Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Cancer Research

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Summary

Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.

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Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

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Abstract

Trotz der Vorteile der einfachen Anwendbarkeit und der Kostenwirksamkeit haben subkutane Mausmodelle schwere Einschränkungen und simulieren die Tumorbiologie und die Verbreitung von Tumorzellen nicht genau. Orthotopische Mausmodelle wurden eingeführt, um diese Einschränkungen zu überwinden; Allerdings sind solche Modelle technisch anspruchsvoll, vor allem in Hohlorganen wie dem Dickdarm. Um einheitliche Tumore zu erzeugen, die zuverlässig wachsen und metastasieren, sind standardisierte Techniken der Tumorzellpräparation und Injektion kritisch.

Wir haben ein orthotopisches Mausmodell von Darmkrebs (CRC) entwickelt, das hochgradig einheitliche Tumore entwickelt und für Tumorbiologie-Studien sowie therapeutische Studien eingesetzt werden kann. Tumorzellen aus Primärtumoren, 2-dimensionalen (2D) Zelllinien oder dreidimensionalen (3D) Organoiden werden in den Cecum injiziert und bilden je nach metastatischem Potential der injizierten Tumorzellen hochmetastatische Tumore. In Ergänzung,CTCs können regelmäßig gefunden werden. Wir beschreiben hier die Technik der Tumorzellpräparation sowohl aus 2D-Zelllinien als auch aus 3D-Organoiden sowie primärem Tumorgewebe, chirurgischen und Injektionstechniken sowie der Isolierung von CTCs aus den tumortragenden Mäusen und präsentieren Tipps zur Fehlersuche.

Introduction

Darmkrebs (CRC) ist eine der häufigsten Ursachen für Krebs Tod in den westlichen Ländern. 1 Während der Primärtumor oft reseziert werden kann, verschlechtert das Auftreten von entfernten Metastasen die Prognose drastisch und führt oft zum Tod. 2 , 3 Das biologische Korrelat der Metastase ist zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die sich vom Tumor lösen, im Kreislauf überleben, an das Epithel im Zielorgan anschließen, in das Organ eindringen und schließlich zu neuen Läsionen übergehen. 4 Obwohl CTCs bekanntermaßen von prognostischer Relevanz sind, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 wird ihre Biologie nur teilweise durch ihre extreme Seltenheit im CRC verstanden. 10

Mausmodelle sind ein leistungsfähiges tOol, um verschiedene Aspekte der Krebsbiologie zu studieren. Klassische, subkutane Tumormodelle werden durch subkutane Injektion von Tumorzellen in Empfängermäuse produziert, die entweder immunkompetent sein können (wenn syngene murine Tumorzellen verwendet werden) oder immundefizient sind. Subkutane Tumormodelle sind preiswert und produzieren schnell Daten; Ihr Endpunkt-Tumorwachstum kann leicht und nicht-invasiv gemessen werden. Allerdings scheitern 88% der neuen Verbindungen, die Antitumor-Aktivität in solchen Modellen gezeigt haben, in klinischen Studien. 11 Dies ist zum Teil auf interspezifische Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen zurückzuführen; Allerdings ist ein großer Teil dieses Versagens auf den niedrigen prädiktiven Wert von subkutanen Mausmodellen zurückzuführen.

Orthotopische Mausmodelle, bei denen die Tumorzellen in das Herkunftsorgan injiziert und damit in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung wachsen, werden daher zunehmend in der Krebsforschung eingesetzt. 11 , 12 , 13 , 14 Orthotopische Modelle simulieren nicht nur lokale Tumorwachstumsbedingungen; Als Ergebnis der anatomisch korrekten Ort des Tumorwachstums erlauben orthotopische Mausmodelle auch eine realistische Simulation der Metastasierung und werden daher zur Untersuchung der CTC-Biologie 8 , 15 , 16 oder ihrer Reaktion auf verschiedene Behandlungen im CRC verwendet. 13 , 17

Ein wesentlicher Nachteil von orthotopischen Mausmodellen ist ihre technische Komplexität. Je nach dem Organ, in dem die Zellen injiziert werden sollen, ist die Lernkurve, bis der Experimentator in der Lage ist, reproduzierbare Tumore zu induzieren, ziemlich lang. Dies gilt insbesondere für Darmkrebsmodelle, da die Tumorzellen in die Darmwand injiziert werden müssen, was oft zu Perforationen, Tumorzellleckagen oder endoluminalen Tumorzellverlusten führt. Dies einRtikel soll das Verfahren der Zellpräparation aus primären Gewebeproben, 2D-Zelllinien und 3D-Organoidkultur und deren Injektion in den Cecum von Mäusen beschreiben. Die hier beschriebene Technik führt zu hochgradig einheitlichen Tumoren und in Abhängigkeit von der Tumorbiologie der für die Injektion verwendeten Zelllinie eine reproduzierbare Bildung von entfernten Metastasen und CTCs in den Empfängermäusen. 15

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Protocol

Die hier vorgestellten Tierversuche wurden unabhängig von einem institutionellen und einem staatlichen Tierpflege- und -nutzungsausschuss unabhängig überprüft und zugelassen und wurden nach den Richtlinien der Föderation der Laboratoriums-Tierwissenschaften (FELASA) durchgeführt. Alle möglichen Maßnahmen wurden ergriffen, um Leiden einschließlich Anästhesie und Analgesie oder, wenn nötig, vorzeitige Sterbehilfe zu minimieren.

1. Vorbereitung von Zellen und Organoiden

HINWEIS: Verwenden Sie für jede Injektion ein Volumen von 20 μl mit 100.000 Zellen. Verwenden Sie die Basismembranmatrix (BMM), um Leckagen zu vermeiden und eine standardisierte Injektion zu gewährleisten. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, führen Sie in regelmäßigen Abständen Zelllinien-Authentifizierungsassays ( zB über STR-Profilierung) durch.

  1. Vorbereitung von primären Zellsuspensionen aus frischem Gewebe
    HINWEIS: Immer unter sterilen Bedingungen arbeiten. Sofortige Übertragung der frischReseziertes Gewebe vom Operationssaal zum Labor auf Eis ist erforderlich, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
    Das Wohlbefinden und die optimale Behandlung des Patienten müssen immer die erste Priorität sein. Daher müssen Gewebeproben für die Forschung in einer Weise erhalten werden, die die nachfolgende pathologische Aufarbeitung und Inszenierung des resezierten Tumors nicht beeinträchtigt. In den meisten Fällen ist es daher sinnvoll, die Untersuchungsmuster von einem ausgebildeten Pathologen zu erhalten, um eine Nicht-Interferenz mit der pathologischen Diagnose zu gewährleisten.
    1. Unmittelbar nach steriler Entfernung aus dem resezierten Exemplar (idealerweise ~ 1 cm 3 ) die Gewebeprobe in ein 50 ml Röhrchen geben, das mit 20-30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vorgefüllt ist. Die Röhre auf Eis aufbewahren und sofort ins Labor bringen.
    2. Setzen Sie das Gewebe in eine Petrischale und waschen Sie es zweimal mit viel PBS, um das übrige Blut zu entfernen.
    3. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke (~ 2-4 mm) mit einem scaLpel ( zB mit einem # 20 oder # 36 Klinge).
    4. Benutzen Sie den Dissoziator gemäß den Anweisungen des Herstellers, um das Tumorgewebe weiter zu einer einzelligen Suspension zu dissoziieren. Alternativ verwenden Sie andere Protokolle der enzymatischen Tumorverdauung.
    5. Zählen Sie die Zellen der resultierenden Einzelzell-Suspension ( z. B. in einem Coulter-Counter oder einem Hämocytometer).
    6. Zentrifuge (5 min bei 1.500 xg) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen.
    7. Die Zellen in BMM in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren und auf Eis aufbewahren.
  2. Vorbereitung der Zelllinien zur Injektion
    1. Wachsen Sie alle kolorektalen Krebszelllinien unter Standardkultivierungsbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) und bereiten sie am Tag der Operation vor.
    2. Ernte die Zellen nach Standardzellkulturprotokollen, zähle die Zellen ( z. B. in einem Coulter Counter oder einem Hämocytometer) und berechne die ReqBenötigte Menge für alle Injektionen abhängig von der Anzahl der zu injizierenden Tiere
    3. Bereiten Sie 3-5x des tatsächlich benötigten Volumens vor, um Pipettierungsverluste und das Totvolumen der Injektionsspritze zu berücksichtigen.
    4. Zentrifuge (5 min bei 1.500 g) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen.
    5. Die Zellen in BMM in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml resuspendieren und auf Eis aufbewahren.
  3. Organoidvorbereitung
    HINWEIS: Alle 3D-Organoidkulturen werden unter Standardkultivierungsbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) angebaut. Detaillierte Protokolle für die Organoidkultur wurden bereits veröffentlicht. 18 , 19 , 20 Ähnlich wie bei herkömmlichen Zelllinien empfehlen wir ein Volumen von 20 μl BMM mit 100.000 Zellen pro Injektion. Die Organoide werden am Tag der Operation wie folgt vorbereitet:
    1. Bereiten Sie das folgende Medium vor (im Folgenden:Als DMEM / F12 +++): Fortgeschrittenes Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamin (200 mM) + 1% Penicillin / Streptomycin.
    2. 15 ml Röhrchen mit 1 mL DMEM / F12 +++ vorfüllen.
    3. Die Organoide sorgfältig von der Oberfläche der Kulturplatte abspülen und den Inhalt von 3 bis 5 Vertiefungen in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
    4. Die Organoide vorsichtig in kleinere Stücke zerlegen, indem sie mit einer ausgedehnten Glaspipette auf- und abziehen.
    5. Füge 5 ml DMEM / F12 +++ zum Röhrchen hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1000 xg für 5 min.
    6. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, das Pellet in 600 μl enzymatischen Dissoziationspuffer resuspendieren und die Suspension auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte überführen.
    7. Inkubieren bei 37 ° C für 1-5 min und dann sorgfältig pipettieren die Suspension auf und ab, um die Organoide aufzulösen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Verdauung über Mikroskop; Es ist komplett, wenn alle Zellcluster dissoziiert sindD zu einzelnen Zellen.
    8. Nach erfolgreicher Verdauung werden 1,4 ml DMEM / F12 +++ zugegeben, um die Verdauung zu stoppen. Dann alle Vertiefungen von verdauten Organoiden in ein 50-ml-Röhrchen überführen.
    9. Zähle die Zellen und berechne die benötigte Menge für alle Injektionen.
    10. Bereiten Sie 3 - 5x des tatsächlich benötigten Volumens vor, um Pipettierungsverluste und das Totvolumen der Injektionsspritze zu berücksichtigen
    11. Zentrifuge (5 min bei 1.500 xg) und die Zellsuspension zweimal mit PBS waschen.
    12. Resuspended die Zellen in BMM auf eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml und halten sie auf Eis.

2. Orthotopisches Mausmodell

  1. Vorbereitung der Empfänger Tiere für die Chirurgie
    HINWEIS: Verwenden Sie 6-8 Wochen alte NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) Mäuse als Empfänger. 21 NSG gehören zu den am meisten immunsupprimierten Mäusen, ohne reife B-, T- und NK-Zellen zusammen mit mehreren anderen ImmunenFects 21 Sie wachsen auch bei niedrigen Zellzahlen tödlich und sind anfällig für entfernte Metastasen. NSG-Mäuse sind hervorragende Züchter und können in konventionellen spezifischen pathogenfreien (SPF) Einheiten gehalten werden.
    1. Vor dem ersten Einschnitt injizieren Sie 0,05 mg / kg Buprenorphin subkutan.
    2. Sevofluran bei 3-3,5 Vol .-% zur Vollnarkose verwenden. Ein Verlust des Zehenkolbenreflexes zeigt genügend Anästhesie an.
    3. Bedecken Sie die Augen der anästhesierten Mäuse mit ophthalmischer Salbe, um die Austrocknung der Hornhaut zu vermeiden.
    4. Beschränke die Mäuse in einer Rückenlage auf einem kleinen Tisch.
    5. Rasieren Sie den Bauch mit einem elektrischen Rasierer (Enthaarungscreme kann alternativ verwendet werden) und desinfizieren mit mindestens 3 mal Clorhexidin / Jod und 70% Alkohol alternativ.
    6. Decken Sie das chirurgische Feld mit sterilen Vorhängen ab.
      HINWEIS: Die Verwendung von perioperativen Antibiotika ist optional und unterliegt institutionellen Richtlinien.
  2. Mittellinie Laparotomie und Exposition des Zökums
    1. Verwenden Sie eine Schere (Skalpelle können alternativ verwendet werden), um eine kleine Mittellinie (3 - 5 mm) der Haut auf dem Unterbauch zu machen. Die Bauchwandmuskulatur mit Pinzette aufnehmen und mit einer Schere sorgfältig einarbeiten und damit die Bauchhöhle öffnen.
    2. Das Zökum mit atraumatischer Pinzette identifizieren und sorgfältig ausbauen. Positionieren Sie die blinde Endbeutel des Zökums auf dem Bauch, der kranial zeigt.
    3. Sobald es aussen ist, halten Sie den Cecum feucht mit warmen Kochsalzlösung Tupfer zu allen Zeiten.
  3. Orthotopische Injektion, Verschluss des Bauches und postoperative Erholung
    1. Für die intracecale Injektion verwenden Sie eine Standard 1 ml Spritze mit einer 30 G Kanüle. Montieren Sie diese Spritze auf eine Mikroinjektionspumpe, die wiederum auf einem Mikromanipulator montiert ist.
    2. Füllen Sie die Spitze des Zökels sorgfältig mit atraumatischer Pinzette und glätten Sie sie sanft, indem Sie sie nach hinten streichenD mit einem zweiten Satz von Pinzette angefeuchtet mit warmer Kochsalzlösung.
    3. Positionieren Sie die Kanüle direkt über dem Zökum.
    4. Führen Sie die folgenden Schritte unter visueller Kontrolle mit einem binokularen chirurgischen Mikroskop durch.
    5. Vorsichtig das Zökchen mit zwei atraumatischen Pinzetten an beiden Enden des außen liegenden Teils des Zökels ergreifen, leicht ausdehnen und dann langsam über die Kanüle ziehen, die parallel und direkt oben positioniert ist. Es ist entscheidend, die gesamte Darmwand nicht zu perforieren (also die Zellen in das Lumen einzuspritzen) und die Serosa nicht über den Anfangspunkt der Penetration hinaus zu perforieren, da dies zu einer Leckage und einer peritonealen Verbreitung führen würde.
      1. Bewegen Sie den Darm in Richtung der Kanüle, nicht die Kanüle zum Darm. Halten und strecken den Darm zwischen zwei Pinzetten. Die Hände des Chirurgen müssen auf einer Oberfläche ruhen, um das Zittern zu reduzieren.
    6. Injizieren Sie die Zellen zwischen der Serosa (als sehr dünne, lichtdurchlässige Futter über thE intramurale Blutgefäße) und die Muscularis. Die Kanüle muss also visuell oberhalb der Blutgefäße und unterhalb der dünnen lichtdurchlässigen Membran platziert werden.
    7. Verwenden Sie einen Fußschalter, um die Injektion zu starten, um Tremor zu reduzieren, während sich die Kanüle in der Darmwand befindet.
    8. Sobald die Kanüle in Position ist, starten Sie die Injektion. Verwenden Sie eine Dauer von 20 s, was zu 1 μL / s Einstellung am Steuergerät der Pumpe führt.
      HINWEIS: Die Injektion in oder in der Nähe eines beschädigten Blutgefäßes führt zu einer direkten intravaskulären Verbreitung und einer entfernten Metastase und sollte daher vermieden werden.
    9. Nach Beendigung der Injektion die Kanüle vorsichtig entfernen, indem man sie nach hinten zieht.
    10. Setzen Sie einen trockenen Tupfer unter den Zökum und gründlich spülen Sie den Zökum mit destilliertem Wasser, um Leckzellen zu lysieren und damit künstliche peritoneale Verbreitung zu verhindern.
  4. Verschluss des Bauches und postoperative Erholung
    1. Nach rInsert, sanft das Zökum in die Bauchhöhle zurückgeben.
    2. Schließen Sie die Bauchwand mit 6-0 schnell resorbierbaren Laufnähten.
    3. Schließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundclips.
    4. Legen Sie die Maus auf eine Heizkarte auf 38 ° C, bis sie sich vollständig von der Anästhesie erholt hat.
    5. Beobachten Sie den postoperativen Zustand der Mäuse für die folgenden 48 h. Im Falle von Not, mit 0,05 mg / kg Buprenorphin alle 12 h behandeln.
    6. Überwachen Sie die Mäuse mindestens einmal täglich auf Anzeichen von Not durch Tumorwachstum.

3. Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblutproben

HINWEIS: Erhalten Sie Blut durch transkutane Herzpunktion auf anästhesierte Mäuse, gefolgt von Euthanasie. Idealerweise werden 1000 μl Blut in eine mit 100 μl eines Antikoagulans (Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Heparin) vorgefüllte Spritze gezogen. Verwenden Sie eine Anti-Human-EpCAM (Epithelzell-AdhäsionMolekül) Antikörper zur Identifizierung der CTCs. Dies funktioniert sehr gut, wenn menschliche epitheliale Zelllinien im Mausmodell verwendet werden. Für andere Geräte können unterschiedliche Antikörper erforderlich sein.

  1. CTC Anreicherung:
    1. 15 ml Röhrchen mit 5 mL Dichtegradientenmedium vorfüllen und das Blut vorsichtig in das 15 mL Röhrchen überführen.
    2. Zentrifuge (30 min bei 300 xg ohne Bremse) und vorsichtig den oberen Überstand entfernen.
    3. Gießen Sie den Rest in eine neue 15-ml-Röhre und zentrifugieren Sie (15 min, 300 xg mit Bremse).
    4. Gewinnen Sie die Zwischenphase, die die mononuklearen Zellen enthält (verwerfen den Rest) und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
    5. Das Pellet wird in 200 & mgr; l PBS / 1% EDTA resuspendiert und mit 4 & mgr; l EpCAM-Antikörper versetzt. Inkubieren Sie 20 min auf Eis im Dunkeln.
  2. Screening und Kommissionierung
    1. Den folgenden Puffer vorbereiten (im Folgenden als Pufferpuffer bezeichnet): PBS + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / STreptomycin (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Verwenden Sie einen PAP-Stift, um einen ~ 1 cm-Kreis in einer 6 cm sterilen Petrischale zu ziehen (verhindert das Dispergieren der Flüssigkeit in der Schale) und pipettieren Sie 700 μl Pufferpuffer in diesen Kreis.
    3. Füge 50 μl Zellsuspension dem 700 μl Picking Puffer innerhalb des Kreises hinzu. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen mit dem Mikroskop. Die Probe in verschiedene Gerichte aufteilen, wenn sie zu dicht ist.
    4. Warten Sie, bis sich die Zellen absetzen (~ 5 min).
    5. Schieben Sie den Tropfen der Zellsuspension auf gefärbte (= EpCAM-positive) Zellen.
    6. Sobald eine Zelle gefunden ist, wählen Sie die Zelle mit dem Mikromanipulator und legen Sie sie in 50 μl Puffer in Abhängigkeit von der beabsichtigten nachgeschalteten Analyse ( zB RNA Extraktionspuffer oder Kultivierungsmedium).
    7. Abhängig von den beabsichtigten Downstream-Analysen, isolieren EpCAM-negative Zellen und / oder Medium als Negativkontrollen.
    8. Gehen Sie mit nachgeschalteten Analysen ( zB Zellkultur, PCR) vor.

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Representative Results

Die erfolgreiche und reproduzierbare Erzeugung von kolorektalen Tumoren in diesem Modell hängt entscheidend von der genauen Injektion der Zellen ohne Verschütten oder Lecken ab. Wenn dies erreicht wird, ist dieses Modell äußerst zuverlässig und führt selten zu einer künstlichen peritonealen Verbreitung. Die Wachstumskinetik der Tumore sowie deren Verbreitungsmuster hängen von der Biologie der verwendeten Organoide und Zellen ab. 15 Während HCT116-Zellen in diesem Modell zuverlässig an die Leber metastasieren, bilden die SW620-Zellen orthotopische Tumore, aber nicht metastasieren. 15

Die Verwendung von HCT116-Zellen in diesem Modell führt zuverlässig zu moribund-Mäusen innerhalb von 35 Tagen nach der Tumorzellinjektion. Primäre Tumore messen etwa 10 mm Größe ( Abbildung 1A und Abbildung 2A ), Lebermetastasen ( Abbildung 1B Ong> und Fig. 2B ), Lungenmetastasen ( Fig. 1C und Fig. 2C ) und zirkulierende Tumorzellen ( Fig. 3 ) sind fast unveränderlich vorhanden. Bei Mäusen mit HCT116-Tumoren, 35 Tage nach der Tumorzellinjektion sind CTCs in hoher Frequenz und Menge vorhanden und können für nachgeschaltete Analysen leicht isoliert werden ( Abbildung 3 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Makroskopische Bilder nach der Dissektion 35 Tage nach der orthotopischen Injektion von HCT116 menschlichen CRC-Zellen in NSG-Mäuse. ( A ) Primärer Tumor (gestrichelte Linie) im Zökum. ( B ) Leber mit mehreren Metastasen. ( C ) Lungenmetastasen (Pfeile).1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Histologische Bilder der in Abbildung 1 dargestellten Organe ( A ) Primärer Tumor (H & E). ( B ) Lebermetastase (H & E). ( C ) Lungenmetastase (Anti-EpCAM-Immunhistochemie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Zirkulierende Tumorzellen (HCT116-Zellen in NSG-Mäusen, 35 Tage nach Tumorzellinjektion). Helles Feld ( A B )) Bilder von CTCs in der peripheren Blut-mononuklearen Zelle (PBMC) -Fraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Trotz ihrer präklinisch bewährten Aktivität bei subkutanen Mausmodellen scheitert die große Mehrheit der neuartigen Verbindungen in klinischen Studien und erreicht niemals die Klinik. 11 Diese offensichtliche Insuffizienz von subkutanen Mausmodellen zur genauen Simulation der Biologie und Wachstumsmuster von Tumoren hat zur Entwicklung von orthotopischen Mausmodellen geführt, die auf der Injektion von Tumorzellen direkt in das ursprüngliche Organ basieren.

Orthotopische Mausmodelle sind in der Lage, die Biologie und die Verbreitung von soliden Tumoren viel genauer zu simulieren als subkutane Modelle. 15 Wesentliche Nachteile sind jedoch vor allem bei technisch anspruchsvollen Organen wie Hohlorganen sowie der technisch anspruchsvollen Überwachung des Tumorwachstums eine schlechte Reproduzierbarkeit. In unserem Modell haben wir uns daher auf einen vordefinierten Zeitpunkt auf die Tumorgröße konzentriert und nicht auf wiederholte Bildgebungsverfahren, die die Anzahl der technischen Grenzen einschränkenLy aufwendig und für die stressigen Untersuchungen der Tiere. Das hier beschriebene Modell kann für verschiedene Anwendungen wie die Charakterisierung von Tumorzelllinien, 15 Untersuchungen der Tumorbiologie und der Verbreitung sowie therapeutische Studien verwendet werden. 17 Offensichtliche Endpunkte sind die Größe des Primärtumors und die Anzahl der entfernten Metastasen, aber es können auch aufwendigere Endpunkte wie CTC-Nummern 17 oder Bildgebungsmodalitäten eingesetzt werden.

Der wichtigste Schritt unseres Protokolls ist die subserosale Tumorzellinjektion. Es erfordert Praxis und muss jederzeit unter direkter visueller Kontrolle durchgeführt werden. Wenn die Ablagerung irgendwo anders ist, aber unterhalb der Serosa aber oberhalb der Schleimhaut, wird es entweder kein Tumorwachstum überhaupt oder unvorhersehbares Wachstum und Verbreitung geben, was die Ergebnisse unvergleichlich macht. Andere mögliche Gründe für den Mangel an Tumorentwicklung sind nicht lebensfähige Zellen ( zB </ Em>, aufgrund der langen Zeitspanne zwischen der Ernte und Injektion der Zellen) oder nicht ganz syngene Mäuse. Dies ist möglich, wenn C57Bl / 6 Mäuse verwendet werden; Da es mehrere Substraine von C57Bl / 6 gibt ( zB C57Bl / 6J und C57Bl / 6N), die deutliche genetische und phänotypische Unterschiede 22 aufweisen, die sich auch in Tumoraufnahmeraten widerspiegeln. 23

Die hier beschriebene hochgesteuerte Injektionstechnik führt zu einem hochreproduzierbaren Tumorwachstum und -verbreitung und unterscheidet dieses Modell von den zuvor beschriebenen orthotopischen Modellen. 24 Darüber hinaus verringert das Spülen des Zökums mit destilliertem Wasser nach der Tumorzellinjektion die Rate der künstlichen peritonealen Verbreitung drastisch; Wenn also Peritonealkarzinomatose in unserem Modell auftritt, ist es höchstwahrscheinlich ein Ergebnis der Biologie der Zelllinie anstatt einer iatrogenen Tumorzellleckage.

Einschränkungen dieses mOdel sind die Empfänger-Mäuse, die immundefiziente sein müssen, wenn menschliche Zelllinien verwendet werden sollen. Dies beschränkt die Anwendung des Modells in immunologischen Studien stark. Diese Einschränkung kann jedoch durch die Verwendung von syngenen murinen Zelllinien oder Organoiden (unveröffentlichte Daten) überwunden werden. Eine weitere Einschränkung ist die Verwendung von Zelllinien selbst. Tumorzelllinien sind oft sehr anaplastisch, die Fragen über ihre Repräsentativität der ursprünglichen Tumorbiologie hinterlassen. Diese Einschränkung ist bei gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs) nicht vorhanden, die durch die Einführung von gewebespezifischen onkogenen Mutationen einen neuen Tumor entwickeln. 12 Solche GEMMs basieren in der Regel auf bedingten Keimlinienmutationen ( zB einem floxed Apc-Gen) und Cre-vermittelten Aktivierung der Mutationen, entweder durch lokale Infektion mit Adeno-Cre 25 , 27 , 28 oder einem gewebespezifischen Promotor, der cre führtAusdruck. 29 , 30 , 31 Solche Modelle erfordern jedoch oft umfangreiche Kreuzungen und haben eine sehr variable Biologie. Wenn primäre Zelllinien in dem hier dargestellten Modell verwendet werden, kann die Begrenzung der geringen Repräsentativität ohne den Verlust der anderen Vorteile unseres Modells wie Reproduzierbarkeit und relative Kostenwirksamkeit überwunden werden.

Eine weitere Einschränkung der hier vorgeschlagenen Technik ist die Abhängigkeit von EpCAM als Oberflächenmarker. Es ist bekannt, dass EpCAM während der EMT verloren gehen kann und dass es einen Bruchteil von CTCs gibt, die EpCAM negativ sind. 10 , 15 Daher können je nach Ziel des Experiments und der für die Injektion verwendeten Zelllinien auch andere Identifikationsmittel ( zB GFP-Markierung der Zellen vor der Injektion) verwendet werden.

Abschließend ist das hier vorgestellte Modell cEin stabiles Instrument zur Untersuchung der Tumorentwicklung und -verbreitung im Kontext der ursprünglichen Mikroumgebung des Tumors im Dickdarm. Wenn metastatische Zelllinien verwendet werden, simuliert sie die Tumorzell-Verbreitung in allen relevanten Stellen für CRC einschließlich CTCs im Blutstrom. Es ist daher ein nützliches Hilfsmittel, um die phänotypischen Veränderungen während des Tumorwachstums und der Verbreitung zu untersuchen und eine wiederholte Isolierung und Charakterisierung von CTCs im CRC zu ermöglichen. 15

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der deutschen Forschungsstiftung (WE 3548 / 4-1) und der Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

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References

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