Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

Cancer Research

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Summary

Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

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Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

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Abstract

Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo sottocutaneo presentano gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli di topo ortotopico sono stati introdotti per superare queste limitazioni; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente negli organi cavi come il grande intestino. Al fine di produrre tumori uniformi che crescono e metastasiano in modo affidabile, le tecniche standardizzate per la preparazione e l'iniezione delle cellule tumorali sono critiche.

Abbiamo sviluppato un modello di topo orthotopico del cancro del colon-retto (CRC) che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale e studi terapeutici. Le cellule tumorali da tumori primari, linee cellulari 2D (2D) o organoidi tridimensionali (3D) vengono iniettati nel cecum e, a seconda del potenziale metastatico delle cellule tumorali iniettate, formano tumori altamente metastatici. Inoltre,I CTC possono essere trovati regolarmente. Qui descriviamo la tecnica della preparazione delle cellule tumorali da entrambe le linee cellulari 2D e dagli organoidi 3D, nonché dal tessuto tumorale primario, le tecniche chirurgiche e di iniezione, nonché l'isolamento di CTC dai topi tumorali e suggerimenti per la risoluzione dei problemi.

Introduction

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle cause più comuni della morte del cancro nei paesi occidentali. 1 Mentre il tumore primario può spesso essere ripreso, il verificarsi di metastasi distanti peggiora drasticamente la prognosi e spesso porta alla morte. 2 , 3 Il correlato biologico della metastasi è la circolazione delle cellule tumorali (CTC), che si staccano dal tumore, sopravvivono in circolazione, si attaccano all'epitelio nell'organo bersaglio, invadono l'organo e, in ultima analisi, superano le nuove lesioni. 4 Anche se i CTC sono noti per essere di rilevanza prognostica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 la loro biologia è solo in parte capita a causa della loro estrema rarità nel CRC. 10

I modelli del mouse sono un potente tOol per studiare vari aspetti della biologia del cancro. I modelli classici tumorali sottocutanei vengono prodotti mediante iniezione sottocutanea di cellule tumorali in topi riceventi, che possono essere immunocompetenti (se vengono utilizzate cellule tumorali murine singeniche) o immunodeficienti. I modelli tumorali sottocutanei sono poco costosi e producono dati veloci; La loro crescita del tumore a punto finale può essere facilmente misurata e non invasiva. Tuttavia, l'88% dei nuovi composti che hanno dimostrato un'attività antitumorale in tali modelli non riescono a studi clinici. 11 Ciò è in parte dovuto alle differenze tra le specie umane e topi; Tuttavia, gran parte di questo fallimento è dovuto al basso valore predittivo dei modelli del topo sottocutaneo.

I modelli di topo ortotopico, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell'organo d'origine e quindi crescono nel loro microambiente originale, sono quindi sempre più utilizzate nella ricerca sul cancro. 11 , 12 , 13 , 14 I modelli ortotopici non solo simulano le condizioni di crescita tumorale locale; Come risultato del sito anatomicamente corretto della crescita tumorale, i modelli ortotopici del mouse permettono anche una simulazione realistica di metastasi e sono quindi utilizzati per studiare la biologia CTC 8 , 15 , 16 o la loro risposta a diversi trattamenti in CRC. 13 , 17

Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi ortotopici è la loro complessità tecnica. A seconda dell'organo in cui le cellule devono essere iniettate, la curva di apprendimento finché lo sperimentatore non è in grado di indurre tumori riproducibili è piuttosto lunga. Ciò vale in particolare per i modelli del cancro del colon-retto, in quanto le cellule tumorali devono essere iniettate nella parete intestinale, che spesso provoca perforazioni, perdite di cellule tumorali o perdita cellulare tumorale endoluminale. Questo unL'obiettivo è quello di descrivere il metodo di preparazione cellulare dai campioni di tessuto primario, dalle linee cellulari 2D e dalla cultura organoidea 3D e dalla loro iniezione nel cecum dei topi. La tecnica qui descritta porta a tumori altamente uniformi e, a seconda della biologia tumorale della linea cellulare utilizzata per l'iniezione, la riproducibile formazione di metastasi distinte e CTC nei topi riceventi. 15

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Protocol

Gli esperimenti animali presentati qui sono stati riesaminati e consentiti in maniera indipendente da un comitato istituzionale e governativo per la cura degli animali e sono stati condotti secondo le linee guida dell'Associazione federale delle scienze animali animali (FELASA). Tutte le misure possibili sono state prese per ridurre al minimo la sofferenza, inclusa l'anestesia e l'analgesia o, se necessario, l'eutanasia precoce.

1. Preparazione delle cellule e degli organoidi

NOTA: utilizzare un volume di 20 μL con 100.000 celle per ogni iniezione. Utilizzare la matrice della membrana basamento (BMM) per evitare perdite e assicurare l'iniezione standardizzata. Al fine di garantire risultati riproducibili, eseguire test di autenticazione delle linee cellulari ( ad esempio , tramite profilatura STR) a intervalli regolari.

  1. Preparazione di sospensioni cellulari primarie da tessuti freschi
    NOTA: lavorare sempre in condizioni sterili. Trasferimento immediato del frescoIl tessuto resecato dalla sala operatoria al laboratorio sul ghiaccio è necessario per garantire un'elevata vitalità delle cellule.
    Il benessere del paziente e il trattamento ottimale devono sempre essere la prima priorità. Pertanto, i campioni di tessuto per la ricerca devono essere ottenuti in modo da non interferire con il successivo processo di formazione patologica e la messa a punto del tumore resecato. Nella maggior parte dei casi è pertanto ragionevole avere i campioni per la ricerca ottenuta da un patologo addestrato al fine di garantire la non interferenza con la diagnosi patologica.
    1. Immediatamente dopo la rimozione sterile dal campione resecato (idealmente ~ 1 cm 3 ), posizionare il campione di tessuto in un tubo da 50 ml pre-riempito con 20-30 ml di soluzione salina fosfato-tamponata (PBS). Conservare il tubo sul ghiaccio e trasferirlo immediatamente nel laboratorio.
    2. Mettere il tessuto in un piatto di Petri e lavare due volte con abbondante PBS per rimuovere il sangue rimanente.
    3. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (~ 2-4 mm) con uno scaLpel ( ad esempio , con una lama # 20 o # 36).
    4. Utilizzare il dissociatore secondo le istruzioni del produttore allo scopo di dissociare ulteriormente il tessuto tumorale a una sospensione a singola cellula. In alternativa, utilizzare altri protocolli di digestione tumorale enzimatica.
    5. Conte le cellule della sospensione a singola cellula risultante ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro).
    6. Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS.
    7. Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio.
  2. Preparazione delle linee cellulari per iniezione
    1. Crescere tutte le linee cellulari del cancro colorettale in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) e prepararle al giorno della chirurgia.
    2. Raccogliere le cellule secondo protocolli standard della coltura cellulare, contare le cellule ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro) e calcolare il reqPer tutte le iniezioni a seconda del numero di animali da iniettare.
    3. Preparare 3-5 volte il volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite e del volume morto della siringa d'iniezione.
    4. Centrifugare (5 minuti a 1.500 g) e lavare due volte la cellula con PBS.
    5. Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio.
  3. Preparazione dell'organoide
    NOTA: Tutte le colture organoide 3D sono coltivate in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ). I protocolli dettagliati per la cultura organoide sono stati pubblicati prima. 18 , 19 , 20 Simile alle linee cellulari convenzionali, si consiglia un volume di 20 μL BMM con 100.000 cellule per iniezione. Gli organoidi vengono preparati al giorno della chirurgia come segue:
    1. Preparare il seguente supporto (nel seguito riportatoA DMEM / F12 +++): Medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamina (200 mM) + 1% Penicillina / Streptomicina.
    2. Pre-riempire i tubi da 15 mL con 1 mL di DMEM / F12 +++.
    3. Aspirare con cura gli organoidi dalla superficie della piastra di coltura e trasferire il contenuto di 3 a 5 pozzetti in un tubo da 15 ml.
    4. Coltivare con cura gli organoidi in pezzi più piccoli pipettandoli su e giù con una pipetta di vetro estesa.
    5. Aggiungere 5 mL DMEM / F12 +++ al tubo, seguita da centrifugazione a 1000 xg per 5 min.
    6. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 600 μl di tampone enzimatico di dissociazione e trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    7. Incubare a 37 ° C per 1-5 minuti e poi pipettare con cura la sospensione in modo da sciogliere gli organoidi.
      NOTA: Verificare la digestione tramite microscopio; È completo quando tutti i cluster di cellule sono stati dissociatiD alle singole celle.
    8. Al termine della digestione, aggiungere 1.4 mL di DMEM / F12 +++ per fermare la digestione. Quindi trasferire tutti i pozzetti degli organoidi digeriti in un tubo da 50 ml.
    9. Conte le celle e calcolare l'importo richiesto per tutte le iniezioni.
    10. Preparare 3 - 5x del volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite di pipettazione e del volume morto della siringa d'iniezione
    11. Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS.
    12. Resuspendevano le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e li mantengono in ghiaccio.

2. Modello ortotopico del mouse

  1. Preparazione degli animali destinatari per la chirurgia
    NOTA: utilizzare i topi 6-8 settimanali NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) come destinatari. 21 NSG sono tra i topi più immunocompromessi, privi di mature cellule B, T e NK insieme a molte altre proteine ​​immunitariefetti. 21 Essi aumentano in modo affidabile i tumori anche se vengono iniettati numeri di cellule basse e sono altamente inclini a metastasi distanti. I topi NSG sono erbivori eccellenti e possono essere conservati in unità convenzionali non specifiche per agenti patogeni (SPF).
    1. Prima della prima incisione, iniettare 0.05 mg / kg di buprenorfina sottocutanea.
    2. Utilizzare sevoflurano a 3-3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita del riflesso del pizzico del piede indica un'anestesia sufficiente.
    3. Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con unguento ophtalmico per evitare l'essiccazione della cornea.
    4. Restringere i topi in posizione supina su un piccolo tavolo.
    5. Rasare l'addome con un rasoio elettrico (la crema depilatoria può essere utilizzata alternativamente) e disinfettare con almeno 3 volte la cloressina / iodio e l'alcool del 70% in alternativa.
    6. Coprire il campo chirurgico con tende sterili.
      NOTA: l'uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto a linee guida istituzionali.
  2. Laparotomia midline e esposizione del cecum
    1. Usare forbici (bisturi possono essere usati alternativamente) per effettuare una piccola incisione mediana (3 - 5 mm) della pelle sull'addome inferiore. Prendete la muscolatura della parete addominale con le pinze e accuratamente incise con forbici, aprendo così la cavità addominale.
    2. Identificare e attentamente esternalizzare il cecum con pinze atraumatiche. Posizionare la cassa cieca del cecum sull'addome che punta cranialmente.
    3. Una volta esteriorizzato, mantenere il cecum umido utilizzando tamponi salini caldi in ogni momento.
  3. Iniezione ortotopica, chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
    1. Per l'iniezione intracecale, utilizzare una siringa standard da 1 ml con una cannula da 30 G. Montare questa siringa su una pompa di microinjection, che viene a sua volta montata su un micromanipulator.
    2. Cogliere con cautela la punta del cecum con le pinze atraumatiche e lisciandola delicatamente accarezzandola in discesaD con un secondo set di pinze inumidito con salina calda.
    3. Posizionare la cannula direttamente sopra il cecum.
    4. Eseguire le seguenti operazioni sotto controllo visivo con un microscopio chirurgico binoculare.
    5. Afferrare con cautela il cecum con due pinze atraumatiche ad entrambe le estremità della parte esterna del cecum, leggermente allungare e poi lentamente tirarlo sopra la cannula posta in posizione parallela e direttamente sopra. È fondamentale non perforare l'intera parete intestinale (iniettando le cellule nel lumen) e non perforare la serosa oltre il punto iniziale di penetrazione, in quanto ciò porterebbe alla perdita e alla diffusione peritoneale.
      1. Spostare l'intestino verso la cannula, non la cannula verso l'intestino. Tenere e allungare l'intestino tra due pinze. Le mani del chirurgo devono poggiare su una superficie per ridurre il tremito.
    6. Iniettare le cellule tra la serosa (considerata come sottile strato traslucido sopra il thE vasi sanguigni intramurali) e la muscularis. La cannula deve quindi essere visivamente posta sopra i vasi sanguigni e sotto la sottile membrana traslucida.
    7. Utilizzare un interruttore a pedale per avviare l'iniezione per ridurre il tremito mentre la cannula è all'interno della parete intestinale.
    8. Una volta che la cannula è in posizione, avviare l'iniezione. Utilizzare una durata di 20 s, con conseguente impostazione di 1 μL / s sull'unità di controllo della pompa.
      NOTA: L'iniezione in o in prossimità di un vascello sanguigno danneggiato porta ad una diffusione intravascolare diretta e a metastasi distanti e pertanto deve essere evitata.
    9. Dopo aver completato l'iniezione, rimuovere attentamente la cannula tirandola indietro.
    10. Posizionare un tampone asciutto sotto il cecum e poi sciacquare accuratamente il cecum con acqua distillata per liscivare le cellule perdute e quindi evitare la diffusione peritoneale artificiale.
  4. Chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
    1. Dopo rInserire, riportare delicatamente il cecum alla cavità addominale.
    2. Chiudere la parete addominale con suture da 6-0 rapidamente assorbibili.
    3. Chiudere la pelle con le ferite chirurgiche.
    4. Posizionare il mouse su una mappa di riscaldamento impostata a 38 ° C finché non sia stata completamente recuperata dall'anestesia.
    5. Osserva attentamente la condizione postoperatoria dei topi per i prossimi 48 h. In caso di disturbi, trattare con 0,05 mg / kg di buprenorfina ogni 12 ore.
    6. Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di sofferenza a causa della crescita del tumore.

3. Isolamento delle cellule tumorali circolanti da campioni di sangue intero

NOTA: Ottenere il sangue mediante puntura cardiaca transcutanea su topi anestetizzati, seguita da eutanasia. Idealmente, 1.000 μL di sangue vengono prelevati in una siringa pre-riempita con 100 μL di un anticoagulante (acido etilendiammetraceico (EDTA) o eparina). Utilizzare una EpCAM anti-umana (adesione delle cellule epitelialiMolecola) per identificare i CTC. Questo funziona molto bene se le linee cellulari epiteliali umane vengono utilizzate nel modello del mouse. Per altri apparecchi potrebbero essere necessari diversi anticorpi.

  1. Arricchimento CTC:
    1. Pre-riempire i tubi da 15 mL con un campione di gradiente di densità di 5 mL e trasferire con cura il sangue nel tubo da 15 mL.
    2. Centrifugare (30 min a 300 xg senza freno) e rimuovere con cura il supernatante superiore.
    3. Versare il resto in un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare (15 min, 300 xg con freno).
    4. Recuperare l'interfaas contenente le cellule mononucleari (scartare il resto) e lavare le cellule due volte con PBS.
    5. Resuspendere il pellet in 200 μl PBS / 1% EDTA e aggiungere 4 μL di anticorpo EpCAM. Incubare 20 minuti sul ghiaccio al buio.
  2. Screening e raccolta
    1. Preparare il seguente buffer (in seguito denominato buffer picking): PBS + 10% siero di vitello fetale (FCS) + 1% Penicillina / STreptomicina (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Utilizzare una penna PAP per disegnare un cerchio di ~ 1 cm in un piatto di Petri sterile da 6 cm (impedisce la dispersione del liquido nel piatto) e pipetta 700 μL di tampone raccoglitore in questo cerchio.
    3. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare al tampone di raccolta di 700 μl all'interno del cerchio. Controllare la densità delle cellule con il microscopio. Distribuire il campione in piatti diversi se è troppo denso.
    4. Attendere che le cellule si stabiliscano (~ 5 min).
    5. Schermate la goccia di sospensione cellulare per le cellule colorate (= EpCAM).
    6. Una volta trovata una cellula, raccogliere la cellula con il micromanipolatore e metterla in un buffer di 50 μL a seconda dell'analisi a valle ( ad es. , Tampone di estrazione RNA o campione di coltura).
    7. A seconda delle analisi a valle previste, isolare le cellule e / o il mezzo negativo di EpCAM come controlli negativi.
    8. Procedere con analisi a valle ( ad esempio , cultura cellulare, PCR).

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Representative Results

La generazione di tumori colorettali di successo e riproducibile in questo modello dipende in maniera critica da un'iniezione precisa delle cellule senza perdite o perdite. Se questo è stato raggiunto, questo modello è estremamente affidabile e molto raramente si traduce in una diffusione peritoneale artificiale. La cinetica di crescita dei tumori così come i loro modelli di disseminazione dipendono dalla biologia degli organoidi e delle cellule usate. 15 Mentre le cellule HCT116 in modo affidabile metastatizzano il fegato in questo modello, la cellula SW620 forma tumori ortotopici, ma non metastasizza. 15

L'uso di cellule HCT116 in questo modello rende affidabile i topi moribund entro 35 giorni dall'iniezione di cellule tumorali. I tumori primari misurano circa 10 mm di dimensione ( Figura 1A e Figura 2A ), metastasi epatiche ( Figura 1B Ong> e Figura 2B ), metastasi polmonari ( Figura 1C e Figura 2C ) e cellule tumorali circolanti ( Figura 3 ) sono quasi invariabilmente presenti. Nei topi contenenti i tumori HCT116, 35 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali sono presenti in alta frequenza e quantità e possono essere facilmente isolati per analisi a valle ( Figura 3 ).

Figura 1
Figura 1: Immagini macroscopiche dopo la dissezione 35 giorni dopo l'iniezione ortotopica delle cellule CRC Human HCT116 nei topi NSG. ( A ) Tumore primario (linea tratteggiata) nel cecum. ( B ) Fegato con molte metastasi. ( C ) Metastasi polmonari (frecce).1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: immagini istologiche degli organi mostrate in figura 1 . ( A ) Tumore primario (H & E). ( B ) Metastasi epatiche (H & E). ( C ) metastasi polmonare (immunohistochemistry anti-EpCAM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Cellule tumorali circolanti (cellule HCT116 in topi NSG, 35 giorni dopo iniezione cellulare tumorale). Campo luminoso ( A B )) di CTC nella frazione di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Nonostante la loro attività preclinica dimostrata nei modelli del topo sottocutaneo, la grande maggioranza dei nuovi composti non riesca a sperimentare cliniche e non raggiunge mai la clinica. 11 Questa evidente insufficienza dei modelli del topo sottocutaneo per simulare accuratamente i modelli di biologia e crescita dei tumori ha portato allo sviluppo di modelli ortotopici a base di iniezione di cellule tumorali direttamente nell'organo originale.

I modelli di topo ortotopico sono in grado di simulare la biologia e la diffusione di tumori solidi molto più accuratamente che i modelli sottocutanei. 15 Tuttavia, i principali svantaggi sono una scarsa riproducibilità soprattutto nei organi tecnicamente impegnativi come gli organi cavi e dal monitoraggio tecnicamente impegnativo della crescita tumorale. Nel nostro modello abbiamo quindi concentrato la dimensione del tumore in un punto temporale prefissato piuttosto che ripetute procedure di imaging, che limita il numero di tecnicheElaborare e per gli esami stressanti degli animali. Il modello qui descritto può essere utilizzato per varie applicazioni, come la caratterizzazione delle linee cellulari tumorali, 15 indagini sulla biologia tumorale e sulla diffusione nonché sulle prove terapeutiche. I punti endpoint evidenti sono la dimensione del tumore primario e il numero di metastasi distanti, ma possono anche essere impiegati punti finali più elaborati come i numeri CTC 17 o le modalità di imaging.

La fase più critica del nostro protocollo è l'iniezione di cellule tumorali sottosterosali. Richiede la pratica e deve essere eseguito in ogni momento sotto controllo visivo diretto. Se il deposito è in qualsiasi altra parte ma sotto la serosa, ma al di sopra della mucosa, non ci sarà né crescita tumorale né crescita né diffusione imprevedibile, rendendo i risultati incomparabili. Altri possibili motivi per la mancanza di sviluppo del tumore includono cellule non vitali ( ad esempio </ Em>, a causa dell'intervallo di tempo lungo tra il raccolto e l'iniezione delle cellule) o non toglie completamente i muscoli singenici. Ciò è possibile se vengono usati i topi C57Bl / 6; Poiché esistono più sottostanti di C57B1 / 6 ( es . C57B1 / 6J e C57B1 / 6N) che mostrano differenze distinte genetiche e fenotipiche 22 che si riflettono anche nei tassi di cattura tumorale. 23

La tecnica di iniezione altamente controllata descritta qui descrive una crescita e una diffusione del tumore altamente riproducibile e distingue questo modello dai modelli orthotopici descritti in precedenza. 24 Inoltre, risciacquo cieco con acqua distillata dopo l'iniezione delle cellule tumorali riduce drasticamente il tasso di diffusione peritoneale artificiale; Quindi, se la carcinomatosi peritoneale si verifica nel nostro modello, è probabilmente un risultato della biologia della linea cellulare piuttosto che una perdita di cellule tumorali iatrogene.

Limitazioni di questo mOdel sono i topi riceventi che devono essere immunodeficienti se le linee cellulari umane devono essere utilizzate. Ciò limita gravemente l'applicazione del modello negli studi immunologici. Tuttavia, questa limitazione può essere superata dall'uso di linee cellulari murine sinergiche o organoidi (dati non pubblicati). Un'altra limitazione è l'uso delle stele cellulari stesse. Le linee cellulari tumorali sono spesso altamente anaplatiche, che lasciano dubbi sulla loro rappresentatività della biologia originale del tumore. Questa limitazione non è presente nei modelli di topi geneticamente modificati (GEMM), che sviluppano un nuovo tumore con l'introduzione di mutazioni oncogene specifiche del tessuto. 12 Tali GEMM sono di solito basati su mutazioni condizionali a base di germi ( ad es. Un gene Aplc floccato) e attivazione mediata da Cre-mutazioni, per via dell'infezione locale con adeno-cre 25 , 27 , 28 o un promotore specifico del tissueespressione. 29 , 30 , 31 Tuttavia, questi modelli richiedono spesso attraversamenti estesi e hanno una biologia altamente variabile. Se le linee cellulari primarie sono utilizzate nel modello presentato qui, la limitazione della bassa rappresentatività può essere superata senza la perdita degli altri vantaggi del nostro modello, come la riproducibilità e la relativa efficienza economica.

Un'altra limitazione della tecnica qui proposta è la dipendenza da EpCAM come marcatore di superficie. È ben noto che EpCAM può essere persa durante EMT e che esiste una frazione di CTC che sono EpCAM negativi. 10 , 15 Pertanto, a seconda dello scopo dell'esperimento e delle linee cellulari utilizzate per l'iniezione, possono essere utilizzati altri mezzi di identificazione ( ad esempio , etichettatura GFP delle cellule prima dell'iniezione).

In conclusione, il modello qui presentato cSostituisce uno strumento flessibile per studiare lo sviluppo e la diffusione del tumore nel contesto del microambiente originale del tumore nel colon. Se vengono utilizzate linee metastatiche, simula fedelmente la diffusione delle cellule tumorali in tutti i siti rilevanti per CRC, inclusi i CTC nel flusso sanguigno. È quindi uno strumento utile per studiare i cambiamenti fenotipici durante la crescita e la diffusione del tumore e consente di ripetuto isolamento e caratterizzazione di CTC in CRC. 15

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione della ricerca tedesca (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

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References

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