Isolering av sirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver etableringen av ortotopiske kolorektale svulster via injeksjon av tumorceller eller organoider i cecum av mus og den etterfølgende isolasjonen av sirkulerende tumorceller (CTC) fra denne modellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Til tross for fordelene ved enkel brukbarhet og kostnadseffektivitet, har subkutane musemodeller alvorlige begrensninger og simulerer ikke nøyaktig simulering av tumorbiologi og tumorcelle. Ortotopiske musemodeller er innført for å overvinne disse begrensningene; Imidlertid er slike modeller teknisk krevende, spesielt i hule organer som stor tarm. For å produsere ensartede tumorer som pålidelig vokser og metastaserer, er standardiserte teknikker for fremstilling av tumorceller og injeksjon kritiske.

Vi har utviklet en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft (CRC) som utvikler svært ensartede svulster og kan brukes til tumorbiologi studier samt terapeutiske studier. Tumorceller fra enten primære svulster, 2-dimensjonale (2D) cellelinjer eller 3-dimensjonale (3D) organoider injiseres i cecum og, avhengig av metastatisk potensial for de injiserte tumorceller, danner svært metastaserende tumorer. I tillegg,CTCs finnes regelmessig. Her beskriver vi teknikken for tumorcellepreparering fra både 2D-cellelinjer og 3D-organoider, så vel som primær tumorvev, kirurgiske og injeksjonsteknikker, samt isolering av CTC fra de tumorbærende musene og nåværende tips for feilsøking.

Introduction

Colorectal cancer (CRC) er en av de vanligste årsakene til kreftdød i vestlige land. 1 Mens den primære svulsten ofte kan resekseres, forekommer forekomsten av fjerne metastaser dramatisk prognosen og fører ofte til døden. 2 , 3 Det biologiske korrelatet til metastase er sirkulerende tumorceller (CTC), som løsner fra svulsten, overlever i omløp, festes til epitelet i målorganet, invaderer orgelet og til slutt vokser ut til nye lesjoner. 4 Selv om CTCs er kjent for å være av prognostisk relevans, er deres biologi bare delvis forstått som følge av deres ekstrem sjeldenhet i CRC, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 10

Musmodeller er en kraftig tOol å studere ulike aspekter av kreftbiologi. Klassiske subkutane svulstmodeller blir produsert ved subkutan injeksjon av tumorceller i mottakermus, som kan være enten immunokompetente (hvis syngene muse-tumorceller brukes) eller immundefekt. Subkutane svulstmodeller er billige og produserer data raskt; Deres endpoints tumorvekst kan enkelt og ikke-invasivt måles. Imidlertid mislykkes 88% av nye forbindelser som har vist antitumoraktivitet i slike modeller i kliniske studier. 11 Dette skyldes blant annet forskjeller mellom mennesker og mus; En stor del av denne feilen skyldes imidlertid den lave prediktive verdien av subkutane musemodeller.

Ortotopiske musemodeller, hvor tumorcellene injiseres i opprinnelsesorganet og dermed vokser i deres opprinnelige mikromiljø, blir derfor stadig brukt i kreftforskning. 11 , 12 , 13 , 14 Ortotopiske modeller simulerer ikke bare lokale tumorvekstbetingelser; Som et resultat av det anatomisk korrekte stedet for svulstvekst, tillater ortotopiske musemodeller også realistisk simulering av metastase og brukes derfor til å studere CTC biologi 8 , 15 , 16 eller deres respons på ulike behandlinger i CRC. 13 , 17

En stor ulempe ved ortotopmusemodeller er deres tekniske kompleksitet. Avhengig av organet der cellene skal injiseres, er læringskurven til eksperimentet i stand til å indusere reproducerbare svulster ganske lang. Dette gjelder spesielt for kolorektale kreftmodeller, da tumorcellene må injiseres i tarmvegget, noe som ofte resulterer i perforering, tumorcellelekkasje eller endoluminal tumorcelletap. Dette erRticle er ment å beskrive metoden for cellepreparering fra primære vevsprøver, 2D-cellelinjer og 3D-organoidkultur og deres injeksjon i cecum av mus. Teknikken beskrevet her fører til svært ensartede tumorer og, avhengig av tumorbiologien av cellelinjen som brukes til injeksjon, reproduserbar dannelse av fjerne metastaser og CTC i mottakermusene. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøk som presenteres her ble uavhengig vurdert og tillatt av en institusjonell og en statlig Animal Care og bruk komité og ble gjennomført i henhold til Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) retningslinjer. Alle mulige tiltak ble tatt for å minimere lidelse inkludert anestesi og analgesi eller om nødvendig for tidlig dødshjelp.

