इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र Neuronal ऊतक लंबे समय तक ऊष्मायन

Published 2/15/2017
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Neuroscience

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Summary

एक बार शरीर से हटा दिया, न्यूरोनल ऊतक बहुत पर्यावरण की स्थिति से प्रभावित होता है, के बाद 6 ऊतक के अंतिम गिरावट के लिए अग्रणी - 8 h। एक अनूठा ऊष्मायन विधि है, जो बारीकी से नजर रखता है और ऊतक के बाह्य वातावरण को नियंत्रित करता है का उपयोग करना, ऊतक व्यवहार्यता काफी> 24 घंटे के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Cameron, M. A., Kekesi, O., Morley, J. W., Bellot-Saez, A., Kueh, S., Breen, P., et al. Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (120), e55396, doi:10.3791/55396 (2017).

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Abstract

8 घंटे विच्छेदन के बाद - एक्यूट न्यूरोनल ऊतक की तैयारी, मस्तिष्क के स्लाइस और रेटिना wholemount, आमतौर पर केवल 6 बनाए रखा जा सकता है। इस प्रयोगात्मक समय सीमा है, और जानवरों है कि अध्ययन के अनुसार उपयोग किया जाता है की संख्या बढ़ जाती है। इस सीमा विशेष रूप से ऐसे कैल्शियम इमेजिंग कि स्नान लागू रंगों के साथ लंबे समय तक पूर्व ऊष्मायन की आवश्यकता के रूप में प्रभाव डालता प्रोटोकॉल। 3 के भीतर घातीय बैक्टीरिया विकास - टुकड़ा करने की क्रिया के बाद 4 घंटे कसकर ऊतक स्वास्थ्य में कमी के साथ जोड़ा जाता है। इस अध्ययन में तीव्र तैयारी में बैक्टीरिया के प्रसार को सीमित समय की लंबी अवधि (> 24 ज) एंटीबायोटिक दवाओं, बाँझ प्रक्रियाओं, या टिशू कल्चर मीडिया वृद्धि कारक युक्त बिना जरूरत के लिए के लिए व्यवहार्य न्यूरोनल ऊतक बनाए रखने के लिए के लिए एक विधि का वर्णन है। पराबैंगनी विकिरण के माध्यम से बाह्य तरल पदार्थ साइकिल और 15 पर एक कस्टम होल्डिंग कक्ष में ऊतक रखने से - 16 डिग्री सेल्सियस, ऊतक electrophysiological गुण, या कैल्शियम si में कोई अंतर नहीं चलता> 24 घंटे postdissection पर intracellular कैल्शियम रंगों के माध्यम से gnaling। इन तरीकों से न केवल तीव्र न्यूरोनल ऊतक का उपयोग करने वालों के लिए प्रयोगात्मक समय का विस्तार होगा, लेकिन प्रयोगात्मक लक्ष्यों को पूरा करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाएगा, और तीव्र न्यूरोनल ऊतक ऊष्मायन के लिए एक स्वर्ण मानक की स्थापना की जाएगी।

Introduction

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और कार्यात्मक इमेजिंग (कैल्शियम, वोल्टेज संवेदनशील ध्वज) तंत्रिका विज्ञान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक तकनीक से दो हैं। मस्तिष्क टुकड़ा तैयारियाँ और रेटिना wholemount, जो यहाँ की जांच की जाएगी, anesthetics या मांसपेशियों को ढीला से संदूषण के बिना electrophysiological गुण और synaptic कनेक्टिविटी की जांच करने का एक साधन प्रदान करते हैं। मस्तिष्क के स्लाइस और रेटिना wholemount उनकी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने, संस्कृतियों या सेल homogenates के विपरीत, विशिष्ट सर्किट और मस्तिष्क नेटवर्क 1 के अध्ययन की अनुमति। पृथक ऊतक से रिकॉर्डिंग दिल की धड़कन और श्वसन के साथ जुड़े आंदोलनों के रूप में विवो रिकॉर्डिंग से अधिक लाभ का सफाया कर रहे हैं। इसके अलावा, प्रत्यक्ष दृश्य कोशिकाओं के विशिष्ट वर्गों को निशाना बनाया जा सकता है, और औषधीय उपकरण 2, 3 के स्थानीय आवेदन की अनुमति देता है।

पैच दबाना रिकॉर्डिंग और कैल्कIUM डाई लोड हो रहा है रेटिना wholemount में इनर के अस्तित्व झिल्ली (ILM) है, जो रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) परत को शामिल किया गया है और कोशिकाओं के लिए सीधी पहुँच रोकता सीमित द्वारा जटिल है। सामान्यतया, यह झिल्ली एक गिलास पिपेट के साथ दूर scraped है एक एकल कोशिका पर एक पैच पिपेट और एक gigaohm मुहर के गठन के प्रत्यक्ष आवेदन की अनुमति है। इसके अलावा, स्नान लागू कैल्शियम रंगों इल्म पार नहीं करते हैं और या तो यह झिल्ली के नीचे 4 इंजेक्शन होना चाहिए, प्रतिगमनपूर्वक ऑप्टिक तंत्रिका 5 पर निम्न इंजेक्शन ले जाया या ऊतक 6 के माध्यम से electroporated। इसके अलावा, जब रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा की एक कृंतक मॉडल का उपयोग, आरडी / आरडी माउस, इल्म मोटा और अधिक अभेद्य है। यहाँ, हम, enzymatic पाचन 7 के साथ इल्म निकालने के लिए एक तकनीक का उपयोग दोनों सर्वव्यापी कैल्शियम डाई लोड हो रहा है, और पैच दबाना recordi के लिए रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के लिए सीधी पहुँच अनुमति देने के लिएNGS 8।

या तो मस्तिष्क स्लाइस या रेटिना wholemount से सफल रिकॉर्डिंग विच्छेदन और व्यवहार्य न्यूरोनल ऊतक के ऊष्मायन पर निर्भर करते हैं। आमतौर पर, ऊतक प्रयोग की सुबह निकाले और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) में incubated जब तक यह रिकॉर्डिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। आमतौर पर, ऊतक 6 के लिए व्यवहार्य रहता है - 8 घंटे, इस समय खिड़की निम्नलिखित महत्वपूर्ण गिरावट के साथ। हालांकि, दोनों के मस्तिष्क के स्लाइस और wholemount दृष्टिपटल की तैयारी आम तौर पर की तुलना में यह कम समय अवधि के भीतर से दर्ज किया जा सकता है और अधिक ऊतक का उत्पादन। नतीजतन, ऊतक अक्सर दिन के अंत में खारिज कर दिया है और विच्छेदन बाद के दिनों को फिर से पूरा हो गया है। इसका मतलब यह है एक और जानवर का उपयोग किया और ~ 2 सेटअप और विच्छेदन / धुंधला दोहराया की ज रहा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए न्यूरोनल ऊतक के जीवन का विस्तार, कम जानवरों के अर्थ में उपयोग किया जाता है के लिए एक विधि का वर्णन है, और अधिक प्रयोगात्मक समय उपलब्ध है। ऊतक व्यवहार्यता wके रूप में electrophysiological गुण और कैल्शियम की गतिशीलता की रिकॉर्डिंग के माध्यम से मूल्यांकन, और ये गुण <4 h और> 24 घंटे postdissection के बीच पृथक किया गया।

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि न केवल एकल कोशिका गुण लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद बरकरार है और कार्य कर रहे हैं, लेकिन नेटवर्क गतिविधि के रूप में कैल्शियम इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग के द्वारा मूल्यांकन, अपरिवर्तित> 24 घंटे postdissection है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि कैल्शियम रंगों किसी भी हानिकारक प्रभाव के कारण के बिना लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं में रह सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के आवेदन को दर्शाता है कि तीव्र न्यूरोनल ऊतकों में न्यूरॉन्स की कार्यात्मक गतिविधि, एक बार बाहरी वातावरण अत्यधिक विनियमित है लंबी अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा, के रूप में ऊतक व्यवहार्यता अलग ऊष्मायन प्रोटोकॉल के कारण प्रयोगशालाओं के बीच बहुत भिन्न होता है, इस पद्धति है कि तीव्र Neu के स्वास्थ्य में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए लागू किया जाना चाहिए आदर्श मानकों के लिए एक स्वर्ण मानक स्थापित करता हैRonal ऊतक।

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Protocol

नीचे प्रोटोकॉल C57BL / 6 और C3H / वह (retinally पतित) माउस न्यूरोनल ऊतक की तैयारी का वर्णन है, लेकिन इसी तरह की तकनीक अन्य प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है। सभी जानवरों को स्वस्थ और तापमान की मानक स्थितियों, आर्द्रता, 12 घंटे / प्रकाश अंधेरे चक्र, भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ संभाल रहे थे, और किसी भी इरादा तनाव उत्तेजनाओं के बिना। सभी प्रयोगों को मंजूरी दे दी और पश्चिमी सिडनी विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और आचार समिति के अनुसार में प्रदर्शन और पशुओं के उपयोग और देखभाल के दिशा निर्देशों (पशु अनुसंधान प्राधिकरण # A9452, # A10396 और # A8967) के अनुसार किया गया।

1. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी

  1. isoflurane (5%) की साँस लेना द्वारा पशु anesthetize और एक कृंतक गिलोटिन का उपयोग कर सिर काटना। के रूप में पहले 9 में वर्णित है, जल्दी से मस्तिष्क निकालें और ठंडा शारीरिक समाधान (ACSF) (मिमी में) युक्त में जगह: 125 NaCl, 2.5 KCl, 1 2 MgCl, 1.25 नः 2 पीओ 4, 2 CaCl 2, 253 NaHCO, 25 डेक्सट्रोज, और carbogen के साथ संतृप्त (95% 2 हे / 5% सीओ 2 के मिश्रण; 310 mOsm, 7.4 पीएच)।
  2. मस्तिष्क स्लाइस काटें, ब्याज के क्षेत्र में, 300 माइक्रोन एक हिल microtome के साथ मोटी।
  3. के रूप में पहले 10, 11 में वर्णित है, carbogen प्रवाह, और तापमान - एक कस्टम बनाया ऊष्मायन प्रणाली है कि बारीकी से नजर रखता है और पीएच स्तर (7.4 7.2 पीएच) को नियंत्रित करने के लिए स्लाइस स्थानांतरण।
  4. 15 के लिए 35 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रारंभिक कक्ष तापमान सेट - 30 मिनट, और फिर धीरे से 15 कम - के रूप में चित्रा 1C में दिखाया गया है 16 डिग्री सेल्सियस। फिर, ऊष्मायन प्रणाली में स्लाइस सेते हैं या तो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या इमेजिंग के लिए जब तक जरूरत है।
    नोट: स्लाइस कैल्शियम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल हो रहे हैं, तो आरटी नीचे ऊतक ठंडा करने से पहले नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।

2. रेटिना wholemount तैयारी और इनर सीमित झिल्ली निकालना

  1. या तो सामान्य के तहत रेटिना wholemounts तैयारप्रयोगशाला प्रकाश व्यवस्था की स्थिति या मंद लाल / बुनियादी लाल बत्ती।
  2. ग्रीवा अव्यवस्था और तुरंत पता लगाना आंखों से पशु euthanize। या तो एम्स मीडिया, या aCSF युक्त ओरा सेराटा साथ एक छोटे से कट, और जगह (मिमी) बनाओ: 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 ग्लूकोज, 0.5 एल glutamine, और carbogen साथ तर (95% 2 हे / 5% सीओ 2 के मिश्रण; ~ 300 mOsm, पीएच 7.4), आरटी पर।
  3. इसके तत्काल बाद छोटी कैंची से ओरा सेराटा के साथ काटने और लेंस और संदंश के साथ कांच हटाने के द्वारा कॉर्निया, लेंस और शीशे को हटा दें। आरटी पर ऊष्मायन प्रणाली में ऊतक रखें।
    नोट: रेटिना ऊतक, आंख कप में रखा जा सकता है 15 के लिए धीमी गति से तापमान में कमी के बाद -, ऊष्मायन प्रणाली में> 24 घंटे के लिए की जरूरत तक 16 डिग्री सेल्सियस।
  4. इल्म निकालने के लिए, Earl's- में 30 यू / एमएल papain, 1 मिमी एल Cystine, 0.5 मिमी EDTA और 0.005% DNase युक्त एक छोटे ग्लास जार के लिए आंख-कप रेटिना युक्त हस्तांतरण20 मिनट के लिए बैलेंस्ड नमक समाधान (बीएसएस) 37 डिग्री सेल्सियस पर। ढक्कन के माध्यम से समाधान के लिए लागू 95% 2 हे / 5% सीओ 2 लेकिन बुलबुला नहीं है। अगर युवा जानवरों (<6 सप्ताह) से ऊतक का उपयोग कर, आधा ताकत का हल पतला।
    1. enzymatic पाचन बंद करो, अर्ल बीएसएस में 10 मिनट के लिए एक ovomucoid (10 मिलीग्राम / एमएल) और बीएसए (10 मिलीग्राम / एमएल) के घोल में ऊतक रखकर। 16 डिग्री सेल्सियस - धो ऊतक ACSF के साथ अच्छी तरह से ऊष्मायन प्रणाली को हस्तांतरण से पहले और 15 को तापमान को कम।
  5. आंख कप में रेटिना ऊतक बनाए रखने के लिए जब तक जरूरत है। माइक्रोस्कोप के हस्तांतरण के लिए, आंख कप से रेटिना अलग और एक साथ razorblade 4 टुकड़ों में काट दिया। पूरे रेटिना की आवश्यकता है, यह फ्लैट झूठ बोलने के लिए अनुमति देने के लिए रेटिना की परिधि में चार छोटे कटौती कर सकते हैं।
    नोट: इमेजिंग प्रयोगों, ऊष्मायन प्रणाली को हस्तांतरण से पहले कैल्शियम रंगों के साथ लोड के लिए, नीचे देखें।

3. इनक्यूबेटर में ऊतक बनाए रखने

    (चित्रा 1 ए, बी) युक्त प्लेस ऊतक।
  1. आदेश समाधान में तैर बैक्टीरिया किरणों छिटकाना करने में एक दूसरे कक्ष के माध्यम से प्रसारित aCSF (254 एनएम 5W / 2P अजीवाणु यूवी दीपक) (UVC चैम्बर के रूप में पहले 12 में वर्णित बनाया,) मुख्य कक्ष से अलग और 1.1 UVC प्रकाश डब्ल्यू के संपर्क में (चित्रा 1 ए)। 30 मिनट aCSF के अत्यधिक ताप से बचने के लिए - एक प्रोग्राम टाइमर एक यादृच्छिक विशेषता यह है कि 15 और 26 के बीच हर 15 मिनट पर अलग समय पर बदल जाता है का उपयोग कर के माध्यम से नियंत्रण UVC प्रकाश समय।
  2. 12 एमएल के लिए UVC कक्ष में प्रवाह की दर निर्धारित / मिनट पहले के रूप में 12 की सूचना दी। कक्ष है, जो न्यूरोनल ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकते हैं बाहर UVC रोशनी को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ UVC चैम्बर कवर।
    ध्यान दें: काले अनुकूलित रेटिना ऊतक के लिए, प्रकाश बाहर करने के लिए मुख्य कक्ष के लिए एक कस्टम बनाया कवर लागू होते हैं।
  3. circula करने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का प्रयोग करेंते समाधान (ACSF) दो कक्षों के माध्यम से और एक Peltier thermoelectric ठंड प्लेट या तो शांत या 0 की रेंज में वांछित तापमान के मुख्य कक्ष गर्म करने के लिए कूलर - 50 डिग्री सेल्सियस। दीर्घकालिक व्यवहार्यता के लिए 16 डिग्री सेल्सियस - इष्टतम ऊतक ऊष्मायन के लिए, 15 का उपयोग करें।

4. कैल्शियम डाई लोड

  1. व्यक्तिगत शोधकर्ता की वरीयता के आधार पर कैल्शियम रंगों का चयन करें। यहाँ हम Fura-2 है, Fluo-08:00 या 04:00 Fluo-उपयोग करें। हालांकि, इस पद्धति के रूप में अच्छी तरह से अन्य रंगों के लिए लागू किया जा सकता है: एक 1 मिमी समाधान और 1% copolymers ब्लॉक करने के लिए DMSO में कैल्शियम रंगों भंग (जैसे, pluronic एसिड-127) 10 मिनट के लिए 50 μL के अंतिम मात्रा और sonicate करने के लिए।
  2. aCSF का हल 10 माइक्रोन, मस्तिष्क स्लाइस के लिए 0.01% copolymers ब्लॉक, और 20 माइक्रोन (रेटिना), 0.02% copolymers ब्लॉक रेटिना के लिए के अंतिम एकाग्रता में जोड़े। एफ, 37 डिग्री सेल्सियस (Fura-2 AM) या आरटी पर (Fluo-4 बजे दृष्टिपटल (papain इलाज) और युवा जानवरों, 45 मिनट के लिए स्नान के लिए लोड से मस्तिष्क स्लाइस मेंलुओ-8 बजे)।
    1. वयस्क जानवर, (> 12 सप्ताह) के लिए रंगों (50 μL) सीधे मस्तिष्क के स्लाइस पर पिपेट, और 75 मिनट के लिए बनाए रखने के गहरी परतों में डाई की बेहतर पहुंच की अनुमति है।
    2. डाई ऊष्मायन के दौरान जलमग्न टुकड़ा की पर्याप्त ऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए एक बंद ढक्कन (व्यास 2.5 सेमी की परिपत्र जार, 3.5 सेमी ऊंचाई) कैल्शियम रंगों के साथ aCSF के 2.5 एमएल में पतला के साथ एक गिलास लोडिंग कक्ष तैयार। 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ लगातार आक्सीजन के साथ मिलना। बुलबुला मत करो।
  3. डाई लोड के बाद, aCSF और ऊष्मायन प्रणाली के हस्तांतरण के साथ ऊतक धोने, धीरे-धीरे 15 तक के तापमान को कम - प्रयोगात्मक उपयोग करें जब तक 16 डिग्री सेल्सियस।

5. electrophysiological रिकॉर्डिंग और इमेजिंग

  1. एक खुर्दबीन के नीचे एक जलमग्न रिकार्डिंग कक्ष में ऊतक प्लेस, और 4 के एक प्रवाह दर पर ऑक्सीजन ACSF के साथ छिड़कना - आर टी (~ 22 डिग्री सेल्सियस) या शारीरिक तापमान पर 5 एमएल / मिनट या तो (~ 35 डिग्री सेल्सियस)। Holएक कस्टम '' वीणा '' बनाया है, नायलॉन या सोने के धागे बढ़ाया और सोने या प्लेटिनम तार का एक यू के आकार का टुकड़ा भर चिपके से बना का उपयोग करके जगह में डी ऊतक।
  2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए:
    1. 5-6 MΩ के अंतिम प्रतिरोध हासिल करने के लिए एक micropipette खींचने का उपयोग 1.5 मिमी (1.19 मिमी आईडी) borosilicate ग्लास से रिकॉर्डिंग pipettes तैयार करें।
    2. के रूप में पहले 13 में वर्णित आंतरिक समाधान के 4 μL और एक सीसीडी कैमरे का उपयोग अवरक्त अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर डीआईसी) के तहत कोशिकाओं कल्पना - 3 के साथ पिपेट भरें। intracellular समाधान ध्यान से एक प्रयोग के अनुरूप होना चाहिए प्रयोगात्मक परिणामों को प्राप्त करने के लिए।
    3. स्थिति पिपेट, जबकि सकारात्मक दबाव बनाए रखने पिपेट धारक पर एक चूषण बंदरगाह के माध्यम से आवेदन किया है, एक सेल एक micromanipulator का उपयोग करने की झिल्ली पर। चूंकि इल्म रेटिना से हटा दिया गया है, कोई पूर्व झिल्ली स्क्रैप की आवश्यकता है। एक बार पिपेट सेल पर है, कोमल नकारात्मक लागूपिपेट करने के लिए दबाव एक gigaohm सील को प्राप्त करने के लिए। तो नकारात्मक दबाव का एक संक्षिप्त राशि के साथ कोशिका झिल्ली टूटना।
    4. उचित रूप में मानक तकनीक का उपयोग कर पूरे सेल current- या वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग बनाओ।
  3. कैल्शियम इमेजिंग:
    1. Fura-2 के ratiometric इमेजिंग के लिए, 340 एनएम और 380 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना प्रदान करने के लिए एक अति उच्च गति तरंग दैर्ध्य स्विचर का उपयोग करें। 510 ± 20 एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से व्यक्ति की कोशिकाओं से उत्सर्जित प्रकाश के पास, और एक उच्च संवेदनशीलता, उच्च गति डिजिटल कैमरा के साथ कब्जा।
    2. 550 एनएम बैंड पास फिल्टर - 490 एनएम बैंड पास फिल्टर और प्रकाश उत्सर्जित एक 515 के माध्यम से - Fluo 4, एक 460 के माध्यम से फिल्टर उत्तेजना प्रकाश की एक भी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए। सबसे तेज और सबसे संवेदनशील रिकॉर्डिंग के लिए इस तरह के एक उच्च गति डिजिटल कैमरा का उपयोग करें। छवियों का मोल के रूप में की आवश्यकता है।
    3. समय के एक समारोह या तो एक एकल तरंगदैर्ध्य पर (Fluo 4) या तरंग दैर्ध्य अनुपात का उपयोग कर के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को मापनेविधि (Fura-2), इससे पहले, 14 8 वर्णित है।

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Representative Results

ऊष्मायन के दौरान बैक्टीरियल लोड और aCSF के तापमान की तंग विनियमन न्यूरोनल ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आवश्यक है। 16 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1) - यह UVC प्रकाश के साथ विकिरण और 15 पर aCSF का तापमान बनाए रखने के माध्यम से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, aCSF मापदंडों स्टाम्प (ए पी एस, चित्रा 1 सी) इस प्रकार जब न्यूरोनल ऊतक, जो, अगर पीछा किया, के बीच परिवर्तनशीलता कम हो जाएगा incubating मापदंडों के लिए एक स्वर्ण मानक की पेशकश पर्यावरण की स्थिति का एक रिकार्ड (पीएच और अस्थायी।) के साथ प्रयोगकर्ता प्रदान करता है, प्रयोगों।

आकृति 1
चित्रा 1. एक ऊष्मायन प्रणाली के ऊतकों पर्यावरण की तंग विनियमन सक्षम बनाता है। ऊष्मायन एक ठंडा Peltier प्लेट, मुख्य कक्ष, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और UVC चैम्बर की रचना की प्रणाली के एक योजनाबद्ध आरेख। बी,मुख्य aCSF के इनलेट और आउटलेट अंक दिखा चैम्बर, साथ ही carbogen इनलेट, तापमान और पीएच जांच के साइड देखें। संकेत के रूप में ऊतक जाल पर रखा गया है। सभी को मापने जांच संरचनात्मक स्थिरता की अनुमति देने के ढक्कन से जुड़े होते हैं। सी, aCSF पैरामीटर स्टाम्प गर्मी के दौरान तापमान और aCSF के पीएच का वर्णन है। डी, मुख्य मापने जांच के लिए बढ़ते छेद दिखा चैम्बर के शीर्ष दृश्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊतक व्यवहार्यता नेटवर्क गतिविधि (चित्रा 2), साथ ही विभिन्न तरीकों इमेजिंग, कैल्शियम प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2 बी, सी) सहित के माध्यम से मापा जा सकता है। नेटवर्क गतिविधि पर नजर रखने के लिए, हम aCSF पोटेशियम क्लोराइड (KCl, 30 मिमी) के एक उच्च एकाग्रता युक्त आवेदन किया है स्थानीय स्तर पर,जो न्यूरॉन्स की विध्रुवण और glia करने के लिए नेतृत्व के लागू + K आसपास के क्षेत्र के भीतर। इस विध्रुवण कैल्शियम यात्रियों (चित्रा 2 बी, सी) और spiking गतिविधि (चित्रा 2 डी) में वृद्धि हुई है, जो भी सेल व्यवहार्यता के लिए एक शारीरिक संकेत के रूप में कार्य करता है के द्वारा देखा जा सकता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि स्लाइस कि ऊष्मायन प्रणाली में> 24 घंटे के लिए incubated रहे थे में गतिविधि spiking "ताजा" स्लाइस कम अवधि (> 4 घंटे, चित्रा 2 डी) के लिए incubated के समान था। इसके अलावा, अलग-अलग न्यूरॉन व्यवहार्यता, जो दोनों निष्क्रिय और सक्रिय झिल्ली गुण के intracellular electrophysiological रिकॉर्डिंग आराम झिल्ली क्षमता, इनपुट प्रतिरोध, समय लगातार सहित, के माध्यम से नजर रखी थी, और कार्रवाई संभावित साहित्य 15 (चित्रा 2 ई, एफ में सूचना के मापदंडों के बराबर था )।


चित्रा 2. electrophysiological और कैल्शियम लंबे समय तक ऊष्मायन के बाद मस्तिष्क के स्लाइस के गुण। एक, एक मस्तिष्क टुकड़ा की छवि नेटवर्क गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया दो कोशिकी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ टुकड़ा करने की क्रिया के बाद 28 h लिया। एक तीसरा इलेक्ट्रोड (तारक से चिह्नित) कश को KCl 30 मिमी प्रयोग किया जाता है। बी,> 24 घंटे के लिए Fluo-04:00 के साथ भरी हुई स्लाइस के समय चूक छवियों, KCl के स्नान आवेदन निम्न intracellular कैल्शियम यात्रियों में वृद्धि का चित्रण। सी, KCl की संक्षिप्त आवेदन (30 मिमी, 1 एस) के बाद intracellular कैल्शियम यात्रियों। लाल - औसत संकेत, ग्रे - एकल कक्षों में कैल्शियम निशान के रूप में बी में दिखाया गया है। डी, पहले और KCl (लाल तीर) के आवेदन के बाद नेटवर्क गतिविधि के बाह्य शारीरिक रिकॉर्डिंग के बीच "ताजा" स्लाइस बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित थे (<4 घंटे postdissection) और उन है कि इनक्यूबेटर में> 24 घंटे के लिए incubated रहे थे। व्यवहार्य न्यूरॉन्स कि विध्रुवण के साथ में [+ K] में वृद्धि करने के लिए जवाब का संकेत KCl आवेदन के बाद तुरंत गतिविधि spiking में वृद्धि पर ध्यान दें। और एफ, निष्क्रिय (ई), और 2 एच (नीले निशान) या ऊष्मायन प्रणाली में ऊष्मायन के 26 घंटे (काला निशान) निम्नलिखित पिरामिड न्यूरॉन के सक्रिय (एफ) झिल्ली गुण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Retinally पतित आरडी / आरडी चूहों के wholemount रेटिना के नाड़ीग्रन्थि सेल परत की कोशिकाओं के लिए सीधी पहुँच प्रदान करने के लिए, इल्म एंजाइम papain 7, 8 से पचा गया था। पाचन के बाद, RGCs और विस्थापित amacrine कोशिकाओं स्पष्ट रूप से देखे जा सकते हैं undएर डीआईसी रोशनी (चित्रा 3 ए), और कोशिकाओं इल्म के किसी भी पूर्व scraping बिना पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए निशाना बनाया जा सकता है। एक RGC से प्रतिनिधि वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग चित्रा 3 बी में दिखाया जाता है। पैच पिपेट के माध्यम से सेल के विध्रुवण खुराक पर निर्भर संभावित कार्रवाई पीढ़ी के कारण होता है, papain इलाज के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता का संकेत है।

इल्म का हटाया भी नाड़ीग्रन्थि सेल परत (GCL) Fura-02:00 (चित्रा 3 डी) और एफ 0 के लिए 340/380 एनएम अनुपात रिश्तेदार एक बड़ी वृद्धि के साथ 30 मिमी KCl आवेदन करने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की कोशिकाओं के साथ की सर्वव्यापक धुंधला अनुमति, एक बड़े वाचक intracellular कैल्शियम एकाग्रता (चित्रा 3E) में वृद्धि हुई है। कैल्शियम का स्तर निम्न उत्तेजना आधारभूत लौटे और कोशिकाओं बाद में इसी तरह के एक आयाम प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इसके अलावा, इन प्रतिक्रियाओं आर के बीच पृथक किया गयाetinae में दर्ज <4 h और> 24 घंटे postdissection (चित्रा 3F, जी)।

चित्र तीन
चित्रा 3: रेटिना wholemount में electrophysiological और कैल्शियम रिकॉर्डिंग। ए, अंतर हस्तक्षेप विपरीत papain पाचन के बाद GCL में एक रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल से एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग की छवि। बी, प्रकोष्ठों खुराक निर्भर spiking प्रतिक्रियाएं बरकरार रहती है जब क्रमश: 50, 100 और 150 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ depolarized। सी और डी, Fura-02:00 के स्नान आवेदन से पहले भीतरी सीमित झिल्ली का हटाया रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के सर्वव्यापी लोड हो रहा है, छवि 380 एनएम उत्तेजना के साथ लिया अनुमति देता है। ई, जब 30 मिमी KCl ASCF लागू किया जाता है, दाग कोशिकाओं का 85% 340/380 अनुपात में वृद्धि के साथ जवाब दिया। एफ एंड जी, 30 मिमी KCl आवेदन के बाद आधारभूत 340/380 अनुपात रिटर्न में वृद्धि (लाल सलाखों), और कोशिकाओं दोनों <4 h और> 24 घंटे के विच्छेदन के बाद बाद में उत्तेजना का जवाब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह लेख एक ऊष्मायन विधि का वर्णन इमेजिंग और electrophysiological प्रयोगों के लिए तीव्र न्यूरोनल ऊतक की व्यवहार्यता का विस्तार करने की है, जिससे पशु संख्या प्रयोगात्मक लक्ष्यों को पूरा करने की जरूरत को कम करने। दो मुख्य प्रक्रियाओं में समय के साथ न्यूरोनल ऊतक की गिरावट शासन: मैं) में वृद्धि हुई बैक्टीरिया का स्तर, और बैक्टीरियल endotoxin में साथ वृद्धि जारी है, और ii) excitotoxicity जो दर्दनाक टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया 10 इस प्रकार है। तीव्र न्यूरोनल ऊतक पर्यावरण की दृष्टि से बचाव के रूप में है, पीएच, तापमान और बैक्टीरिया के स्तर के करीब से निगरानी के माध्यम से ऊतक वातावरण की तंग विनियमन नेटवर्क अखंडता के साथ ही सेलुलर गतिविधि को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। विच्छेदन, और ऊतक उपचार (papain पाचन, कैल्शियम डाई लोड हो रहा है) को पूरा करने के लिए अधिक 2 घंटे लग सकते हैं, प्रयोगात्मक समय में कमी के कारण। हालांकि, ऊतक एक औसत दर्जे का बिना किसी नुकसान के> 24 घंटे के लिए ऊष्मायन प्रणाली में रखा जा सकता है के बाद से मैंn व्यवहार्यता 7, 8, इस तैयारी केवल प्राप्त करने के लिए परिणाम के> 24 घंटे में एक बार पूरा हो जाने की जरूरत है। 3Rs रणनीति के हिस्से के रूप में (रिप्लेसमेंट, कटौती, शोधन) जानवरों 16 के नैतिक उपयोग के लिए मार्गदर्शक सिद्धांत प्रदान करने के उद्देश्य से, इस विधि प्रयोगों के इन प्रकारों में प्रयुक्त जानवर की संख्या को कम करने पर एक बड़ा असर पड़ेगा।

रेटिना wholemount ऊतक का इल्म की पाचन पैच दबाना रिकॉर्डिंग और स्नान आवेदन के द्वारा देशव्यापी कैल्शियम डाई लोड करने के लिए GCL में कोशिकाओं के आसान लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति देता है। इन तकनीकों में पतित दृष्टिपटल जिसमें इल्म बहुत मोटा है और कठिन है एक गिलास विंदुक के साथ scraping द्वारा भंग करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। इसके अलावा, papain तैयारी GCL में अंतर-जंक्शन मिलकर कोशिकाओं से रिकॉर्ड करने के लिए दो इलेक्ट्रोड का उपयोग बनती सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए एक रास्ता है, कुछ है कि पहले संभव नहीं हो पाया है। तथापि, Papain पाचन संभावना के रूप में कश्मीर + रिसेप्टर अभिव्यक्ति papain 6 के साथ हदबंदी के बाद फोटोरिसेप्टर में बदला जा दिखाया गया है सामान्य रेटिना शरीर क्रिया विज्ञान पर कुछ असर पड़ता है। यह भी संभव है कि रेटिना वास्तुकला से प्रभावित है। Velte और Masland से पता चला है कि हालांकि कुछ RGC somas और dendrites इल्म दूर करने के लिए papain उपचार से क्षतिग्रस्त हो गए थे, वे सफलतापूर्वक कोशिकाओं के संरचनात्मक अखंडता का संकेत रिकॉर्ड कर सकता RGC सबसे न्यूरॉन्स में सोमा के लिए बाहर का dendrites से, और प्रक्रियाओं 5। महत्वपूर्ण बात है, रेटिना के रूप में ऊपर वर्णित है, रेटिना वर्णक उपकला (RPE) और श्वेतपटल से जुड़ी है, छोड़ने papain प्रसार से बाहरी रेटिना आइसोलेट्स और जब इस प्रोटोकॉल गुम्मट दृष्टिपटल करने के लिए लागू किया जाता है फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों पर कोई प्रतिकूल प्रभाव को कम कर सकता है। दोनों मामलों, papain उपचार, या इल्म के स्क्रैप में, कुछ कोशिका क्षति होती जाएगी, प्रयोगकर्ता विधि experim के लिए उपयुक्त का चयन करना होगाअंदरूनी सवाल है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma Aldrich VETEC V800372
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333
N-Methyl-D-glucamine Sigma Aldrich M2004 
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S2554
Magnesium chloride Sigma Aldrich M9272 
Calcium chloride  Sigma Aldrich 223506
Papain Dissociation System Worthington  LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous Sigma Aldrich 276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance* Life technologies P-6867 20% solution in DMSO 
Fura-2 AM   Anaspec 84017
Fluo-4 AM   Life Technologies F23917
Fluo-8 AM Abcam Ab142773
Vibrating blade microtome  Leica Biosystem VT1200 S Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device 
Antivibration table Kinetic Systems Vibraplane  Vibraplane 9100/9200 
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI 
Microscope Objective Olympus XLUMPlanFLN 20x/1.00w 20X 
Microscope Objective Olympus LUMPlanFLN 60x/1.00w 60X
CCD Camera Andor Ixon +
High speed wavelength switcher Sutter instrument Lambda DG-4 
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries Sutter Instrument Co BF150-86-10
Microelectrode puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-40LP Low Profile Open Bath Chambers
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software Andor Andor iQ3
Braincubator Payo Scientific BR26021976 www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler TE Technology CP-121
Temperature Controller TE Technology TC-36-25 RS232

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References

  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11, (3), 508-513 (2012).
  4. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62, (2), 230-241 (2009).
  5. Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396 (2014).
  6. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588 (2015).
  7. Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81, (3), 1412-1417 (1999).
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  9. Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  10. Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. 4864-4867 (2014).
  11. Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. WO2015021513A1 (2015).
  12. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
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  14. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
  15. Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2, (9), 9 (2007).
  16. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen. London, UK. (1959).

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