Analyse des Lymphocytes extravasation L'utilisation d'un * These authors contributed equally

Immunology and Infection

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Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

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Abstract

Lymphocyte extravasation dans le système nerveux central (SNC) est essentiel pour la surveillance immunitaire. altérations liés à la maladie de l'extravasation des lymphocytes pourraient entraîner des changements physiopathologiques du système nerveux central. Ainsi, l'enquête sur la migration des lymphocytes dans le système nerveux central est important de comprendre les maladies inflammatoires du système nerveux central et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous présentons ici un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau humain pour étudier extravasation des lymphocytes. les cellules endotheliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) sont cultivées confluente sur un téréphtalate de polyéthylène poreux Transwell insérer pour imiter l'endothélium de la barrière hémato-encéphalique. Fonction de barrière est validée par l'immunohistochimie de zonula, des mesures de résistance électrique (TEER) transendothéliale ainsi que l'analyse de permeation bleu Evans. Ce modèle permet d' étudier la diapédèse des sous - ensembles de lymphocytes rares tels que CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK. e plusle minerai, les effets d'autres cellules, des cytokines et des chimiokines, des altérations liées à la maladie, et les schémas thérapeutiques distincts sur la capacité migratoire des lymphocytes peut être étudiée. Enfin, l'impact des stimuli inflammatoires, ainsi que différents régimes de traitement sur la barrière endothéliale peuvent être analysées.

Introduction

la migration des lymphocytes du sang dans les tissus est crucial pour la surveillance immunitaire. Une séquence d'interactions moléculaires spécifiques assure le site extravasation spécifique dans l' intestin grêle, peau, ganglions lymphatiques, le système nerveux central (SNC) et d' autres tissus 1. Les modifications de la migration des lymphocytes sont impliqués dans la physiopathologie d'un certain nombre de maladies largement répandus 2. La migration dans le SNC immuno-privilégié est étroitement régulée , et en conséquence des modifications de ce procédé sont impliqués dans les maladies liées au SNC, comme l' encéphalomyélite 3, la neuromyélite optique, accident vasculaire cérébral et la sclérose en plaques (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Il est donc important d'étudier extravasation des lymphocytes pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie et de développer des outils pour une mélioration de la charge de morbidité 8, 9, 10, 11, 12.

Les lymphocytes migrent dans le système nerveux central par des voies distinctes. Extravasation à travers veinules post - capillaires dans l'espace sous - arachnoïdien par l' intermédiaire de la barrière de fluide céphalo-sang dans les plexus choroïdes et à travers la barrière sang-cerveau ont été décrits 1, 13, 14, 15. La migration à travers la barrière hémato-encéphalique est réalisée par l'interaction des lymphocytes avec des cellules endotheliales 14. Contrairement aux cellules endotheliales à la périphérie, les cellules endotheliales du système nerveux central expriment de grandes quantités de molécules de jonctions serrées, ce qui limite strictement la quantité de cellules et de protéines capables de traverser la barrière hémato-encéphaliquelass = "xref"> 16. Résultats de l'inflammation dans le desserrage des jonctions serrées et induit l'expression de molécules d'adhésion; Ainsi, l' amélioration de la migration des lymphocytes dans le SNC 1, 17, 18.

Extravasation via la barrière hémato-encéphalique est un processus en plusieurs étapes. Lymphocytes attache aux cellules endothéliales et ensuite rouler le long de l'endothélium dans un procédé principalement médiée par les sélectines 1, 15. Par la suite, les interactions entre les chimiokines sécrétées par l'endothélium et les récepteurs de chimiokines respectifs exprimés sur les lymphocytes induisent des changements conformationnels d'intégrines, favorisant ainsi l' adhésion ferme aux cellules endothéliales 1. Enfin, les lymphocytes, soit exploration le long de la barrière endothéliale contre le flux sanguin avant transmigrant dans l'espace périvasculaire, ou bloquer immédiatement et directement transmigrate au niveau du site d'adhérence de la firme 1, 19, 20. Toutes ces étapes de l' extravasation des lymphocytes peuvent être analysés in vitro en utilisant des techniques distinctes 21. La microscopie vidéo time-lapse est utilisé pour étudier la fixation initiale et le laminage 15. Des tests d'adhésion fournissent des informations détaillées sur l' arrestation ferme endothéliale barrières 22. Des dosages de transmigration comme démontré ici permettent l' analyse de la transmigration des cellules immunitaires 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Utilisation de l'humain in vitro modèle de barrière hémato-encéphalique, on pourrait montrer récemment que plus migrla capacité de Atory de CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK par rapport à leur CD56 CD16 + dim homologues est reflété par une prédominance de ce sous - ensemble des cellules NK dans le compartiment 21 intrathécale. Ainsi, notre dispositif expérimental semble être approprié pour simuler la situation in vivo.

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Protocol

1. Culture cellulaire des cellules cérébrales microvasculaire endothéliales humaines (HBMEC)

  1. Revêtement des flacons de culture cellulaire
    1. Pour préparer la solution de fibronectine, ajouter 10 ml de PBS à un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 150 pi fibronectine et bien mélanger.
    2. Pour couvrir le fond d'un flacon de culture de cellules T-25 ajouter 2 mL de la solution de fibronectine. Incuber le flacon de culture cellulaire pendant au moins 3 h à 37 ° C dans l'incubateur. Des flacons revêtus de fibronectine peuvent être stockés pendant 2 semaines à 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Et Ensemencement culture cellulaire de HBMEC
    1. Aspirer la solution de fibronectine à partir du fond du flacon de culture de cellules. Ajouter 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspension dans 6 ml de milieu ECM-b (= ECM-B supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de supplément de croissance des cellules endothéliales). Incuber à 37 ° C / 5% CO 2. Vérifiez la croissance cellulaire à l'aide quotidienne d'un microscope.
    2. Changer le support tous les 3 jours.Récolte ou fractionnement de cellules, lorsque HBMEC atteignent la confluence d'environ 80%. HBMEC doit être utilisé entre le passage 1 et 15 pour éviter la perte des propriétés physiologiques.
  3. Récolte HBMEC.
    1. Préparer Accutase solution en mélangeant Accutase (1x) avec du PBS dans un rapport de 1: 1. Maintenir Accutase solution à 37 ° C dans un bain d'eau jusqu'à utilisation ultérieure.
    2. Transfert moyen ECM-b de la fiole de culture de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Laver HBMEC par addition de 5 ml de PBS au fond du flacon de culture de cellules. Aspirer PBS et répéter l'étape de lavage deux fois de plus.
    3. Ajouter une solution préchauffée Accutase 2 ml. Incuber à 37 ° C pendant 2 min. Par la suite, HBMEC sont remis en suspension en appuyant fermement le flacon de culture cellulaire à plusieurs reprises. détachement des cellules est contrôlée à l'aide d'un microscope
    4. L'ECM-b-support précédemment stocké dans un tube de 15 ml est ajouté à nouveau dans le ballon de culture de cellules dès HBMEC commencent à se détacher. Rincer à plusieurs reprises le fond du flacon jusqu'à ce que la plupart sont HBMECremis en suspension.
    5. Transférer la suspension cellulaire à un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu ECM-b. Compter les cellules et on dilue la suspension de cellules pour obtenir une concentration finale de 3 x 10 5 ml de milieu par HBMEC ECM-b.

2. Préparation des inserts pour la culture cellulaire

  1. Le revêtement des inserts de culture cellulaire
    Remarque importante: Évitez de toucher la membrane des inserts de culture cellulaire.
    1. Ajouter une solution de 100 ul de fibronectine (voir 1.1.1) de chaque insert de culture de cellules (Figure 1A) et un puits d'une plaque à fond plat à 96 puits (puits de contrôle optique). Incuber pendant au moins 3 h à 37 ° C. Après incubation de la solution aspirée fibronectine.
    2. Ajouter 100 pi suspension HBMEC aux inserts de culture cellulaire et le puits de contrôle optique. Ajouter 600 ul de milieu ECM-B vers le compartiment inférieur de la celluleinserts de culture. Incuber pendant 3 - 4 jours à 37 ° C / 5% de CO2 jusqu'à ce que l' intégrité de la barrière (figure 1B) est atteinte, vérifier la croissance cellulaire par évaluation microscopique du HBMEC dans le puits de contrôle optique. Note: La croissance cellulaire au-delà de quatre jours est pas recommandé.
    3. Facultatif: Pour reproduire les conditions inflammatoires Aspirer le milieu du compartiment inférieur et le remplacer par du milieu ECM-B supplémenté avec 500 U / ml d'IFN-γ / TNF-α de 24 h avant l'essai de migration.

3. Contrôle de la qualité avec Evans bleu le jour du dosage Transmigration

  1. Préparation de la solution bleu evans
    1. Pour préparer une solution de mélange PBS / B27 10 ml de PBS avec 200 ul de complément B27 en utilisant un tube à centrifuger de 15 mL. Diluer la solution mère bleu Evans (20 mg / ml de PBS) 1: 1000 avec du PBS / B27.
  2. Evans essai de perméabilité bleu
    1. Aspirer le milieu du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieurd'un insert de culture cellulaire contenant une monocouche confluente HBMEC. Ajouter 100 ul d'une solution bleu evans à l'insert de culture cellulaire.
    2. Ajouter 600 ul de PBS / B27 dans le compartiment inférieur et incuber pendant 60 min à 37 ° C / 5% CO 2. Retirez délicatement l'insert de culture cellulaire en utilisant une pince.
  3. Evans mesure bleu
    1. Retirer PBS / B27 du compartiment inférieur et le transfert de 100 ul de chacun de deux puits d'une polystyrol noir plaque de 96 puits à fond plat. Insérer la plaque dans un lecteur de plaque Tecan Pro infini M200 et déterminer position z optimal.
    2. excitation de la mesure de Evans en utilisant des paramètres respectifs bleu (par exemple: excitation: 620 nm, émission: 680 nm, largeur de bande d'excitation: 9 nm, largeur de bande d'émission: 20 nm, l'amélioration de 175x, 25 clignote, le temps d'intégration: 20 us).
    3. Pour déterminer les fonctions de barrière HBMEC pour comparer les données acquises à une courbe étalon représentant permeation bleu Evans à travers HBMEC à différents points de temps après la semencecellules ING (Figure 1B, à droite).

4. Essai de migration

  1. Préparation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC).
    1. Ajouter 10 ml RPMI dans un tube de centrifugation de 15 ml et ajouter 200 pi supplément B27. Count PBMC et les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min. Re-suspendre PBMC à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml de RPMI / B27.
  2. Mise en place du test de migration
    1. Aspirer moyen du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieur d'inserts de culture cellulaire contenant des monocouches confluentes HBMEC (figure 1A). Par donneur d' ajouter 100 uL de suspension de PBMC chacun des inserts de culture cellulaire et également à un puits d'une plaque à 24 puits par (contrôle in vitro).
    2. Ajouter 600 ul de RPMI / B27 dans le compartiment inférieur des inserts de culture cellulaire et de 500 ul de la PBMC du contrôle in vitro et incuber 6 heures à 37 ° C / 5% CO 2.
    3. La récolte des PBMC migrée
      1. Retirez l'insert de culture cellulaire à l'aide des pinces et rincer soigneusement le fond avec 400 ul de PBS sans toucher la membrane. Jeter l'insert de culture cellulaire.
      2. Ajouter 20 ul Fluorospheres de comptage de débit (environ 1000 perles / ul) au compartiment inférieur de la culture cellulaire insérer ainsi que pour le contrôle in vitro et bien mélanger. Transfer 1 ml de suspension de PBMC résultant de cytométrie en flux tubes.

    5. cytométrie en flux

    1. La préparation des échantillons
      1. Centrifugeuse PBMC à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
      2. Préparer la solution d'anticorps par addition d'un fluorochrome conjugué d'anticorps à 100 pi de tampon de cytométrie en flux (PBS / 1% BSA / EDTA 2 mM) par échantillon. Pour les résultats présentés ci-dessous 1 ul CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pl CD56-PC7, 1 pi CD8-A700 et 1 ul CD16-A750 ont été utilisés par échantillon.
      3. Resuspendre PBMC dans 100 ul de la solution d'anticorps et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
      4. Ajouter tampon cytométrie de flux 250 uL et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
    2. acquisition d'échantillons
      1. Re-suspendre PBMC en la quantité requise (varie en fonction du cytomètre de flux utilisé) de cytométrie de flux tampon.
      2. Acquérir coloré les PBMC en utilisant un cytomètre à écoulement avec un détecteur actif entre 525 et 700 nm de longueur d'onde pour détecter Fluorospheres de comptage de débit (excitation 488 nm, émission 525 à 700 nm).
        (Les étapes suivantes sont, par exemple, si un flux Gallios cytomètre fonctionnant avec le logiciel Kaluza G est utilisé:. (1) Démarrer l'ordinateur (2) Lorsque le système d'exploitation est entièrement chargé, démarrer le cytomètre à écoulement en appuyant sur le « cytomètre sur bouton » . (3) Chargez le protocole d'acquisition respectif en appuyant sur le bouton « protocole ouvert ». (4) Choisissez le protocole requis et sélectionnez « ouvrir ». (5) en double le protocole pour chaque échantillon en cliquant avec le droitbouton de la souris sur le protocole visible dans le carrousel virtuel et un clic gauche sur le terrain « en double ». (6) d'étiquetage de chaque échantillon dans la liste de l'échantillon. (7) Transférer les échantillons aux positions indiquées sur le carrousel et commencer l'acquisition.)
    3. L'analyse des échantillons
      1. Ouvrir flux résultant cytométrie données à l'aide du logiciel respectif. Déterminer le nombre de sous - populations d'intérêt pour transmigré PBMC ainsi que les cellules provenant de puits de contrôle in vitro et de débit comptage Fluorospheres en utilisant le logiciel d'analyse respective.
        (Un exemple de la stratégie de déclenchement est donnée dans la partie des résultats (Figure 1 C: Pour analyser la transmigration des sous - ensembles de cellules NK, d' abord sélectionner les lymphocytes dans un canal de diffusion latéral (SSC) par rapport au canal de diffusion vers l' avant (FSC) parcelle Lymphocytes sont. puis affichés dans une CD3 contre parcelle CD56 et CD56 + CD3 -. Les cellules NK sont choisies pour distinguer entre les sous - ensembles des cellules NK, les cellules NK sont affichées dansCD56 contre CD16 intrigue et CD56 CD16 lumineux dim / - ainsi que CD56 CD16 + dim cellules NK sont sélectionnées. En outre, comptage de flux Fluorospheres sont choisis parmi un FSC contre SSC terrain et par la suite affichées dans une trame d'un canal avec une émission entre 525 et 700 nm en fonction du temps pour déterminer leur nombre.)
      2. Pour calculer le nombre total de cellules de chaque échantillon, à normaliser le nombre détecté de cellules en utilisant Fluorospheres de comptage de débit:
        Équation
      3. Déterminer le pourcentage de cellules ayant migré comme rapport entre les cellules totales et les cellules ayant migré au total dans le contrôle in vitro.

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Representative Results

Les résultats représentatifs montrant transmigration des sous - ensembles de cellules NK et de lymphocytes T en utilisant le modèle de barrière sang-cerveau humain (figure 1A) sont représentés. L'intégrité de la monocouche mesures HBMEC a été validé par la coloration de la molécule de jonction étanche ZO-1, transendothéliaux résistance électrique (TEER), et permeation bleu Evans (figure 1B). Suite à 3 - 4 jours de culture HBMEC a exprimé la molécule de jonction étanche ZO-1 (figure 1B, gauche). En outre, HBMEC a augmenté dans des monocouches présentant une résistance électrique transendotheliale (Figure milieu 1B), ainsi que la perméation réduite pour le bleu Evans (figure 1B, à droite). Monocouches HBMEC ont été utilisés pour étudier la transmigration des cellules NK CD56 y compris CD16 lumineux dim / - et CD56 dim CD16 + sous - ensembles des cellules NK et les lymphocytes T , y compris CD4 + et CD8 + cellules T que deux examples (Figure 1D + E, respectivement). Le pourcentage de cellules ayant migré a été calculé sur la base de comptages de cellules obtenus par cytométrie de flux et normalisés en utilisant Fluorospheres de comptage de flux en tant que contrôle interne (Figure 1C). La monocouche HBMEC a été stimulées avec IFN-γ et TNF-α 24 heures avant l'essai pour simuler les états inflammatoires. la stimulation Cytokine a entraîné une migration accrue de toutes les populations de lymphocytes analysés. Cela peut être dû à une expression accrue des molécules d'adhésion, y compris ICAM-1 (données non présentées). CD56 CD16 lumineux dim / - Les cellules NK ont présenté une capacité de migration plus élevée par rapport à leur faible CD56 CD16 + NK à travers à la fois non stimulées (10,88% vs 0,86%) et de l' IFN-γγ / TNF-α stimulée (18,22% vs 2,94%) HBMEC (Figure 1D). Cependant, l'augmentation relative de la transmigration en raison de l' inflammation était plus élevée pour le CD56 dim CD16 + vs + 167% pour CD56 CD16 lumineux dim / -). Ces résultats imitent les in vivo observations CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK sont enrichies dans le compartiment intrathécale. Ainsi, le modèle de barrière hémato -encéphalique semble être approprié pour analyser les principes de base de diapedesis-cellules immunitaires des populations de lymphocytes rares dans le système nerveux central 21. Enfin, la capacité de transmigrations des CD4 et CD8 des sous - ensembles de cellules T est représentée (figure 1E).

Figure 1
Figure 1: La migration différentielle des sous - ensembles de cellules NK à travers non enflammée et enflammée HBMEC monocouches. A. Une image des inserts Transwell ( à gauche) et illustration du dispositif expérimental ( à droite). B. Validation des fonctions de barrière HBMEC. À gauche: immunohistochimie de la jonction étanche molecule ZO-1 en utilisant lapin ZO-1 anti-humain (Abcam, 1: 200) et une IgG de chèvre-anti-lapin Cy3 (1: 300) sur HBMEC cultivées pendant 3 jours. Centre: résistance électrique transendotheliale (TEER) de HBMEC entre le jour 2 et le jour 4 de la culture. A droite: courbe standard pour Evans permeation bleu pour HBMEC avec ( "inflammation", rouge) ou sans ( "non enflammée", noir) stimulation avec 500 U / ml d'IFN-γ et TNF-α pendant 24 heures. des dosages de transmigration sont effectuées 72 - 96 heures après l'ensemencement de la HBMEC (flèche noire). CE. PBMC provenant de 16 personnes en bonne santé ont été soumis à des essais de migration comme décrit dans la section du protocole. 24 h avant l'essai, la moitié des inserts de culture de cellules ont été stimulées avec 500 UI / mL d'IFN-γ et TNF-α. les cellules transmigré ont été récoltées et analysées par cytométrie en flux. C. Les résultats représentatifs pour les PBMC dérivées à partir du puits de contrôle in vitro (en haut) et après la migration à travers HBMEC non enflammée ( en bas). NK cel ls ont été déclenchés à partir de lymphocytes totaux que CD3 - CD56 + et les cellules CD56 en outre distingué CD16 lumineux dim / - ( "CD56 bright ") et CD56 CD16 + dim (" CD56 dim") des sous - ensembles de cellules NK. comptage de flux fluorosphères ( « perles ») ont été bloqués en fonction des caractéristiques FSC / SSC et leur nombre a été déterminé dans un FL3 par tranche horaire. Calculs exemplaires pour déterminer le pourcentage de cellules CD56 migrées lumineux et NK CD56 faible sont indiqués à droite. D. Pourcentage de cellules NK migrées ainsi que CD56 et CD56 lumineux sombres des sous - ensembles de cellules NK et E. pourcentage de lymphocytes T CD4 + , y compris migrées et CD8 + des sous - ensembles de cellules T suivantes transmigration à travers non enflammée (noir) ou enflammée (rouge) HBMEC représenté en moyenne ± SEM. Les valeurs P ont été calculées par le test t de Student apparié; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous présentons ici une technique pour étudier la transmigration des lymphocytes à travers la barrière sang-cerveau humain. L'analyse in vitro de la migration des lymphocytes au système nerveux central est important d'étudier les processus de base de l' extravasation des lymphocytes, des altérations liées aux maladies potentielles, et de nouvelles approches thérapeutiques.

Plusieurs modifications du modèle de barrière hémato-encéphalique sont possibles. Par exemple, des cellules provenant du compartiment supérieur pourraient être analysés pour étudier la composition de la population de cellules non-migré. En outre, le traitement de la monocouche HBMEC avec IFN-γ et TNF-α de 24 heures avant le test peut être utilisé pour simuler une barrière hémato-encéphalique enflammé afin d'étudier l'effet des troubles inflammatoires du système nerveux central 21, 25. De même, le traitement des HBMEC ou des lymphocytes avec d' autres substances permet enquêter sur leurs effets sur l' extravasation des lymphocytes (par exemple leureffet sur les molécules d'adhérence) 30, 31. L'implication de certaines molécules d'adhésion peut être étudiée en utilisant des anticorps bloquants pour les intégrines ou leurs ligands 32. En outre, le dispositif expérimental présenté ici permet une analyse des effets chimiotactiques de chimiokines ou surnageants dérivés de astrocytes ou d' autres cellules 33, 34. Le remplacement du cerveau humain avec HBMEC primaires dérivées de cellules épithéliales élargit le spectre de ce montage expérimental pour l' étude de la barrière de fluide céphalorachidien 15 sang. HBMEC ne doit pas être remplacé par des cellules endothéliales immortalisées ou des cellules dérivées d'autres organes du système nerveux central pour maintenir la spécificité du modèle. Cependant, les cellules endothéliales provenant d' autres espèces dérivées du cerveau pourraient être utilisés pour analyser transmigration chez les animaux respectifs 35. De plus, l'acide rétinoïque ou hydrocortisone ont été décrits pour augmenter les fonctions de barrière et peut ainsi être employée 36, 37. Dans le cas du nombre de cellules limitées à la quantité de cellules soumises à l'essai peut être réduite, parce que notre modèle fournit des taux de récupération linéaires entre 2 x 10 5 et 1 x 10 6 CMSP (données non présentées). Analyser les populations rares de cellules suivantes transmigration il peut être nécessaire aux cellules de la piscine de plusieurs puits afin d'obtenir suffisamment de cellules nécessaires à la cytométrie de flux. Enfin, notre dispositif expérimental pourrait également être utilisé pour étudier la distribution des médicaments dans le système nerveux central 38. Une taille de pores de 3 um est typiquement utilisé pour permettre la transmigration des lymphocytes, tandis que la taille des pores de 0,4 um empêche transmigration des lymphocytes, mais permet d'étudier l' administration de médicaments 39, 40, 41, 42.

43. De HBMEC à Centrifugation faibles forces g et l' utilisation des premiers passages (c. -à-

Bien que l'adhésion au protocole décrit ici assure des résultats significatifs et reproductibles, cette technique a des limites. Tout d' abord, in vivo la barrière hémato -encéphalique est formé par un certain nombre de cellules qui interagissent de diverses manières et renforcer la fonction barrière en affectant la formation des jonctions serrées 1. Par conséquent, bien que ce modèle de barrière hémato -encéphalique est une bonne approximation de la situation in vivo, les aspects importants manquent. En outre, l'extravasation des lymphocytes dans le système nerveux central à travers la barrière hémato-encéphalique est un processus en plusieurs étapes. Bien que chaque seule étape peut être étudiée séparément, la technique présentée ici ne fournit pas d'informations sur le quiprocessus d'extravasation le sous l'influence des forces de cisaillement 2, 44, 45, 46. Enfin, l'analyse des cellules migrées de PBMC peut être difficile en fonction de la fréquence des cellules d'intérêt, parce que généralement des fréquences à un seul chiffre de cellules transmigrent. Par conséquent, la séparation des populations d'intérêt avant l'essai ou la mise en commun des cellules migrées sur plusieurs inserts de culture cellulaire peut être nécessaire. D'autres modèles pour l'analyse de la migration des leucocytes dans le système nerveux central couvrent certains des aspects manquants dans notre modèle. Co-culture avec des astrocytes, péricytes, et / ou les neurones sont utilisés pour imiter la complexité de la barrière hémato -encéphalique mieux 47. Les modèles y compris les forces de cisaillement telles que DIV BBB reflètent plus les conditions physiologiques, ainsi, ce qui permet une analyse plus sophistiquée de diapédèse des lymphocytes 48. En résumé, nous présentons une technique facilement accessible adapté à l'enquête sur la diapédèse des lymphocytes qualitative et quantitative à travers la barrière sang-cerveau humain.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

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References

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