1. Fremstilling av celler og organoider

MERK: Bruk et volum på 20 μL med 100 000 celler for hver injeksjon. Bruk basalmembranmatrisen (BMM) for å forhindre lekkasje og sikre standardisert injeksjon. For å sikre reproduserbare resultater, utføre cellelinjeautentiseringsanalyser ( f.eks . Via STR profilering) med jevne mellomrom.

  1. Fremstilling av primære cellesuspensjoner fra friskt vev
    MERK: Bruk alltid under sterile forhold. Umiddelbar overføring av friskResektert vev fra operasjonsrommet til laboratoriet på is er nødvendig for å sikre høy levedyktighet av cellene.
    Pasientens velvære og optimal behandling må alltid være den første prioriteten. Derfor må vevsprøver for forskning oppnås på en måte som ikke forstyrrer den påfølgende patologiske oppretting og oppstart av den resekterte svulsten. I de fleste tilfeller er det derfor rimelig å ha prøver for forskning som er oppnådd av en utdannet patolog for å sikre at det ikke er forstyrrelser i den patologiske diagnosen.
    1. Umiddelbart etter steril fjerning fra reseksemplet (ideelt sett ~ 1 cm 3 ), plasser vevsprøven i et 50 ml rør fylt med 20-30 ml fosfatbuffert saltvann (PBS). Oppbevar røret på is og overfør umiddelbart til laboratoriet.
    2. Sett vevet i en petriskål og vask det to ganger med masse PBS for å fjerne det gjenværende blodet.
    3. Skjær vevet i små biter (~ 2-4 mm) med en scaLpel ( f.eks . Med et # 20 eller # 36 blad).
    4. Bruk dissociatoren i henhold til produsentens instruksjoner for å ytterligere dissociere tumorvevet til en enkeltcellesuspensjon. Alternativt, bruk andre protokoller med enzymatisk svulst fordøyelse.
    5. Telle cellene til den resulterende en-cellesuspensjonen ( f.eks . I en coulter-teller eller et hemocytometer).
    6. Sentrifuge (5 minutter ved 1500 xg) og vask cellesuspensjonen to ganger med PBS.
    7. Resuspender cellene i BMM ved en konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml, og holde dem på is.
  2. Fremstilling av cellelinjer for injeksjon
    1. Dyrke alle kolorektale cancercellelinjer under standarddyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO2) og forberede dem på dagen for kirurgi.
    2. Høst cellene i henhold til standard cellekulturprotokoller, teller cellene ( f.eks . I en coulter-teller eller et hemocytometer) og beregne reqUønsket mengde for alle injeksjoner avhengig av antall dyr som skal injiseres.
    3. Klargjør 3-5 ganger det faktisk nødvendige volumet for å ta hensyn til pipettertap og det døde volumet av injeksjonssprøyten.
    4. Sentrifuge (5 min ved 1500 g) og vask cellesuspensjonen to ganger med PBS.
    5. Resuspender cellene i BMM ved en konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml, og holde dem på is.
  3. Organoid forberedelse
    MERK: Alle 3D organoid Kulturene dyrkes under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO2). Detaljert protokoller for organoid kultur er publisert før. 18 , 19 , 20 I likhet med konvensjonelle cellelinjer anbefaler vi et volum på 20 μL BMM med 100 000 celler per injeksjon. Organoidene fremstilles på operasjonsdagen som følger:
    1. Forbered følgende medium (i det følgende referertTil DMEM / F12 +++): Avansert Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamin (200 mM) + 1% Penicillin / Streptomycin.
    2. Forfyll 15 ml rør med 1 ml DMEM / F12 +++.
    3. Aspirer forsiktig organoidene fra overflaten av kulturplaten og overfør innholdet av 3 til 5 brønner i ett 15 ml rør.
    4. Ta forsiktig organoidene opp i mindre stykker ved å pipettere dem opp og ned med en utvidet glasspipette.
    5. Tilsett 5 ml DMEM / F12 +++ på røret, etterfulgt av sentrifugering ved 1000 xg i 5 minutter.
    6. Etter sentrifugering, fjern supernatanten, resuspender pelleten i 600 ul enzymatisk dissosieringsbuffer og overfør suspensjonen til en brønn i en 6-brønnplate.
    7. Inkuber ved 37 ° C i 1-5 minutter, og rør deretter forsiktig opp suspensjonen opp og ned for å oppløse organoidene.
      MERK: Bekreft fordøyelsen via mikroskop; Det er komplett når alle celleklynger har blitt dissosiertD til enkeltceller.
    8. Ved vellykket fordøyelse, tilsett 1,4 ml DMEM / F12 +++ for å stoppe fordøyelsen. Overfør deretter alle brønner av fordøyede organoider til et 50 ml rør.
    9. Telle cellene og beregne ønsket mengde for alle injeksjoner.
    10. Forbered 3 - 5x av det faktisk nødvendige volumet for å ta hensyn til pipetteringstap og det døde volumet av injeksjonssprøyten
    11. Sentrifuge (5 minutter ved 1500 xg) og vask cellesuspensjonen to ganger med PBS.
    12. Resuspenderte cellene i BMM til en konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml, og holde dem på is.

2. Ortotopisk musemodell

  1. Forberedelse av mottakerdyr for kirurgi
    MERK: Bruk 6-8 ukentlige NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) mus som mottakere. 21 NSG er blant de mest immunokompromitterte musene, mangler modne B-, T- og NK-celler sammen med flere andre immune defects. 21 De vokser på en pålitelig måte, selv om lave celle tall injiseres og er svært utsatt for fjerne metastaser. NSG-mus er gode oppdrettere og kan holdes i konvensjonelle spesifikke patogenfrie (SPF) -enheter.
    1. Før første snitt injiseres 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant.
    2. Bruk sevofluran ved 3-3,5 vol% for generell anestesi. Et tap av tå-nippelrefleksen indikerer tilstrekkelig anestesi.
    3. Dekk øynene til de bedøvede musene med oftalmisk salve for å unngå uttørking av hornhinnen.
    4. Hold musene i en liggende stilling på et lite bord.
    5. Barber magen med en elektrisk barbermaskin (depilatory cream kan alternativt brukes) og desinfiseres med minst 3 ganger klorhexidin / jod og 70% alkohol alternativt.
    6. Dekk det kirurgiske feltet med sterile gardiner.
      MERK: Bruk av perioperative antibiotika er valgfritt og underlagt institusjonelle retningslinjer.
  2. Midline laparotomi og eksponering av cecum
    1. Bruk saks (skalpeller kan brukes alternativt) for å lage en liten midtre snitt (3 - 5 mm) av huden på underlivet. Plukk opp muskulaturen i bukveggene med pincet og legg det forsiktig opp med saks, og dermed åpne bukhulen.
    2. Identifiser og forsiktig utvendig cecum med atraumatiske tang. Plasser den blinde enderposen på cecum på magen som peker kranen.
    3. Når du er eksteriør, hold cecumen fuktig ved hjelp av varme saltvannspinner alltid.
  3. Ortotopisk injeksjon, lukking av mage og postoperativ utvinning
    1. For intravenøs injeksjon, bruk en standard 1 ml sprøyte med en 30 G kanyle. Monter sprøyten på en mikroinjeksjonspumpe, som igjen er montert på en mikromanipulator.
    2. Ta forsiktig taket på cecum med atraumatiske tang og forsiktig forsyn det ved å strekke det nedoverD med et andre sett med tapper fuktet med varm saltvann.
    3. Plasser kanylen rett over cecum.
    4. Utfør følgende trinn under visuell kontroll med et kikkert kirurgisk mikroskop.
    5. Ta forsiktig taket med to atraumatiske pincet i begge ender av den utvendige delen av cecum, strekk den litt og trekk den sakte over kanylen som er plassert parallelt og rett over. Det er avgjørende å ikke perforere hele tarmvegget (dermed injisere cellene i lumen), så vel som ikke å perforere serosen utover det opprinnelige penetreringspunktet, da dette vil føre til lekkasje og peritoneal spredning.
      1. Flytt tarmen mot kanylen, ikke kanylen mot tarmen. Hold og strekk tarmen mellom to tang. Kirurgens hender skal hvile på overflaten for å redusere tremor.
    6. Injiser cellene mellom serosa (sett som veldig tynn, gjennomsiktig fôr over thE intramurale blodkar) og muskulaturen. Kanylen må derfor være visuelt plassert over blodkarene og under den tynne gjennomskinnelige membranen.
    7. Bruk en fotbryter for å starte injeksjonen for å redusere tremor mens kanylen er inne i tarmveggen.
    8. Når kanylen er på plass, start injeksjonen. Bruk en varighet på 20 s, noe som resulterer i 1 μl / s innstilling på pumpens styreenhet.
      MERK: Injiseringen i eller nær et skadet blodkar fører til direkte intravaskulær spredning og fjern metastase og bør derfor unngås.
    9. Etter å ha fullført injeksjonen, fjern forsiktig kanylen ved å trekke den bakover.
    10. Plasser en tørrpinne under cecum, og skyll deretter cecumen grundig med destillert vann for å lyse lekkede celler og dermed forhindre kunstig peritoneal spredning.
  4. Lukking av magen og postoperativ utvinning
    1. Etter rInsing, forsiktig returnere cecum til bukhulen.
    2. Lukk bukveggen med 6-0 raskt absorberbare løpende suturer.
    3. Lukk huden med kirurgiske sårklemmer.
    4. Plasser musen på et varmekart satt til 38 ° C til det er fullstendig gjenopprettet fra bedøvelsen.
    5. Følg nøye postoperativ tilstanden til musene i de følgende 48 timer. Ved nød, behandle med 0,05 mg / kg buprenorfin hver 12. time.
    6. Overvåk musene minst en gang daglig for tegn på nød på grunn av tumorvekst.

3. Isolering av sirkulerende tumorceller fra helblodprøver

MERK: Hent blod ved transkutan hjertepunktur på bedøvede mus, etterfulgt av eutanasi. Ideelt sett blir 1000 μL blod trukket inn i en sprøyte som er fylt med 100 μl av et antikoaguleringsmiddel (etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller heparin). Bruk en anti-human-EpCAM (epitelcelleadhesjonMolekyl) antistoff for å identifisere CTCs. Dette fungerer veldig bra hvis menneskelige epitelcellelinjer brukes i musemodellen. For andre apparater kan det være nødvendig med forskjellige antistoffer.

  1. CTC-anrikning:
    1. Pre-fill 15 mL rør med 5 mL tetthet gradient medium og forsiktig overføre blodet inn i 15 mL tube.
    2. Sentrifuge (30 min ved 300 xg uten brems) og fjern forsiktig den øvre supernatanten.
    3. Hell resten i et nytt 15 ml rør og sentrifuge (15 min, 300 xg med brems).
    4. Gjenopprett interfasen som inneholder mononukleære celler (kast resten) og vaske cellene to ganger med PBS.
    5. Resuspender pelleten i 200 μl PBS / 1% EDTA og tilsett 4 μl EpCAM antistoff. Inkubér 20 min på is i mørket.
  2. Screening og plukking
    1. Klargjør følgende buffer (i det følgende referert til som plukkbuffer): PBS + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1% Penicillin / STreptomycin (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Bruk en PAP-penn til å tegne en 1 cm-sirkel i en 6 cm steril petriskål (hindrer væsken i å dispergere i parabolen) og piper 700 μL plukkbuffer inn i denne sirkelen.
    3. Tilsett 50 μl cellesuspensjon til 700 μL plukkbufferen i sirkelen. Sjekk tettheten av celler med mikroskopet. Del prøven i forskjellige retter hvis den er for tett.
    4. Vent på at cellene skal slå seg ned (~ 5 min).
    5. Skjerm dråpen av cellesuspensjon for farget (= EpCAM-positiv) celler.
    6. Når en celle er funnet, plukk cellen med mikromanipulatoren og sett den i 50 μl buffer, avhengig av den tilsiktede nedstrømsanalysen ( f.eks . RNA-ekstraksjonsbuffer eller dyrkningsmedium).
    7. Avhengig av de tilsiktede nedstrømsanalysene, isolerer EpCAM-negative celler og / eller medium som negative kontroller.
    8. Fortsett med nedstrøms analyser ( f.eks . Cellekultur, PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede og reproducerbare generasjonen av kolorektale svulster i denne modellen er kritisk avhengig av nøyaktig injeksjon av cellene uten utslipp eller lekkasje. Hvis dette oppnås, er denne modellen ekstremt pålitelig og resulterer svært sjelden i kunstig peritoneal spredning. Vekstkinetikken til svulstene samt deres spredningsmønstre er avhengig av biologien til de brukte organoider og celler. 15 Mens HCT116-celler på en pålitelig måte metastaserer til leveren i denne modellen, danner SW620 celle ortototopiske svulster, men må ikke metastasere. 15

Bruken av HCT116-celler i denne modellen gir pålitelig resultat i moribundmus innen 35 dager etter tumorcelleinjeksjon. Primære svulster måler ca. 10 mm i størrelse ( figur 1A og figur 2A ), levermetastaser ( figur 1B Ong> og figur 2B ), lungemetastaser ( figur 1C og figur 2C ) og sirkulerende tumorceller ( figur 3 ) er nesten uendelig tilstede. Hos mus som bærer HCT116-svulster, er 35 dager etter tumorcelleinjeksjon CTCs tilstede i høyfrekvens og kvantitet og kan enkelt isoleres for nedstrømsanalyser ( Figur 3 ).

Figur 1
Figur 1: Makroskopiske bilder etter disseksjon 35 dager etter den ortototiske injeksjonen av HCT116 humane CRC-celler i NSG-mus. ( A ) Primær tumor (strekket linje) i cecum. ( B ) Lever med flere metastaser. ( C ) Lungemetastaser (piler).1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Histologiske bilder av organene vist på figur 1 . ( A ) Primær tumor (H & E). ( B ) Levermetastase (H & E). ( C ) Lungemetastase (anti-EpCAM immunhistokjemi). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Sirkulerende tumorceller (HCT116-celler i NSG-mus, 35 dager etter tumorcelleinjeksjon). Lyse felt ( A B )) bilder av CTC i perifer blodmononukleær celle (PBMC) fraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for preklinisk bevist aktivitet i subkutane musemodeller, svikter det store flertallet av nye forbindelser i kliniske studier og kommer aldri til klinikken. 11 Denne åpenbare mangelen på subkutane musemodeller for nøyaktig å simulere biologi og vekstmønstre av svulster har ført til utviklingen av ortotopiske musemodeller basert på injeksjon av tumorceller direkte inn i det opprinnelige organet.

Ortotopiske musemodeller kan simulere biologien og formidling av solide tumorer mye mer nøyaktig enn subkutane modeller. 15 Imidlertid største ulempene er dårlig reproduserbarhet, spesielt i teknisk krevende organer som hule organer, så vel som teknisk krevende overvåking av tumorvekst. I vår modell har vi derfor fokusert på tumorstørrelse på et forhåndsdefinert tidspunkt i stedet for gjentatte bildebehandlinger, noe som begrenser antall tekniskeLy forseggjort og for dyrets stressfulle undersøkelser. Den her beskrevne modellen kan brukes til forskjellige anvendelser som karakterisering av tumorcellelinjer, 15 undersøkelse av tumorbiologi og spredning samt terapeutiske forsøk. 17 Åpenbare endepunkter er størrelsen på primærtumoren og antallet av fjerne metastaser, men mer utførlige endepunkter som CTC nummer 17 eller avbildningsmodeller kan også benyttes.

Det mest kritiske trinnet i protokollen vår er subserosal tumorcelleinjeksjon. Det krever øvelse og må utføres til enhver tid under direkte visuell kontroll. Hvis innskuddet er noe annet sted, men under serosa, men over slimhinnen, vil det heller ikke være noen svulstvekst i det hele tatt eller uforutsigbar vekst og spredning, noe som gjør resultatene uforlignelige. Andre mulige årsaker til manglende utvikling av svulster inkluderer ikke-levedyktige celler ( f.eks. </ Em>, på grunn av den lange tidsperioden mellom høst og injeksjon av cellene) eller ikke helt syngene mus. Dette er mulig hvis C57Bl / 6-mus er brukt; Som det er flere substrains av C57Bl / 6 ( f.eks . C57Bl / 6J og C57Bl / 6N) som viser forskjellige genetiske og fenotypiske forskjeller 22 som også reflekteres i tumoropptakshastigheter. 23

Den her beskrevne høystyrte injeksjonsteknikken fører til høy reproduserbar tumorvekst og spredning og skiller denne modellen fra tidligere beskrevne ortototopiske modeller. 24 I tillegg reduserer cecum med destillert vann etter tumorcelleinjeksjon dramatisk reduksjonen av kunstig peritoneal spredning; Derfor, hvis peritoneal karsinomatose forekommer i vår modell, er det sannsynligvis et resultat av cellens biologi i stedet for en iatrogent tumorcellelekkasje.

Begrensninger av denne mOdel er mottakermusene som må være immundefekt hvis humane cellelinjer skal brukes. Dette begrenser alvorlig modellens anvendelse i immunologiske studier. Denne begrensningen kan imidlertid overvinnes ved bruk av syngene musecellelinjer eller organoider (upubliserte data). En annen begrensning er bruk av cellelinjer selv. Tumorcellelinjer er ofte svært anaplastiske, som etterlater spørsmål om deres representativitet i den opprinnelige svulstens biologi. Denne begrensningen er ikke tilstede i genmodifiserte musemodeller (GEMMs), som utvikler en ny tumor ved innføring av vevsspesifikke onkogene mutasjoner. 12 Slike GEMM er vanligvis basert på betingede kimlinjemutasjoner ( f. Eks. Et fluxet Apc-gen) og Cre-mediert aktivering av mutasjonene, enten ved lokal infeksjon med adeno-cre 25 , 27 , 28 eller en vevsspesifikk promotorkjøring creuttrykk. 29 , 30 , 31 Imidlertid krever slike modeller ofte omfattende kryssinger og har en svært variabel biologi. Hvis primære cellelinjer brukes i den her presenterte modellen, kan begrensningen av lav representativitet overvinnes uten tap av de andre fordelene ved vår modell, for eksempel reproduksjonsevne og relativ kostnadseffektivitet.

En annen begrensning av den her foreslåtte teknikken er avhengigheten av EpCAM som overflate markør. Det er velkjent at EpCAM kan gå tapt under EMT, og at det er en brøkdel av CTC som er EpCAM-negative. 10 , 15 Derfor kan det, avhengig av forsøksformålet og cellelinjene som brukes til injeksjon, brukes andre former for identifikasjon ( f.eks . GFP-merking av cellene før injeksjon).

Som konklusjon, presenteres den her presenterte modellen cUtgjør et fleksibelt verktøy for å studere tumorutvikling og spredning i sammenheng med svulmens opprinnelige mikromiljø i kolon. Hvis metastatiske cellelinjer brukes, simulerer det på trofast måte tumorcelledisponering på alle relevante steder for CRC, inkludert CTC i blodet. Det er derfor et nyttig verktøy for å studere fenotypiske endringer under tumorvekst og spredning og muliggjør gjentatt isolering og karakterisering av CTC i CRC. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tysk forskningsstiftelse (WE 3548 / 4-1) og Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365, (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1, (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397, (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20, (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112, (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19, (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263, (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138, (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74, (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5, (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33, (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6, (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4, (11), e1042201 (2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7, (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6, (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74, (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159, (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100, (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14, (7), R82 (2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347, (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7, (351), ra107 (2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61, (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8, (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (42), 11859-11864 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics