Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Apesar das vantagens de uma fácil aplicabilidade e custo-eficácia, os modelos de ratos subcutâneos têm limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse ortotópicos foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos vazios, como o intestino grosso. Para produzir tumores uniformes que crescem e metastatizam de forma confiável, são críticas técnicas padronizadas de preparação e injeção de células tumorais.

Desenvolvemos um modelo de câncer colorretal ortopsico (CRC) que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. As células tumorais de ambos os tumores primários, linhas celulares bidimensionais (2D) ou organoides tridimensionais (3D) são injetadas no ceco e, dependendo do potencial metastático das células tumorais injetadas, formam tumores altamente metastáticos. Além do que, além do mais,Os CTCs podem ser encontrados regularmente. Aqui descrevemos a técnica de preparação de células tumorais a partir de linhas celulares 2D e organoídeos 3D, bem como tecido tumoral primário, técnicas cirúrgicas e de injeção, bem como o isolamento de CTCs dos camundongos portadores de tumor e dicas atuais para solução de problemas.

Introduction

O câncer colorretal (CRC) é uma das causas mais comuns de morte por câncer nos países ocidentais. 1 Embora o tumor primário possa ser frequentemente ressecado, a ocorrência de metástases à distância piora dramaticamente o prognóstico e muitas vezes leva à morte. 2 , 3 A correlação biológica da metástase é a circulação de células tumorais (CTCs), que se destacam do tumor, sobrevivem em circulação, se juntam ao epitélio no órgão alvo, invadem o órgão e, finalmente, superam novas lesões. 4 Embora os CTCs sejam de relevância prognóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , sua biologia é parcialmente entendida como resultado de sua extrema raridade no CRC. 10

Os modelos de mouse são um poderoso tOol para estudar vários aspectos da biologia do câncer. Os modelos clássicos de tumor subcutâneo são produzidos por injeção subcutânea de células tumorais em camundongos receptores, que podem ser imunocompetentes (se forem utilizadas células de tumor murino singenésicas) ou imunodeficientes. Os modelos de tumor subcutâneo são baratos e produzem dados rapidamente; Seu crescimento de tumor de ponto final pode ser medido facilmente e não invasivamente. No entanto, 88% dos novos compostos que demonstraram atividade antitumoral em tais modelos falham nos ensaios clínicos. 11 Isto é em parte devido a diferenças entre espécies entre humanos e camundongos; No entanto, uma grande parte dessa falha é devido ao baixo valor preditivo de modelos subcutâneos de mouse.

Os modelos de ratos ortotópicos, nos quais as células tumorais são injetadas no órgão de origem e, portanto, crescem em seu microambiente original, são, portanto, cada vez mais utilizados na pesquisa do câncer. 11 , 12 , 13 , 14 Os modelos ortotópicos não apenas simulam as condições locais de crescimento tumoral; Como resultado do sítio anatômico correto do crescimento tumoral, os modelos de ratos ortotópicos também permitem a simulação realista de metástases e, portanto, são usados ​​para estudar biologia 8 , 15 e 16 de CTC ou sua resposta a diferentes tratamentos em CRC. 13 , 17

Uma grande desvantagem dos modelos de mouse ortotópicos é a sua complexidade técnica. Dependendo do órgão em que as células devem ser injetadas, a curva de aprendizado até que o experimentador seja capaz de induzir tumores reprodutíveis é bastante longa. Isto aplica-se especialmente aos modelos de câncer colorretal, uma vez que as células tumorais precisam ser injetadas na parede intestinal, o que muitas vezes resulta em perfuração, vazamento de células tumorais ou perda de células tumorais endoluminais. Isso é umO artigo pretende descrever o método de preparação celular a partir de amostras de tecido primário, linhas celulares 2D e cultura organo 3D e sua injeção no ceco de camundongos. A técnica descrita aqui leva a tumores altamente uniformes e, dependendo da biologia do tumor da linha celular usada para injeção, a formação reprodutível de metástases à distância e CTC nos camundongos receptores. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Os experimentos com animais apresentados aqui foram revisados ​​e permitidos de forma independente por um comitê institucional e governamental de Cuidados e Uso de Animais e foram conduzidos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciências de Animais de Laboratório (FELASA). Todas as medidas possíveis foram tomadas para minimizar o sofrimento, incluindo anestesia e analgesia ou, se necessário, eutanásia prematura.

1. Preparação de células e organismos orgânicos

NOTA: Use um volume de 20 μL com 100.000 células para cada injeção. Use a matriz da membrana basal (BMM) para evitar vazamentos e garantir a injeção padronizada. Para garantir resultados reprodutíveis, realize ensaios de autenticação de linha celular ( por exemplo , via perfil STR) em intervalos regulares.

  1. Preparação de suspensões celulares primárias de tecido fresco
    NOTA: sempre trabalhe em condições estéreis. Transferência imediata do recém-chegadoO tecido ressecado da sala de operação para o laboratório em gelo é necessário para assegurar uma alta viabilidade das células.
    O bem-estar do paciente e o tratamento ideal sempre devem ser a primeira prioridade. Portanto, amostras de tecido para pesquisa devem ser obtidas de maneira que não interfira com o subsequente tratamento patológico e o estadiamento do tumor ressecado. Na maioria dos casos, é razoável ter as amostras para pesquisas obtidas por um patologista treinado para garantir a não interferência no diagnóstico patológico.
    1. Imediatamente após a remoção estéril do espécime ressecado (idealmente ~ 1 cm 3 ), coloque a amostra de tecido em um tubo de 50 mL pré-cheio com 20-30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazene o tubo no gelo e transfira-o imediatamente para o laboratório.
    2. Coloque o tecido em uma placa de Petri e lave-o duas vezes com uma abundância de PBS para remover o sangue restante.
    3. Corte o tecido em pequenos pedaços (~ 2-4 mm) com uma scaLpel ( por exemplo , com uma lâmina # 20 ou # 36).
    4. Use o dissociador de acordo com as instruções do fabricante para dissociar ainda mais o tecido do tumor a uma suspensão de célula única. Alternativamente, use outros protocolos de digestão de tumores enzimáticos.
    5. Contar as células da suspensão de célula única resultante ( por exemplo , em um contador de cunha ou um hemocitómetro).
    6. Centrifugação (5 min a 1.500 xg) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS.
    7. Ressuspender as células no BMM em uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo.
  2. Preparação de linhas celulares para injeção
    1. Cultive todas as linhas celulares de câncer colorretal sob condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ) e prepará-las no dia da cirurgia.
    2. Colhe as células de acordo com os protocolos de cultura de células padrão, conte as células ( por exemplo , em um contador de cúpula ou um hemocitómetro) e calcule a reqQuantidade estimada para todas as injeções, dependendo do número de animais a serem injetados.
    3. Prepare 3-5x do volume realmente necessário para explicar as perdas de pipetagem e o volume morto da seringa de injeção.
    4. Centrifugação (5 min a 1.500 g) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS.
    5. Ressuspender as células no BMM em uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo.
  3. Preparação de orgóides
    NOTA: Todas as culturas de organoides 3D são cultivadas sob condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ). Protocolos detalhados para a cultura de organoides foram publicados antes. 18 , 19 , 20 Semelhante às linhas celulares convencionais, recomendamos um volume de 20 μL de BMM com 100.000 células por injeção. Os organoides são preparados no dia da cirurgia da seguinte forma:
    1. Prepare o seguinte meio (no seguintePara DMEM / F12 +++): Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% de glutamina (200 mM) + 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Preencha os tubos de 15 mL com 1 mL de DMEM / F12 +++.
    3. Elimine cuidadosamente os organoides da superfície da placa de cultura e transfira os conteúdos de 3 a 5 poços para um tubo de 15 mL.
    4. Corte cuidadosamente os organoids em pedaços menores, pipetando-os para cima e para baixo com uma pipeta de vidro estendida.
    5. Adicionar 5 mL de DMEM / F12 +++ ao tubo, seguido de centrifugação a 1000 xg durante 5 min.
    6. Após centrifugação, remova o sobrenadante, ressuspenda o sedimento em 600 μL de tampão de dissociação enzimática e transfira a suspensão para um poço de uma placa de 6 poços.
    7. Incubar a 37 ° C durante 1-5 minutos e, em seguida, cuidadosamente pipetar a suspensão para cima e para baixo para dissolver os organoides.
      NOTA: Verifique a digestão através do microscópio; Está completo quando todos os clusters celulares foram dissociadosD para células individuais.
    8. Após a digestão bem sucedida, adicione 1,4 mL de DMEM / F12 +++ para parar a digestão. Em seguida, transferir todos os poços de organoides digeridos para um tubo de 50 mL.
    9. Contar as células e calcular a quantidade necessária para todas as injeções.
    10. Prepare 3 - 5x do volume realmente necessário para contabilizar as perdas de pipetagem e o volume morto da seringa de injeção
    11. Centrifugação (5 min a 1.500 xg) e lavar a suspensão celular duas vezes com PBS.
    12. Ressuspendeu as células em BMM para uma concentração de 5 x 10 6 células / mL e mantê-las em gelo.

2. Orthotopic Mouse Model

  1. Preparação de animais receptores para cirurgia
    NOTA: Use ratos NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) de 6-8 semanas de idade como destinatários. 21 NSG estão entre os camundongos mais imunocomprometidos, sem células maduras B, T e NK, juntamente com múltiplos outros imunes deFects. 21 Eles crescem de forma confiável, mesmo que sejam baixados números de células e sejam altamente propensos a metástases à distância. Os ratos NSG são criadores excelentes e podem ser mantidos em unidades convencionais de patógenos livres (SPF).
    1. Antes da primeira incisão, injete 0,05 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea.
    2. Use sevoflurano em 3-3,5 vol% para anestesia geral. Uma perda do reflexo de pinça do dedo do pé indica anestesia suficiente.
    3. Cubra os olhos dos ratos anestesiados com pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
    4. Conduza os camundongos em posição supina numa pequena mesa.
    5. Raspar o abdômen com uma máquina de barbear elétrica (o creme depilatório pode ser usado alternativamente) e desinfectar com pelo menos 3 vezes clorhexidina / iodo e 70% de álcool alternativamente.
    6. Cubra o campo cirúrgico com cortinas estéreis.
      NOTA: O uso de antibióticos perioperatórios é opcional e está sujeito a diretrizes institucionais.
  2. Laparotomia da linha média e exposição do ceco
    1. Use tesoura (os escalpelos podem ser usados ​​alternativamente) para fazer uma pequena incisão da linha média (3 - 5 mm) da pele na parte inferior do abdômen. Pegue a musculatura da parede abdominal com fórceps e cuidadosamente o incise com uma tesoura, abrindo assim a cavidade abdominal.
    2. Identificar e externalizar cuidadosamente o ceco com fórceps atraumáticos. Posicione a bolsa final cega do ceco no abdômen apontando de forma cranial.
    3. Uma vez exteriorizado, mantenha o cecum úmido usando esfregões salinos quentes em todos os momentos.
  3. Injeção ortotópica, fechamento do abdômen e recuperação pós-operatória
    1. Para injeção intracecal, use uma seringa padrão de 1 mL com uma cânula de 30 G. Monte esta seringa em uma bomba de microinjeção, que por sua vez é montada em um micromanipulador.
    2. Cuide cuidadosamente a ponta do ceco com fórceps atraumáticos e suavemente alise-a acariciando-aD com um segundo conjunto de fórceps umedecido com solução salina quente.
    3. Posicione a cânula diretamente acima do ceco.
    4. Execute as seguintes etapas sob controle visual com um microscópio cirúrgico binocular.
    5. Cuide cuidadosamente o ceco com duas pinças atraumáticas em ambas as extremidades da parte exteriorizada do ceco, estique-a ligeiramente e depois puxe-a lentamente sobre a cânula que está posicionada em paralelo e diretamente acima. É crucial não perfurar toda a parede do intestino (assim, injetar as células no lúmen), bem como não perfurar a serosa além do ponto inicial de penetração, pois isso levaria a vazamento e disseminação peritoneal.
      1. Mova o intestino em direção à cânula, não a cânula em direção ao intestino. Segure e estique o intestino entre duas fórceps. As mãos do cirurgião devem descansar sobre uma superfície para reduzir o tremor.
    6. Injetar as células entre a serosa (vista como revestimento muito fino e translúcido acima daE vasos sanguíneos intramurais) e muscularis. Por conseguinte, a cânula deve ser colocada visualmente acima dos vasos sanguíneos e embaixo da fina membrana translúcida.
    7. Use um interruptor de pé para iniciar a injeção para reduzir o tremor enquanto a cânula está dentro da parede do intestino.
    8. Uma vez que a cânula está em posição, comece a injeção. Use uma duração de 20 s, resultando em 1 μL / s de configuração na unidade de controle da bomba.
      NOTA: A injeção dentro ou perto de um vaso sanguíneo danificado conduz a disseminação intravascular direta e metástase à distância e, portanto, deve ser evitada.
    9. Após a conclusão da injeção, remova cuidadosamente a cânula puxando-a para trás.
    10. Coloque um cotonete seco sob o ceco e, em seguida, enxágue completamente o ceco com água destilada para liar células vazias e, assim, evite a disseminação peritoneal artificial.
  4. Encerramento do abdômen e recuperação pós-operatória
    1. Depois deInsistente, gentilmente retorna o ceco à cavidade abdominal.
    2. Feche a parede abdominal com suturas de roda rapidamente absorvíveis de 6-0.
    3. Feche a pele com os clipes da ferida cirúrgica.
    4. Coloque o mouse em um mapa de aquecimento configurado para 38 ° C até se recuperar completamente da anestesia.
    5. Observe de perto a condição pós-operatória dos ratos nas 48 horas seguintes. Em caso de angústia, tratar com 0,05 mg / kg de buprenorfina a cada 12 h.
    6. Monitore os ratos pelo menos uma vez por dia para detectar sinais de angústia devido ao crescimento do tumor.

3. Isolamento de células tumorais circulantes de amostras de sangue inteiro

NOTA: Obtenha sangue por punção cardíaca transcutânea em ratos anestesiados, seguido de eutanásia. Idealmente, 1000 μL de sangue são empurrados para uma seringa pré-cheia com 100 μL de um anticoagulante (ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) ou heparina). Use um anti-humano-EpCAM (adesão de células epiteliaisMolécula) anticorpo para identificar os CTCs. Isso funciona muito bem se as linhas de células epiteliais humanas forem usadas no modelo do mouse. Para outros aparelhos, diferentes anticorpos podem ser necessários.

  1. Enriquecimento de CTC:
    1. Preencha os tubos de 15 mL com meio de gradiente de densidade de 5 mL e transfira cuidadosamente o sangue para o tubo de 15 mL.
    2. Centrifugação (30 min a 300 xg sem freio) e remova cuidadosamente o sobrenadante superior.
    3. Despeje o resto em um novo tubo de 15 mL e centrifugue (15 min, 300 xg com freio).
    4. Recupere a interfase que contém as células mononucleares (descarte o resto) e lave as células duas vezes com PBS.
    5. Ressuspender o sedimento em 200 μL de PBS / 1% de EDTA e adicionar 4 μL de anticorpo EpCAM. Incube 20 min no gelo no escuro.
  2. Triagem e escolha
    1. Prepare o seguinte buffer (a seguir denominado buffer de seleção): PBS + 10% de soro de vitelo fetal (FCS) + 1% de penicilina / STreptomicina (1%) + 0,8% de EDTA.
    2. Use uma caneta PAP para desenhar um círculo de ~ 1 cm em uma placa de Petri estéril de 6 cm (evita que o fluido se disperse no prato) e pipetar 700 μL de tampão de colheita para este círculo.
    3. Adicione 50 μL de suspensão celular ao tampão de picking de 700 μL dentro do círculo. Verifique a densidade das células com o microscópio. Divida a amostra em pratos diferentes se for muito denso.
    4. Aguarde as células se acalmarem (~ 5 min).
    5. Teste a queda da suspensão celular para células coradas (= EpCAM-positivas).
    6. Uma vez que uma célula é encontrada, escolha a célula com o micromanipulador e coloque-a em tampão de 50 μL, dependendo da análise a jusante pretendida ( p . Ex. , Tampão de extração de RNA ou meio de cultura).
    7. Dependendo das análises a jusante pretendidas, isole células e / ou medidores negativos para EpCAM como controles negativos.
    8. Proceda com análises a jusante ( por exemplo , cultura celular, PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A geração bem sucedida e reprodutível de tumores colorretais neste modelo depende criticamente da injeção precisa das células sem derramamento ou vazamento. Se isso for alcançado, este modelo é extremamente confiável e muito raramente resulta em disseminação peritoneal artificial. A cinética de crescimento dos tumores, bem como os seus padrões de disseminação, dependem da biologia dos organoídeos e células utilizados. 15 Enquanto as células HCT116 apresentam metástase confiável no fígado neste modelo, a célula SW620 forma tumores ortotópicos, mas não metástase. 15

O uso de células HCT116 neste modelo resulta de forma confiável em camundongos moribundos dentro de 35 dias da injeção de células tumorais. Os tumores primários medem cerca de 10 mm de tamanho ( Figura 1A e Figura 2A ), metástases hepáticas ( Figura 1B Ong> e Figura 2B ), metástases pulmonares ( Figura 1C e Figura 2C ) e células tumorais circulantes ( Figura 3 ) estão quase invariavelmente presentes. Em ratos com tumores HCT116, 35 dias após a CTC de injeção de células tumorais estão presentes em alta freqüência e quantidade e podem ser facilmente isolados para análises a jusante ( Figura 3 ).

figura 1
Figura 1: Imagens macroscópicas após a dissecação 35 dias após a injeção ortopea de HCT116 células CRC humanas em ratos NSG. ( A ) Tumor primário (linha tracejada) no ceco. ( B ) Fígado com metástases múltiplas. ( C ) Metástases pulmonares (setas).1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2: Imagens histológicas dos órgãos mostrados na Figura 1 . ( A ) Tumor primário (H & E). ( B ) metástase hepática (H & E). ( C ) Metástase pulmonar (imuno-histoquímica anti-EpCAM). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3
Figura 3: Células tumorais circulantes (células HCT116 em ratos NSG, 35 dias após a injeção de células tumorais). Campo brilhante ( A B )) imagens de CTCs na fração de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Apesar de sua atividade pré-clinicamente comprovada em modelos de ratos subcutâneos, a grande maioria dos novos compostos falha em ensaios clínicos e nunca atinge a clínica. 11 Esta óbvia insuficiência de modelos subcutâneos de ratos para simular com precisão a biologia e os padrões de crescimento dos tumores levou ao desenvolvimento de modelos de ratos ortotópicos baseados na injeção de células tumorais diretamente no órgão original.

Os modelos de ratos ortotópicos são capazes de simular a biologia e a disseminação de tumores sólidos muito mais precisamente do que os modelos subcutâneos. 15 No entanto, as principais desvantagens são a reprodutibilidade fraca, especialmente nos órgãos tecnicamente exigentes, como os órgãos vazios, bem como o monitoramento tecnicamente exigente do crescimento do tumor. Em nosso modelo, enfocamos o tamanho do tumor em um ponto de tempo pré-definido em vez de procedimentos de imagem repetidos, o que limita o número de técnicasBem elaborado e para os exames estressantes dos animais. O modelo aqui descrito pode ser usado para várias aplicações, como a caracterização de linhas celulares tumorais, a investigação 15 de biologia e disseminação de tumores, bem como ensaios terapêuticos. 17 Os pontos finais óbvios são o tamanho do tumor primário e o número de metástases à distância, mas os pontos finais mais elaborados, como os números CTC 17 ou as modalidades de imagem, também podem ser empregados.

O passo mais crítico do nosso protocolo é a injeção de células tumorais de subserosal. Requer prática e deve ser realizada em todos os momentos sob controle visual direto. Se o depósito estiver em outro lugar, exceto abaixo da serosa, mas acima da mucosa, haverá crescimento tumoral ou crescimento ou disseminação imprevisível, tornando os resultados incomparáveis. Outras razões possíveis para a falta de desenvolvimento tumoral incluem células não viáveis ​​( por exemplo, </ Em>, devido ao longo período de tempo entre a colheita e injeção das células) ou não ratos completamente singênicos. Isto é possível se forem usados ​​ratos C57Bl / 6; Uma vez que existem múltiplas restrições de C57Bl / 6 ( por exemplo , C57Bl / 6J e C57Bl / 6N) que mostram diferenças genéticas e fenotípicas distintas 22 que também se reflectem nas taxas de toma de tumor. 23

A técnica de injeção altamente controlada aqui descrita leva a um crescimento e disseminação de tumores altamente reprodutíveis e distingue este modelo de modelos ortopóticos anteriormente descritos. 24 Além disso, enxaguar o ceco com água destilada após a injeção de células tumorais reduz dramaticamente a taxa de disseminação peritoneal artificial; Portanto, se a carcinomatose peritoneal ocorre em nosso modelo, é provavelmente o resultado da biologia da linha celular em vez de uma fuga de células tumorais iatrogênicas.

Limitações deste mOdel são os camundongos receptores que têm de ser imunodeficientes se forem utilizadas linhas celulares humanas. Isso limita severamente a aplicação do modelo em estudos imunológicos. No entanto, esta limitação pode ser superada pelo uso de linhas de células murinas sinogênicas ou organoides (dados não publicados). Outra limitação é o uso das próprias linhas celulares. As linhas de células tumorais são muitas vezes altamente anaplásicas, o que deixa questões sobre a sua representatividade da biologia do tumor original. Esta limitação não está presente em modelos de ratos geneticamente modificados (GEMMs), que desenvolvem um novo tumor pela introdução de mutações oncogênicas específicas de tecido. 12 Esses GEMMs geralmente são baseados em mutações de linha germinal condicionais ( por exemplo, um gene Apc floxed) e ativação mediada por Cre de mutações, por infecção local com adeno-cre 25 , 27 , 28 ou um criador específico de tecido específicoexpressão. 29 , 30 , 31 No entanto, esses modelos muitas vezes exigem cruzamentos extensivos e possuem uma biologia altamente variável. Se as linhas celulares primárias são usadas no modelo aqui apresentado, a limitação da baixa representatividade pode ser superada sem a perda das outras vantagens do nosso modelo, como a reprodutibilidade e a relação custo-eficácia.

Outra limitação da técnica aqui proposta é a dependência da EpCAM como marcador de superfície. É bem sabido que a EpCAM pode ser perdida durante a EMT e que há uma fração de CTCs que são EpCAM negativos. 10 , 15 Portanto, dependendo do objetivo do experimento e das linhas celulares utilizadas para injeção, podem ser utilizados outros meios de identificação ( por exemplo , rotulagem GFP das células antes da injeção).

Em conclusão, aqui apresentou o modelo cInstitui uma ferramenta flexível para estudar o desenvolvimento e disseminação do tumor no contexto do microambiente original do tumor no cólon. Se forem usadas linhas celulares metastáticas, simula fielmente a disseminação de células tumorais em todos os sites relevantes para CCR, incluindo CTC na corrente sanguínea. É, portanto, uma ferramenta útil para estudar as alterações fenotípicas durante o crescimento e disseminação do tumor e permite o isolamento repetido e a caracterização de CTCs em CRC. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365, (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1, (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397, (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20, (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112, (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19, (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263, (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138, (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74, (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5, (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33, (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6, (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4, (11), e1042201 (2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7, (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6, (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74, (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159, (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100, (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14, (7), R82 (2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347, (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7, (351), ra107 (2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61, (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8, (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (42), 11859-11864 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics