными драпировками.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Использование периоперационных антибиотиков является необязательным и регулируется институциональными рекомендациями.
  2. Средняя лапаротомия и облучение слепой кишки
    1. Используйте ножницы (скальпели можно использовать альтернативно), чтобы сделать небольшой срединный разрез (3 - 5 мм) кожи на нижней части живота. Возьмите мускулатуру брюшной стенки с помощью щипцов и аккуратно поднимите ее ножницами, открыв таким образом брюшную полость.
    2. Выявление и тщательное экстериоризацию слепой кишки с помощью атравматических щипцов. Поместите слепой конец мешка слепой кишки на живот, указывающий краниально.
    3. После экстериоризации держите влагу в сырой воде, используя теплые солевые тампоны.
  3. Ортотопическая инъекция, закрытие брюшной полости и послеоперационное выздоровление
    1. Для инъекции intracecal используйте стандартный 1 мл шприц с 30-футовым канюлем. Установите этот шприц на микроинъекционный насос, который, в свою очередь, установлен на микроманипулятор.
    2. Тщательно схватите кончик слепой кишки с помощью атравматических щипцов и аккуратно разгладьте его, поглаживая его внизD со вторым набором щипцов, смоченных теплым солевым раствором.
    3. Поместите канюлю прямо над слепой кишкой.
    4. Выполните следующие шаги под визуальным контролем с помощью бинокулярного хирургического микроскопа.
    5. Тщательно схватите слепую кишку двумя атравматическими щипцами на обоих концах экстерриториальной части слепой кишки, слегка растяните ее, а затем медленно потяните ее через канюлю, которая расположена параллельно и прямо над ней. Крайне важно не перфорировать всю стенку кишечника (таким образом, вставляя клетки в просвет), а также не перфорировать серозную оболочку за пределы начальной точки проникновения, так как это приведет к утечке и перитонеальному распространению.
      1. Переместите кишечник в направлении канюли, а не канюлю к кишечнику. Держите и растяните кишечник между двумя щипцами. Руки хирурга должны опираться на поверхность, чтобы уменьшить тремор.
    6. Внедрение клеток между серозной (рассматривается как очень тонкая, полупрозрачная накладка вышеИнтрамуральные кровеносные сосуды) и мышцы. Поэтому канюлю следует визуально размещать над кровеносными сосудами и под тонкой прозрачной мембраной.
    7. Используйте ножной переключатель, чтобы начать инъекцию, чтобы уменьшить тремор, пока канюля находится внутри стенки кишечника.
    8. Как только канюля встанет на место, начните инъекцию. Используйте длительность 20 с, что приводит к установке 1 мкл / с на блоке управления насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инъекция в поврежденный кровеносный сосуд или вблизи него приводит к прямому внутрисосудистому распространению и отдаленному метастазированию и поэтому его следует избегать.
    9. После завершения инъекции осторожно удалите канюлю, потянув ее назад.
    10. Поместите сухой тампон под слепой кишкой, а затем тщательно промойте слепую кишку дистиллированной водой, чтобы лизировать просочившиеся клетки и тем самым предотвратить искусственное перитонеальное распространение.
  4. Закрытие брюшной полости и послеоперационное восстановление
    1. После rВдавливая, аккуратно возвращайте слепую кишку в брюшную полость.
    2. Закройте брюшную стенку с помощью быстрорастворимых швов на 6-0.
    3. Закройте кожу хирургическими раневыми зажимами.
    4. Поместите мышь на карту нагрева, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
    5. Внимательно наблюдайте послеоперационное состояние мышей в течение следующих 48 часов. В случае дистресса обработайте 0,05 мг / кг бупренорфина каждые 12 ч.
    6. Наблюдайте за мышами не реже одного раза в день за признаки дистресса из-за роста опухоли.

3. Выделение циркулирующих опухолевых клеток из образцов цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ. Получают кровь путем чрескожной сердечной пункции у анестезированных мышей, за которой следует эвтаназия. В идеале 1000 мкл крови втягивают в шприц, предварительно заполненный 100 мкл антикоагулянта (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или гепарин). Использовать анти-человеческий-EpCAM (адгезия эпителиальных клетокМолекула) для идентификации КТК. Это очень хорошо работает, если линии мышиных эпителиальных клеток используются в модели мыши. Для других приборов могут потребоваться различные антитела.

  1. Обогащение КТК:
    1. Предварительно заполните 15 мл пробирки средой с градиентом плотности 5 мл и осторожно переносите кровь в пробирку объемом 15 мл.
    2. Центрифуга (30 минут при 300 xg без тормоза) и осторожно удалите верхний супернатант.
    3. Вылейте остаток в новую 15-миллилитровую пробирку и центрифугу (15 минут, 300 xg с тормозом).
    4. Восстановите интерфазу, содержащую мононуклеарные клетки (отбросьте остальную часть), и промойте клетки дважды PBS.
    5. Ресуспендируют гранулу в 200 мкл PBS / 1% ЭДТА и добавляют 4 мкл антитела EpCAM. Инкубируйте 20 минут на льду в темноте.
  2. Скрининг и сбор
    1. Подготовьте следующий буфер (в дальнейшем называемый собирающим буфером): PBS + 10% фетальная телячья сыворотка (FCS) + 1% пенициллин / SТрептомицин (1%) + 0,8% ЭДТА.
    2. Используйте ручку PAP, чтобы нарисовать круг диаметром 1 см в стерильной чашке Петри на 6 см (предотвращает диспергирование жидкости в тарелке) и пипеткой 700 мкл буфера для сбора в этот круг.
    3. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в буфер для сбора 700 мкл в пределах круга. Проверьте плотность клеток с помощью микроскопа. Разделите образец на разные блюда, если он слишком плотный.
    4. Подождите, пока ячейки опустится (~ 5 мин).
    5. Экранная суспензия клеток для окрашенных клеток (= EpCAM-положительных).
    6. Как только ячейка обнаружена, подберите ячейку с микроманипулятором и поместите в буфер 50 мкл в зависимости от предполагаемого анализа ниже по потоку ( например , буфера для экстракции РНК или среды для культивирования).
    7. В зависимости от предполагаемых анализов нижестояния изолируйте отрицательные клетки EpCAM и / или среду в качестве отрицательных контролей.
    8. Продолжайте анализы ниже по течению ( например , клеточная культура, ПЦР).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешное и воспроизводимое генерирование колоректальных опухолей в этой модели критически зависит от точной инъекции клеток без утечки или утечки. Если это будет достигнуто, эта модель чрезвычайно надежна и очень редко приводит к искусственному перитонеальному распространению. Кинетика роста опухолей, а также их картины распространения зависят от биологии используемых органоидов и клеток. 15 В то время как клетка НСТ116 надежно метастазировать в печень в этой модели, формы SW620 клеток Ортотопической опухоли, но не метастазирует. 15

Использование клеток HCT116 в этой модели достоверно приводит к умирающим мышам в течение 35 дней после инъекции опухолевых клеток. Первичные опухоли имеют размер около 10 мм ( рис. 1А и рис. 2А ), метастазы в печени ( рисунок 1В Ong> и Figure 2B ), метастазы в легкие ( рис. 1C и рис. 2C ) и циркулирующие опухолевые клетки ( рис. 3 ) практически неизменно присутствуют. У мышей, несущих опухоли HCT116, через 35 дней после инъекции опухолевых клеток CTCs присутствуют в высокой частоте и количестве и могут быть легко выделены для последующих анализов ( рисунок 3 ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Макроскопические снимки после вскрытия через 35 дней после ортотопической инъекции HCT116 человеческих CRC-клеток в мышей NSG. ( A ) Первичная опухоль (пунктирная линия) в слепой кишке. ( B ) Печень с множественными метастазами. ( C ) Метастазы легких (стрелки).1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Гистологические изображения органов, показанных на рисунке 1 . ( A ) Первичная опухоль (H & E). ( B ) Метастазы печени (H & E). ( C ) Метастазы легких (анти-EpCAM-иммуногистохимия). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Циркулирующие опухолевые клетки (клетки HCT116 у мышей NSG, 35 дней после инъекции опухолевых клеток). Яркое поле ( A B )) изображения CTC в фракции мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на их доклинически доказанную активность в подкожных моделях мыши, подавляющее большинство новых соединений терпят неудачу в клинических испытаниях и никогда не попадают в клинику. 11 Эта очевидная недостаточность подкожных моделей мыши для точного моделирования биологии и моделей роста опухолей привела к разработке моделей ортотопических мышей, основанных на инъекции опухолевых клеток непосредственно в исходный орган.

Модели ортотопической мыши способны имитировать биологию и распространять солидные опухоли гораздо точнее, чем подкожные модели. 15 Тем не менее, основные недостатки являются плохой воспроизводимостью особенно в технически сложных органах , такие как полые органы, а также технически сложный мониторинг роста опухоли. Поэтому в нашей модели мы сосредоточились на размере опухоли в заранее определенный момент времени, а не на повторных процедурах визуализации, что ограничивает количество техническихА также для стрессовых экзаменов животных. Описанную здесь модель можно использовать для различных применений, таких как характеристика линий опухолевых клеток, 15 исследований биологии опухолей и их распространения, а также терапевтических испытаний. 17 Очевидные конечные точки - это размер первичной опухоли и количество отдаленных метастазов, но также могут быть использованы более сложные конечные точки, такие как номера CTC 17 или способы визуализации.

Наиболее важным шагом в нашем протоколе является инъекция подрезональных опухолевых клеток. Это требует практики и должно выполняться всегда под прямым визуальным контролем. Если осадок находится где-то еще, но под серозной, но выше слизистой, то не будет никакого роста опухоли вообще или непредсказуемого роста и распространения, что делает результаты несравненными. Другими возможными причинами отсутствия развития опухоли являются нежизнеспособные клетки ( например, </ Em>, из-за длительного промежутка времени между сбором урожая и инъекцией клеток) или не полностью сингенных мышей. Это возможно, если используются мыши C57Bl / 6; Так как существует множество субстратов C57Bl / 6 ( например , C57Bl / 6J и C57Bl / 6N), которые показывают разные генетические и фенотипические различия 22, которые также отражаются в показателях опухоли. 23

Описанная здесь высоко контролируемая технология инъекций приводит к высоковоспроизводимому росту и распространению опухоли и отличает эту модель от ранее описанных ортотопических моделей. 24 Кроме того, ополаскивание слепой кишки дистиллированной водой после инъекции опухолевых клеток резко снижает скорость искусственного распространения перитонеальной ткани; Поэтому, если в нашей модели происходит перитонеальный карциноматоз, это, скорее всего, результат биологии клеточной линии, а не утечки ятрогенной опухолевой клетки.

Ограничения этого мOdel являются реципиентными мышами, которые должны быть иммунодефицитными, если необходимо использовать клеточные линии человека. Это серьезно ограничивает применение модели в иммунологических исследованиях. Однако это ограничение можно преодолеть с помощью сингенных клеточных линий мыши или органоидов (неопубликованные данные). Другим ограничением является использование самих клеточных линий. Линии опухолевых клеток часто очень анапластичны, что оставляет вопросы об их репрезентативности исходной биологии опухоли. Это ограничение отсутствует в генетически модифицированных моделях мыши (GEMM), которые развивают новую опухоль путем введения тканеспецифических онкогенных мутаций. 12 Такие GEMM обычно основаны на условных мутациях зародышевой линии ( например, на флоксидном геном Apc) и Cre-опосредованной активации мутаций либо локальной инфекцией адено-креатом 25 , 27 , 28, либо тканеспецифическим промотором, стимулирующим creвыражение. 29 , 30 , 31 Однако такие модели часто требуют обширных пересечений и имеют сильно изменчивую биологию. Если в представленной здесь модели используются первичные клеточные линии, ограничение низкой репрезентативности можно преодолеть без потери других преимуществ нашей модели, таких как воспроизводимость и относительная экономическая эффективность.

Другим ограничением предлагаемого здесь метода является зависимость от EpCAM в качестве поверхностного маркера. Хорошо известно, что EpCAM может быть потерян во время EMT и что есть доля CTC, которые являются отрицательными по EpCAM. 10 , 15 Следовательно, в зависимости от цели эксперимента и клеточных линий, используемых для инъекций, могут использоваться другие средства идентификации ( например , GFP-маркировка клеток перед инъекцией).

В заключение здесь представлена ​​модель cОн представляет собой гибкий инструмент для изучения развития опухоли и ее распространения в контексте исходной микроокружности опухоли в толстой кишке. Если используются метастатические клеточные линии, он достоверно имитирует распространение опухолевых клеток во всех соответствующих сайтах для CRC, включая CTCs в кровотоке. Поэтому это полезный инструмент для изучения фенотипических изменений при росте и распространении опухоли и позволяет проводить повторную изоляцию и характеризацию КТК в CRC. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Германским исследовательским фондом (WE 3548 / 4-1) и Роланд-Эрнст-Штифтун фюр-Гесундхицвезен (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365, (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1, (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397, (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20, (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112, (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19, (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263, (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138, (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74, (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5, (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33, (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6, (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4, (11), e1042201 (2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7, (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6, (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74, (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159, (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100, (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14, (7), R82 (2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347, (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7, (351), ra107 (2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61, (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8, (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (42), 11859-11864 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics