تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام * These authors contributed equally

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

لمفاوية تسرب في النظام العصبي المركزي (CNS) أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. التعديلات المتعلقة مرض تسرب الخلايا اللمفاوية قد يؤدي إلى تغيرات الفيزيولوجية المرضية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، والتحقيق في هجرة الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي مهم لفهم الأمراض CNS التهابات وتطوير طرق العلاج الجديدة. هنا نقدم نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ البشري لدراسة الخلايا اللمفاوية التسرب. تزرع الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري الخلايا البطانية (HBMEC) confluently على البولي ايثلين مسامية transwell إدراج لتقليد البطانة من حاجز الدم في الدماغ. التحقق من صحة ظيفة الحاجز من قبل نطيقة النطيقة المناعية، والمقاومة الكهربائية transendothelial (طير) القياسات وكذلك تحليل إيفانز تخلل الأزرق. هذا النموذج يسمح التحقيق في انسلال من مجموعات فرعية لمفاوية نادرة مثل CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK. Furthermخام، وآثار الخلايا الأخرى، السيتوكينات و chemokines، التعديلات المتعلقة بالمرض، ونظم العلاج واضحة على قدرة المهاجرة من الخلايا الليمفاوية يمكن دراستها. وأخيرا، فإن تأثير محفزات للالتهابات وكذلك نظم العلاج المختلفة على حاجز غشائي يمكن تحليلها.

Introduction

اللمفاويات الهجرة من الدم إلى الأنسجة أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. A سلسلة من التفاعلات الجزيئية محددة يضمن موقع التسرب معين في الأمعاء الدقيقة، والجلد والغدد الليمفاوية، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، وغيرها من الأنسجة 1. وتشارك التعديلات في الهجرة لمفاوية في الفيزيولوجيا المرضية لعدد من الأمراض واسعة الانتشار 2. الهجرة إلى الجهاز العصبي المركزي المناعة متميز ينظم بإحكام وفقا لذلك تشارك التعديلات لهذه العملية في الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي مثل التهاب الدماغ والنخاع البصري التهاب النخاع و الأعصاب، والسكتة الدماغية، والتصلب المتعدد (MS) 7. وبالتالي، فمن المهم دراسة لمفاوية تسرب إلى فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية المرض وتطوير أدوات ل تحسين الاراضي من عبء المرض 10، 11، 12.

الخلايا الليمفاوية تهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي عبر طرق مختلفة. وقد وصفت التسرب من خلال الأوردة للشعيرات في الفضاء تحت العنكبوتية عبر حاجز السوائل الدم النخاعي داخل الضفيرة المشيمية وعبر حاجز الدم في الدماغ 1 و 13 و 14 و 15. تتم الهجرة عبر حاجز الدم في الدماغ عن طريق التفاعل بين الخلايا الليمفاوية مع الخلايا البطانية 14. وعلى النقيض من الخلايا البطانية في محيط الخلايا البطانية من CNS تعبر عن كميات عالية من جزيئات تقاطع ضيقة، مما يحد بدقة كمية من الخلايا والبروتينات قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغمعشوقة = "XREF"> 16. النتائج التهاب في تخفيف منعطفات ضيقة ويستحث التعبير عن جزيئات الالتصاق. وبالتالي، تعزيز الهجرة لمفاوية في الجهاز العصبي المركزي 1 و 17 و 18.

تسرب عبر حاجز الدم في الدماغ هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا اللمفية الحبل على الخلايا البطانية ثم لفة طول البطانة في عملية بوساطة أساسا selectins 15. وفي وقت لاحق، والتفاعلات بين كيموكينات التي يفرزها البطانة والمستقبلات chemokine منهما أعرب عن الخلايا الليمفاوية تحدث تغييرات بتكوين لintegrins، وبالتالي تعزيز التصاق الثابت الخلايا البطانية 1. وأخيرا، الخلايا اللمفية إما الزحف على طول حاجز غشائي ضد تدفق الدم قبل transmigrating في الفضاء المحيط بالأوعية، أو المماطلة فورا ومباشرة نقل الحركةigrate في موقع شركة التصاق 1 و 19 و 20. ويمكن تحليل كل هذه الخطوات من تسرب الخلايا اللمفاوية في المختبر باستخدام تقنيات متميزة 21. ويستخدم الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر لدراسة الربط الأولي والمتداول 15. توفر فحوصات التصاق معلومات مفصلة حول اعتقال الراسخ البطانية الحواجز 22. فحوصات التهجير كما هو موضح هنا تسمح بتحليل خلايا المناعة التهجير 21، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29.

باستخدام البشرية في الدم في المختبر نموذج حاجز الدماغ، ونحن يمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن migr العاليالقدرة atory من CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK مقارنة CD56 خافت انعكس CD16 + نظرائهم من غلبة هذا فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية في حجرة داخل القراب 21. وبالتالي، فإن الإعداد التجريبية يبدو أن تكون مناسبة لمحاكاة الوضع في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة الدماغ البشري خلايا الاوعية الدموية الدقيقة البطانية (HBMEC)

  1. طلاء قوارير زراعة الخلايا
    1. لإعداد حل فبرونيكتين، إضافة 10 مل PBS إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة 150 ميكرولتر فبرونيكتين وتخلط جيدا.
    2. لتغطية الجزء السفلي من T-25 زراعة الخلايا قارورة إضافة 2 مل من محلول فبرونيكتين. احتضان القارورة ثقافة الخلية لا يقل عن 3 ساعات في 37 درجة مئوية في الحاضنة. فبرونيكتين المغلفة قوارير يمكن تخزينها لمدة 2 أسابيع في 37 ° C / 5٪ CO 2.
  2. البذر والغرس وزراعة الخلايا من HBMEC
    1. نضح الحل فبرونيكتين من أسفل القارورة ثقافة الخلية. إضافة 7.2 × 10 4 HBMEC / سم ² مع وقف التنفيذ في 6 مل ECM-ب المتوسطة (= ECM-ب تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1٪ البطانية تكملة نمو الخلايا). احتضان عند 37 ° C / 5٪ CO 2. تحقق نمو الخلايا يوميا باستخدام المجهر.
    2. تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام.الحصاد أو خلايا تقسيم، عندما HBMEC تصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء. وينبغي أن تستخدم HBMEC بين مرور 1 و 15 لتجنب فقدان الخصائص الفيزيولوجية.
  3. حصاد HBMEC.
    1. إعداد accutase حل عن طريق خلط accutase (1X) مع PBS في نسبة 1: 1. الحفاظ accutase الحل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى استخدامها مرة أخرى.
    2. نقل ECM-ب المتوسطة من القارورة ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. غسل HBMEC بإضافة 5 مل PBS إلى أسفل القارورة ثقافة الخلية. نضح PBS وكرر الخطوة غسل مرتين أخريين.
    3. إضافة استعد قبل 2 مل accutase الحل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، HBMEC يتم إعادة وقف التنفيذ من خلال استغلال بقوة قارورة ثقافة الخلية عدة مرات. يتم التحكم مفرزة الخلية باستخدام المجهر
    4. يتم إضافة ECM-ب-المتوسطة المخزنة مسبقا في أنبوب 15 مل إلى قارورة زراعة الخلايا بمجرد بدء HBMEC إلى فصل. شطف أسفل القارورة بشكل متكرر حتى معظم HBMEC هيإعادة وقف التنفيذ.
    5. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل ECM-ب متوسطة. عد الخلايا وتمييع تعليق الخلية لتحقيق تركيز النهائي من 3 × 10 5 HBMEC لكل مليلتر ECM-ب متوسطة.

2. إعداد خلية ثقافة إدراجات

  1. طلاء من إدراج خلية ثقافة
    ملاحظة هامة: تجنب لمس الغشاء من إدراج ثقافة الخلية.
    1. إضافة 100 ميكرولتر حل فبرونيكتين (انظر 1.1.1) إلى كل إدراج ثقافة خلية (الشكل 1A) وبئر واحدة من 96-جيدا لوحة مسطحة القاع (مراقبة البصرية أيضا). احتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعات في 37 ° C. بعد حل حضانة نضح فبرونيكتين.
    2. إضافة 100 ميكرولتر HBMEC تعليق على إدراج ثقافة الخلية والتحكم البصري أيضا. إضافة 600 ميكرولتر ECM-ب متوسطة إلى المقصورة أقل من الخليةإدراج الثقافة. احتضان لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حتى سلامة الحاجز (الشكل 1B) يتم التوصل، تحقق نمو الخلايا عن طريق التقييم المجهري للHBMEC في السيطرة البصرية أيضا. ملاحظة: لا ينصح نمو الخلية وراء أربعة أيام.
    3. اختياري: لتحاكي حالات الالتهاب نضح المتوسطة من مقصورة الدنيا واستبدالها ECM-ب المتوسطة تستكمل مع 500 U / مل IFN-γ / TNF-α 24 ساعة قبل الفحص الهجرة.

3. مراقبة الجودة مع ايفانز الأزرق يوم من الفحص التهجير

  1. إعداد إيفانز حل الأزرق
    1. لإعداد PBS / B27 مزيج حل 10 مل PBS مع 200 ميكرولتر ملحق B27 باستخدام أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمييع ايفانز الأزرق حل سهم (20 ملغ / مل PBS) 1: 1000 مع PBS / B27.
  2. ايفانز الأزرق نفاذية فحص
    1. نضح في المتوسط ​​من المقصورة أقل تليها المقصورة العليامن إدراج الثقافة خلية واحدة تحتوي على متكدسة HBMEC أحادي الطبقة. إضافة 100 ميكرولتر إيفانز حل الأزرق لإدراج الثقافة الخلية.
    2. إضافة 600 ميكرولتر PBS / B27 إلى المقصورة الدنيا واحتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. إزالة بعناية إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط.
  3. ايفانز قياس الأزرق
    1. إزالة PBS / B27 من مقصورة الدنيا ونقل 100 ميكرولتر كل لبئرين من polystyrol الأسود 96-جيدا لوحة مسطحة القاع. إدراج لوحة في TECAN اللانهائي M200 القارئ برو لوحة وتحديد الأمثل ض الموقف.
    2. الإثارة قدر من ايفانز الزرقاء باستخدام إعدادات منها (على سبيل المثال: الإثارة: 620 نانومتر، والانبعاثات: 680 نانومتر، وعرض النطاق الترددي الإثارة: 9 نانومتر، عرض النطاق الترددي الانبعاثات: 20 نانومتر، وتعزيز 175x 25 ومضات، والوقت من التكامل: 20 ميكرو ثانية).
    3. لتحديد وظائف حاجز HBMEC قارن حصلت البيانات إلى منحنى القياسية التي تصور إيفانز تخلل الأزرق عبر HBMEC في نقاط زمنية مختلفة بعد البذورجي الخلايا (الشكل 1B، يمين).

4. هجرة الفحص

  1. إعداد الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMC).
    1. إضافة 10 مل RPMI في أنبوب 15 مل الطرد المركزي وإضافة 200 ميكرولتر B27 الملحق. عد الخلايا PBMC وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق PBMC إلى التركيز النهائي من 5 × 10 6 خلية / مل RPMI / B27.
  2. انشاء لفحص الهجرة
    1. نضح المتوسطة من المقصورة أقل تليها المقصورة العليا من إدراج ثقافة الخلية التي تحتوي متموجة HBMEC الطبقات الوحيدة (الشكل 1A). لكل المانحة إضافة 100 ميكرولتر PBMC تعليق كل لإدراج زراعة الخلايا وكذلك لبئر واحدة من 24 لوحة جيدا في المائة (في المختبر السيطرة).
    2. إضافة 600 ميكرولتر RPMI / B27 إلى المقصورة السفلية من إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر إلى PBMC للتحكم في المختبر واحتضان 6 ساعة عند 37 ° C / 5٪ CO 2.
    3. حصاد ترحيله PBMC
      1. إخراج إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط وشطف بعناية أسفل مع 400 ميكرولتر PBS دون لمس الغشاء. تجاهل إدراج الثقافة الخلية.
      2. إضافة 20 ميكرولتر fluorospheres عدد التدفق (حوالي 1000 الخرز / ميكرولتر) إلى حجرة الأدنى من الثقافة خلية تضاف كذلك إلى عنصر التحكم في المختبر، وتخلط جيدا. نقل 1 مل من الناتج PBMC تعليق إلى التدفق الخلوي الأنابيب.

    5. التدفق الخلوي

    1. إعداد عينة
      1. الطرد المركزي PBMC في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. يعد حل الضد بإضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى 100 ميكرولتر التدفق الخلوي عازلة (PBS / 1٪ BSA / 2 ملي EDTA) لكل عينة. للحصول على نتائج عرض أقل من 1 ميكرولتر CD4-FITC، استخدمت 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5، 1 ميكرولتر CD56-PC7، 1 ميكرولتر CD8-A700، و 1 ميكرولتر CD16-A750 في العينة.
      3. إعادة تعليق PBMC في 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. إضافة 250 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. اكتساب عينة
      1. اعادة تعليق PBMC في المبلغ المطلوب (قد تختلف تبعا لقياس التدفق الخلوي المستخدمة) من التدفق الخلوي العازلة.
      2. الحصول الملون PBMC باستخدام قياس التدفق الخلوي مع كاشف النشط بين 525 و 700 نانومتر الطول الموجي للكشف عن fluorospheres عدد التدفق (الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 525-700 نانومتر).
        (الخطوات التالية هي مثال إذا تم استخدام تدفق Gallios عداد الكريات تعمل مع برنامج Kaluza G: (1) بدء تشغيل الكمبيوتر (2) عند تحميل نظام التشغيل بالكامل، وبدء قياس التدفق الخلوي عن طريق الضغط على "عداد الكريات على" الزر (3) تحميل بروتوكول اكتساب منها عن طريق الضغط على زر "بروتوكول مفتوحة". (4) اختر البروتوكول المطلوب وحدد "فتح". (5) مكررة بروتوكول لكل عينة عن طريق النقر على الحقزر الماوس على بروتوكول مرئية في دائري الظاهري واليسار انقر على حقل "مكررة". (6) تسمية كل عينة في قائمة العينة. (7) نقل العينات إلى المواقع المحددة من دائري والبدء في عملية الاستحواذ.)
    3. تحليل عينة
      1. فتح التدفق الخلوي مما يؤدي البيانات باستخدام البرنامج منها. تحديد عدد من القطعان التي تهم transmigrated PBMC وكذلك خلايا في المختبر من آبار المراقبة وتدفق fluorospheres العد باستخدام برامج التحليل المعنيين.
        (تم اعطاء مثال للاستراتيجية المعزولة في الجزء النتائج (الشكل 1 C: تحليل التهجير من مجموعات فرعية NK الخلية، أولا تحديد الخلايا الليمفاوية في قناة مبعثر sideward (SSC) مقابل قناة مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤامرة الخلايا اللمفاوية هي. ثم عرض في CD3 مقابل CD56 CD56 + المؤامرة وCD3 - يتم اختيار خلايا NK للتمييز بين مجموعات فرعية NK الخلية، يتم عرض الخلايا القاتلة الطبيعية فيويتم اختيار وكذلك CD56 CD16 + قاتمة خلايا NK - على CD56 CD16 مقابل المؤامرة وCD56 CD16 مشرق خافت /. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد fluorospheres عدد التدفق من FSC مقابل SSC مؤامرة وبعد ذلك عرض في مؤامرة لقناة مع الانبعاثات بين 525 و 700 نانومتر مقابل الوقت لتحديد عددهم.)
      2. لحساب عدد الخلايا الكلي لكل عينة، وتطبيع عدد الكشف عن الخلايا باستخدام fluorospheres عدد التدفق:
        معادلة
      3. تحديد النسبة المئوية للخلايا هاجر كما النسبة بين مجموع الخلايا هاجروا ومجموع الخلايا في عنصر التحكم في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر نتائج الممثل تظهر التهجير من NK خلايا ومجموعات فرعية T-خلية باستخدام البشري الدم في الدماغ نموذج الحاجز (الشكل 1A). تم التحقق من صحة سلامة أحادي الطبقة HBMEC قبل تلطيخ من مفترق الطرق جزيء ضيق المقاومة الكهربائية القياسات (طير) transendothelial ZO-1، وإيفانز تخلل الأزرق (الشكل 1B). وبعد 3-4 أيام وأعرب ثقافة HBMEC وضيق تقاطع جزيء ZO-1 (الشكل 1B، يسار). وعلاوة على ذلك، نمت HBMEC في الطبقات الوحيدة العارضة المقاومة transendothelial الكهربائية (1B الشكل وسط)، وكذلك انخفاض تخلل عن ايفانز الأزرق (الشكل 1B، يمين). واستخدمت الطبقات الوحيدة HBMEC لدراسة التهجير من الخلايا القاتلة الطبيعية بما في ذلك CD56 CD16 مشرق قاتمة / - وCD56 CD16 + قاتمة فرعية NK الخلية والخلايا T بما في ذلك CD4 + والخلايا عن اثنين من السابق CD8 + Tamples (الشكل 1D + E، على التوالي). تم احتساب النسبة المئوية للخلايا هاجر على أساس عدد الخلايا التي تم الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي وتطبيع fluorospheres باستخدام حساب تدفق باعتبارها الرقابة الداخلية (الشكل 1C). وقد حفز أحادي الطبقة HBMEC مع IFN-γ و24H TNF-α قبل الفحص لتقليد حالات الالتهابات. أدى التحفيز خلوى في زيادة الهجرة من جميع السكان اللمفاويات تحليلها. وهذا قد يكون بسبب زيادة تعبير عن جزيئات الالتصاق بما في ذلك ICAM-1 (لا تظهر البيانات). CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK أظهرت قدرة المهاجرة أعلى بالمقارنة مع CD56 CD16 + خافت NK عبر كل unstimulated (10.88٪ مقابل 0.86٪) وIFN-γγ / TNF-α حفز (18.22٪ مقابل 2.94٪) HBMEC (1D الشكل). ومع ذلك، كانت الزيادة النسبية للهجرة نتيجة لالتهاب العليا للCD56 CD16 + قاتمة مقابل + 167٪ للCD56 CD16 مشرق قاتمة / -). هذه النتائج تحاكي في الجسم الحي الملاحظات التي CD56 CD16 مشرق قاتمة / - يتم إثراء خلايا NK في حجرة داخل القراب. وبالتالي، فإن النموذج حاجز الدم في الدماغ ويبدو أن تكون مناسبة لتحليل المبادئ الأساسية للانسلال خلايا المناعة من السكان لمفاوية نادر في الجهاز العصبي المركزي 21. وأخيرا، يظهر قدرة transmigratory من CD4 و CD8 فرعية T-الخلية (الشكل 1E).

شكل 1
الشكل 1: التفاضلية هجرة مجموعات فرعية NK الخلية عبر Uninflamed والملتهبة HBMEC الطبقات الوحيدة. A. صورة لإدراج transwell (يسار) والتوضيح من الإعداد التجريبية (يمين). B. التحقق من وظائف حاجز HBMEC. اليسار: تلطيخ المناعى من مول تقاطع ضيقecule ZO-1 باستخدام أرنب مكافحة الإنسان ZO-1 (abcam، 1: 200) والماعز المضادة للأرنب مفتش-CY3 (1: 300) على HBMEC المزروعة لمدة 3 أيام. المركز: المقاومة transendothelial الكهربائية (طير) من HBMEC بين يوم 2 و يوم 4 من زراعة. اليمين: المنحنى القياسي لإيفانز تخلل الأزرق للHBMEC مع التحفيز ( "ملتهبة"، الأحمر) أو بدون ( "uninflamed"، أسود) مع 500 U / مل IFN-γ وTNF-α لمدة 24 ساعة. يتم تنفيذ المقايسات التهجير 72 - بعد 96 ساعة البذر من HBMEC (السهم الأسود). CE. تعرض PBMC المستمدة من 16 أشخاص أصحاء لفحوصات الهجرة كما هو موضح في قسم البروتوكول. 24 ساعة قبل الفحص، وحفز نصف إدراج ثقافة الخلية مع 500 وحدة دولية / مل IFN-γ وTNF-α. تم حصاد الخلايا Transmigrated وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. C. الممثل نتائج PBMC مشتقة من عنصر التحكم في المختبر بشكل جيد (أعلى) وبعد الهجرة عبر HBMEC uninflamed (القاع). NK سل تم بوابات ليرة سورية من مجموع الخلايا الليمفاوية كما CD3 - CD56 + الخلايا، كما ميز في CD56 CD16 مشرق قاتمة / - ( "CD56 مشرق") وCD56 CD16 + قاتمة ( "CD56 قاتمة") فرعية NK-الخلية. تم بوابات fluorospheres عدد التدفق ( "الخرز") على أساس FSC / الخصائص التعاون بين بلدان الجنوب وتحديد عددهم في FL3 مقابل مؤامرة الوقت. حسابات نموذجية لتحديد النسبة المئوية للخلايا CD56 CD56 مشرق وخافت NK هاجر ترد على اليمين. D. النسبة المئوية للخلايا NK هاجر وكذلك CD56 CD56 مشرق وقاتمة فرعية NK الخلية، وE. النسبة المئوية للخلايا T هاجروا منها CD4 + CD8 + ومجموعات فرعية T-الخلية التالية التهجير عبر uninflamed (أسود) أو ملتهبة (الحمراء) يصور HBMEC كما يعني ± SEM. تم حساب قيم P التي تقرن الطالب اختبار t. ** ف <0.01 ***، ف <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم تقنية للتحقيق في التهجير من الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري. في تحليل المختبر الهجرة اللمفاويات إلى الجهاز العصبي المركزي هو مهم لدراسة العمليات الأساسية للتسرب الخلايا اللمفاوية، والتعديلات المحتملة المتعلقة بالمرض، وطرق علاجية جديدة.

العديد من التعديلات من طراز حاجز الدم في الدماغ ممكنة. على سبيل المثال، يمكن تحليل الخلايا من المقصورة العليا للتحقيق في التركيبة السكانية الخلايا غير ترحيلها. وعلاوة على ذلك، وعلاج أحادي الطبقة HBMEC مع IFN-γ وTNF-α قبل 24 ساعة من الفحص يمكن أن تستخدم لتقليد حاجز الدم في الدماغ ملتهبة من أجل دراسة تأثير اضطرابات الجهاز العصبي المركزي التهابات 21 و 25. وبالمثل، علاج HBMEC أو الخلايا الليمفاوية مع مواد أخرى تسمح بالتحقيق آثارها على تسرب الخلايا اللمفاوية (على سبيل المثال بهمالتأثير على جزيئات الالتصاق) 30، 31. تورط بعض جزيئات الالتصاق يمكن دراستها باستخدام أجسام مضادة عرقلة لintegrins أو بروابط من 32. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد التجريبية المقدمة هنا يسمح تحليل الآثار الكيميائي من كيموكينات أو supernatants المستمدة من الخلايا النجمية أو الخلايا الأخرى 33 و 34. استبدال HBMEC مع الدماغ البشري الخلايا الظهارية الأولية المستمدة يوسع نطاق هذا الإعداد التجريبية للتحقيق في الدم النخاعي حاجز السوائل (15). يجب أن لا يتم استبدال HBMEC مع الخلايا البطانية مخلد أو الخلايا المشتقة من الأجهزة الأخرى للحفاظ على الجهاز العصبي المركزي خصوصية النموذج. ومع ذلك، والخلايا البطانية المستمدة من الدماغ من الأنواع الأخرى يمكن استخدامها لتحليل التهجير في الحيوانات منها 35. وبالإضافة إلى ذلك، حمض الريتينويك أو HYDR وقد وصفت ocortisone لزيادة وظائف الحاجز وبالتالي قد تكون استخدمت 36 و 37. في حالة أرقام الهواتف المحمولة محدودة قد يتم تخفيض كمية من الخلايا تخضع لفحص، لأن نموذجنا يوفر معدلات الاسترداد خطية بين 2 × 10 5 و 1 × 10 6 PBMC (لا تظهر البيانات). لتحليل السكان الخلية نادرة التالية التهجير قد يكون من الضروري للخلايا تجمع من عدة آبار من أجل الحصول على خلايا كافية اللازمة لالتدفق الخلوي. وأخيرا، يمكن أن تستخدم أيضا لدينا الإعداد التجريبية لدراسة توصيل الدواء إلى الجهاز العصبي المركزي 38. وعادة ما يتم استخدام حجم المسام من 3 ميكرون للسماح لمفاوية التهجير، في حين أن حجم المسام من 0.4 ميكرون يمنع اللمفاويات التهجير، ولكن يسمح لدراسة تقديم الأدوية 39، 40، 41، 42.

الصورة = "jove_content"> وعلى الرغم من تطبيقات مختلفة من الإعداد التجريبية وصفها هنا، يجب أن يوضع في الاعتبار لضمان تحقيق نتائج ذات مغزى عدة نقاط. سلامة غشاء مسامي وكذلك أحادي الطبقة HBMEC أمر بالغ الأهمية. وبالتالي، فمن إلزامية لتجنب الضرر المادي للغشاء، على سبيل المثال مع نصائح الماصة. يجب أن يتم تنفيذ إضافة السوائل أو تعليق خلية إلى الجزء العلوي من إدراج الثقافة الخلية دون الاتصال المباشر. قد مسحت قطرات من على حدود إدراج الثقافة الخلية. وضع أفقي من طرف الماصة يضمن حماية الغشاء، وعندما يتم شطف الغشاء مجافي اللمعة في نهاية الفحص الهجرة. جودة أحادي الطبقة HBMEC يمكن تحليلها بواسطة التقييم المجهري للالتقاء وكذلك إيفانز تخلل الأزرق كما هو موضح لتقييم سلامة الدم في الدماغ حاجز في اختبارات على القوارض 43. الطرد المركزي من HBMEC على قوات ز منخفضة واستخدام الممرات الأولى (أي

وعلى الرغم من الالتزام بروتوكول الموصوفة هنا يضمن نتائج مجدية وقابلة للتكرار، وهذا الأسلوب له بعض القيود. أولا وقبل كل شيء، في الجسم الحي يتم تشكيل حاجز الدم في الدماغ عن طريق عدد من الخلايا، والتي تتفاعل بطرق مختلفة، وتعزيز وظيفة الحاجز من خلال التأثير على تشكيل منعطفات ضيقة 1. لذلك، على الرغم من أن هذا النموذج حاجز الدم في الدماغ هو تقريب جيد للوضع في الجسم الحي، جوانب هامة مفقودة. وبالإضافة إلى ذلك، لمفاوية تسرب في الجهاز العصبي المركزي عبر حاجز الدم في الدماغ هو عملية متعددة الخطوات. في حين أن كل خطوة واحدة يمكن أن يتم التحقيق بشكل منفصل، والتقنية المقدمة هنا لا يقدم معلومات عن الذينعملية جنيه من التسرب تحت تأثير قوى القص 44، 45، 46. وأخيرا، وتحليل خلايا هاجروا من PBMC قد تكون صعبة اعتمادا على وتيرة من الخلايا في المصالح، لأن الترددات من رقم واحد عادة فقط من خلايا transmigrate. لذلك، والفصل بين السكان من الفائدة قبل الفحص أو تجميع الخلايا هاجروا عبر إدراج ثقافة خلية متعددة قد تكون ضرورية. نماذج أخرى لتحليل الهجرة الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي وتشمل بعض الجوانب عداد المفقودين في نموذجنا. تستخدم المشارك الثقافة مع الخلايا النجمية، pericytes، و / أو الخلايا العصبية لتقليد تعقيد حاجز الدم في الدماغ أفضل 47. نماذج بما في ذلك قوى القص مثل DIV-BBB تعكس المزيد من الظروف الفسيولوجية، وبالتالي، تمكن من تحليل أكثر تطورا من اللمفاويات انسلال 48. وخلاصة القول، نقدم تقنية يمكن الوصول إليها بسهولة مناسبة للتحقيق في النوعي والكمي انسلال اللمفاويات عبر حاجز الدم في الدماغ البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3, (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177, (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68, (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7, (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254, (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72, (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275, (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81, (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248, (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6, (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211, (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16, (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502, (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812, (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185, (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2, (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36, (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40, (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66, (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35, (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172, (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65, (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234, (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128, (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140, (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6, (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86, (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818, (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9, (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31, (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26, (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243, (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229, (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8, (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33, (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75, (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48, (3), 505-516 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics