Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

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Biochemistry

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Summary

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

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King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). J. Vis. Exp. (123), e55406, doi:10.3791/55406 (2017).

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Abstract

Há uma demanda crescente para analisar muitas amostras biológicas para a compreensão da doença e descoberta de biomarcadores. estratégias de proteômica quantitativas que permitem a medição simultânea de múltiplas amostras tornaram-se generalizada e reduzir consideravelmente os custos experimentais e tempos. O nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada precursor combinado marcação isotópica e etiquetagem isobárica (cPILOT), que aumenta a amostra multiplexagem de marcação isotópica tradicional ou abordagens de marcação isobáricas. cPILOT global pode ser aplicada a amostras provenientes de células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros e dá informação sobre a abundância relativa de proteína em diferentes condições de amostra. cPILOT funciona por 1) usando condições de baixa tampão de pH para selectivamente péptido dimethylate terminais N e 2) utilizando condições de tampão de pH elevado para rotular aminas primárias de resíduos de lisina com reagentes isobáricas comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais / Reagentes). O grau demultiplexagem amostra disponível é dependente do número de etiquetas precursor utilizado e o reagente de marcação isobárica. Aqui, apresentam-se uma análise de 12-Plex utilizando luz e dimetilação pesada combinada com reagentes isobáricas seis-plex para analisar 12 amostras de tecidos de rato em uma única análise. multiplexagem aumentada é útil para reduzir o tempo e custo experimental e mais importante ainda, permitindo a comparação entre muitas condições de amostra (réplicas biológicas, estágio da doença, tratamentos medicamentosos, genótipos, ou pontos de tempo longitudinais) com polarização menos experimental e erro. Neste trabalho, a abordagem cPILOT global é utilizado para analisar o cérebro, coração e tecidos do fígado em todo repetições biológicas dos controles modelo do rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. CPILOT global pode ser aplicada ao estudo de outros processos biológicos e adaptada para aumentar a multiplexagem amostra para maior do que 20 amostras.

Introduction

Proteomics muitas vezes envolve a análise de muitas amostras utilizadas para melhor compreender os processos de doença, de cinética enzimática, modificações pós-traducionais, resposta a estímulos ambientais, de resposta a tratamentos terapêuticos, a descoberta de biomarcadores, ou mecanismos de drogas. Os métodos quantitativos podem ser utilizados para medir as diferenças relativas nos níveis de proteína através das amostras e pode ser livre de marcador ou envolver a marcação isotópica (metabólica, químicos, ou enzimáticos). Os métodos de marcação de isótopos estáveis ​​têm crescido em popularidade, porque eles permitem muitas amostras a ser analisadas simultaneamente e são adequados para as amostras a partir de diferentes células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros. Marcação isotópica métodos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentar o rendimento experimentalenquanto reduz o tempo de aquisição, custos e erro experimental. Estes métodos usam espectros de massa precursor para medir a abundância relativa de proteínas a partir de picos peptídicos. Em contraste, os reagentes de marcação isobáricas 8, 9, 10 gerar is repter que, ou são detectadas em MS / MS ou MS 3 11 e espectros estes picos são usados para informar sobre abundâncias relativas das proteínas.

O atual estado-da-arte no multiplexagem proteómica ou é uma análise de marcação isobárica 10-Plex 12 ou 12-Plex 13. Multiplexagem amostra melhorada (isto é,> 10 amostras) os métodos têm sido desenvolvidos pelo nosso laboratório para os tecidos 14, 15, 16, 17, e por outro para a análise de células 18 sup>, 19, 20, 21 tecidos, ou péptidos segmentados 22. Desenvolvemos uma técnica de multiplexagem reforçada chamado precursor de marcação isotópica combinado com marcação isobárica (cPILOT). CPILOT global é útil para a obtenção de informações sobre as concentrações relativas de todas as proteínas em diferentes condições de amostra (≥12) 14. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral cPILOT. Peptídeos trípticos ou Lys-C são selectivamente marcado na extremidade N-terminal com dimetilao usando baixo pH 2 e nos resuos de lisina com 6-Plex reagentes usando pH elevado. Esta estratégia dobra o número de amostras que podem ser analisadas com os reagentes isobáricas que ajuda a reduzir os custos experimentais e, adicionalmente, reduz passos experimentais e tempo.

cPILOT é flexível como nós desenvolvemos outros métodos para estudar modi oxidativo pós-translacionalções, incluindo as proteínas de 3-nitrotirosina modificado 14 e péptidos contendo cisteina, com S-nitrosilação (oxcyscPILOT) 23. Também desenvolvemos um aminoácido abordagem selectiva, cPILOT cisteína (cyscPILOT) 17. MS 3 aquisição com uma parte superior de iões de 11 ou selectiva-y 1 -Permutadores método 15 pode ajudar a reduzir a interferência de iões repórter e melhorar a exactidão quantitativa de cPILOT. O uso de MS no 3 o método de aquisição requer um instrumento de alta resolução com um analisador de massa Orbitrap apesar dos instrumentos de armadilha de iões de baixa resolução, podem também trabalhar 24.

Anteriormente, cPILOT tem sido usado para estudar proteínas hepáticas 16 de rato modelo da doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos como realizar análise cPILOT mundial usando cérebro, coração e homogeneizados de fígado para estudar o papel do periphery na doença de Alzheimer. Esta experiência incorpora replicação biológica. Devido à versatilidade de cPILOT, os usuários interessados ​​podem usar a técnica para estudar outros tecidos para uma série de problemas e sistemas biológicos.

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Protocol

Ética declaração: Ratos foram comprados a partir de um sem fins lucrativos, instituição independente, a investigação biomédica e alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório da Universidade de Pittsburgh. Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Pittsburgh.

1. Extração de Proteínas e produção de péptidos para a etiquetagem Chemical

  1. Extracto de proteína a partir de tecido, células, ou fluidos corporais.
    1. Homogeneizar 60-90 mg de tecido (por exemplo, cérebro, coração, fígado e) em solução salina de tampão fosfato (PBS 1x) com ureia 8 M (500 mL), utilizando um homogeneizador mecânico. Os inibidores de protease ou de fosfatase pode ser adicionado ao tampão, se necessário. Neste projeto, eles não foram usados. Utilizar os seguintes parâmetros para o homogeneizador: lisar os grânulos da matriz A, 4 m / s, 20 s. tecido cardíaco pode exigir até 9 ciclos de homogeneização.
      NOTA: Protease ou inibidor de fosfatase s pode ser adicionado ao tampão, se necessário. Eles não foram utilizados neste estudo.
      1. Remover homogeneizado de tecido a partir do tubo de lise e transferir para um tubo de micro-centruga. Lavar tubos de lise com 100-500 ul de PBS com 8 M de ureia e combinar a solução de lavagem com o homogeneizado de tecido.
    2. Centrifugar os tecidos homogeneizados (9447 xg, 4 ° C, 15 minutos) e recolher o sobrenadante.
  2. Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: A diluição adicional com tampão pode ser necessário se a concentração de proteína é muito alta. As concentrações resultantes para amostras a partir destes tecidos eram entre 6-13 ug / uL.
    1. Opcional: adicionar um padrão interno de controlo da qualidade (por exemplo, caseína alfa bovina ou outra proteína exógena) com o padrão ug proporção 1: amostra de proteína de 100 ug.
jove_title "> 2. Digestão Amostra

  1. Adiciona-se 100 ug (100 x 10 -6 g) de proteína de cada amostra para tubos etiquetados individualmente micro-centrífuga. O volume é dependente da concentração de proteína (ver passo 1.2).
  2. Adicionar ditiotreitol (DTT) (40: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar a 37 ° C durante 2 h. O cálculo para a razão molar é baseada fora a massa de proteína de albumina de soro bovino (BSA), que é de 66,5 x 10 3 g / mole.
  3. Adicionar iodoacetamida (IAM) (80: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar em gelo no escuro durante 2 h. Esta reacção é realizada em gelo durante 2 h, para evitar reacções secundárias.
  4. Adicionar L-cisteína (40: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Adiciona-se 20 mM de tampão Tris com 10 mM de CaCl2 (pH 8,2) para diluir ureia para uma concentração final de 2 M.
  6. Adicionar L-1-tosilamido-2 feniletil clorometil-cetona (TPCK) tripsina -treated (50: Um substrato para a enzima razão molar) a cada amostra e incubar a 37 ° C durante 24 h.
  7. Extingue-se a digestão de proteínas por flash-congelação da amostra em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até processamento adicional.

Dessalinização 3. Amostra

  1. Re-acidificar as amostras pela adição de ácido fórmico (FA). Adicionar suficiente FA para se obter uma concentração final de 0,1%. Se as amostras são inicialmente a -80 ° C, descongelar as amostras em gelo antes de re-acidificação.
  2. De-sal utilizando os péptidos C 18 lipofílico hidrofílico em relação (HLB) cartuchos de 10 mg tal como previamente descrito 16.
  3. Secam-se as amostras por centrifugação de vácuo (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) para um volume de ~ 10 mL.

4. dimetilao Rotulagem (N-terminais)

  1. Reconstituir péptidos em ácido acético a 1% (0,25 mg / mL) dissolvido em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou água de grau de nano-puro. Remover a 50 μ; G de porção para um novo tubo de micro-centruga (1,5 mL) e armazenar o restante à temperatura de -80 ° C.
  2. Adiciona-se 8 mL de 60 mM (4%) CH 2 O (37% p / v) ou 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% p / v) às amostras para marcação com luz ou dimetilao pesado, respectivamente . Tipicamente, 4 uL de reagente é adicionado por 25 ug de péptidos (Passos 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Adicionar 8 mL de mM de NaBH3CN ou 24 mM NaBD 3 CN 24 para as amostras marcadas com luz ou dimetilao pesada, respectivamente.
  4. Vortex e agitar num agitador de tubo durante ~ 10 min a temperatura ambiente.
  5. Extingue-se as reacções através da adição de 16 uL de 1% de amoníaco (~ 28-30% v / v) durante 5 min. Tipicamente, 8 uL de reagente é adicionado por 25 ug de péptidos.
  6. Re-acidificar as misturas reaccionais através da adição de 8 pL de 5% de FA (98% v / v).
  7. Combinar a luz e péptidos pesados dimetilada (Figura 1) para gerar um total de seis amostras. Ver Tabela 1
  8. Realizar a dessalinização da amostra de acordo com os passos 3.2 e 3.3.

5. Isobaric Marcação (resíduos Lys)

  1. Reconstituir 100 ug de péptidos dimetilada (1 ug / uL) em 100 mM de bicarbonato de amónio tri-etil (BTEA) (pH ~ 8,5).
  2. Preparar reagentes isobáricas como indicado no protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais / Reagentes).
  3. Adicionar reagentes isobáricas solubilizadas (41 ul) aos péptidos e vortex durante ~ 10 s. Agitar as amostras num agitador tubo de micro-centrífuga durante ~ 1 h. Extingue-se a reacção com 8 mL de hidroxilamina (10% w / v) e incuba-se as amostras durante 15 min à temperatura ambiente.
  4. Reúnem-se os seis amostras marcadas em uma única mistura e desalt (Passos 3,1-3,3) ou armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
    NOTA: Para melhorar a cobertura proteoma e profundidade, uma estratégia de separação multi-dimensional é sugeridotais como de permuta de catiões forte (SCX).

6. troca catiônica forte

  1. Execute SCX conforme o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    1. Prepara ~ 1 ml de soluções de formiato de amónio (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, e 500 mM) com 10% de acetonitrilo (ACN), 0,1% de FA (pH 3).
    2. Remover a tampa vermelha a partir do topo da ponta da pipeta e toque a ponta da pipeta com a suspens de embalagem para assegurar que o material de embalagem é para a parte inferior da ponta da pipeta.
      NOTA: Critical: Não jogue fora a ponta da pipeta até o final do protocolo.
    3. Colocar a placa de centrífuga para o topo de um tubo de micro-centruga (2 mL) e fixar a ponta da pipeta para dentro.
    4. Adicionar 150 uL de tampão de reconstituição SCX para pontas de pipeta.
    5. Centrifugar as pontas de pipeta para 6 min à temperatura ambiente (4000 xg). Repita este passo mais duas vezes e descartar os resíduos.
    6. Dissolve-se o peptides em 150 uL de tampão de reconstituição de SCX. Certifique-se de que o pH é de 3.
    7. Adicionar peptídeos para as pontas de pipetas, centrífuga (ver 6.1.5), e manter o eluente.
    8. Transferir o filtro e pipeta para um novo tubo de micro-centruga (2 mL) e adicionar 150 mL de solução de formato de amónio 20 mM. Centrifugar durante 6 min à temperatura ambiente (4000 xg) e manter o eluente.
    9. Repetir o passo 6.1.8 mais sete vezes, utilizando concentrações sucessivas (isto é, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM e 500 mM) de formiato de amónio.
  2. Transferir as oito fracções SCX para tubos de micro-centrifugação (1,5 mL) e concentrá-las utilizando evaporação centrífuga (ver passo 3.3).

7. Cromatografia Luida-Espectrometria de Massa em Tandem (LC-MS / MS) e MS 3

  1. Reconstituir os péptidos em água grau de espectrometria de massa com 0,1% de FA, filtrar, e colocar num frasco de auto-amostrador. peptídeos filtro como follOWS:
    1. Adicionar péptidos reconstituídos para um tubo de micro-centruga contendo um filtro de 0,65? M (ver Materiais Tabela).
    2. péptidos centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Remover filtro, descartar, e adicionar péptidos filtrados para um frasco de auto-amostrador.
  2. Prepare os buffers de fase móvel como se segue: 3% (v / v) de ACN com 0,1% de FA (A) e 100% de ACN com 0,1% de FA (B).
  3. Injectar 6 uL de cada amostra de fracção de SCX numa coluna armadilha embalado a 2 cm com 18 C-prima (5? M, 200 A de tamanho de poro).
    NOTA: a limpeza da amostra sobre a armadilha é como se segue: 3 min, 0% de B; 3 mL / min usando um sistema de cromatografia líquida de 2D (ver Materiais Tabela).
  4. Execute o método de separação analítica. Utilizar uma coluna ID de 75 um x 13,2 centímetros de laser puxou-ponta capilar de sílica fundida embalados com material de C 18 (5? M, 100 Â). O gradiente é: 0-5 min, 10% de B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15-25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% de B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% de B; 300 nL / min, 180 min.
  5. Execute o de aquisição de dados para o espectrômetro de massa, enquanto o método de separação analítica está em execução.
    NOTA: Os parâmetros para a verificação levantamento MS são como se segue: 400-1,600 m / z, a resolução de 60.000, o controlo automático de ganho (AGC) alvo 1 x 10 6 de iões, o tempo máximo de injecção de 500 ms. Parâmetros para CID-MS / MS são os seguintes: Topo 1-7 ou aquisição dependente dos dados Topo 8-14 (DDA), 3 m / z largura isolamento, 500 de sinal mínimo, 35% da energia de colisão normalizada (NCE), 0,25 q activação , 10 ms de tempo de activação, a 3 x 10 4 AGC, 50 ms de tempo máximo de injecção. Parâmetros para HCD-MS 3 são como se segue: 200 de sinal mínimo, 4 largura m / z isolamento, 60% NCE, o tempo de activação 0,1, 3 x 10 5 AGC, 250 ms de TI, 300-1,300 m / z intervalo de selecção MS / MS , excluir ião progenitor não fragmentado.
  6. NOTA: Para as amostras executado em um modelo mais recente de um instrumento contendo uma Orbitrap ou um espectrómetro de massa Tribrid, DDA parâmetros irão variar e pode ser optimizado para incluir mais de MS / MS e MS 3 varrimentos. Além disso, para instrumentos Tribrid, selecção precursor síncrono (SPS) -MS 3 deve ser empregue.

8. Análise de Dados 16

  1. Pesquisar os arquivos RAW usando software de análise de proteína contra um banco de dados apropriado, como rato UniProt.
    NOTA: É importante criar dois fluxos de trabalho para cada arquivo RAW, a fim de procurar a luz e peptídeos dimetilado pesados.
  2. Pesquisa os arquivos RAW usando os seguintes parâmetros: tripsina com duas clivagens perdidas, gama de massa de péptido 300-6,000 Da, 15 ppm pai tolerância massa, uma tolerância Da fragmentação. modificações estáticos: dimetilao luz (28,031, de péptido N-terminal) ou hdimetilao eavy (36,076 Da, ptido N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    NOTA: Às vezes o pico dimetilada pesado é ~ 7 Da (35,069 Da, ptido N-terminal) é a partir da luz dimetilado pico e, portanto, deve ser incorporada no fluxo de trabalho de pesquisa para péptidos dimetilado pesados. modificações dinâmicos: oxidação (15,995 Da, H), TAG isobárica 6-Plex (229,163 Da, K). Incluem uma pesquisa da base de dados de engodo para proporcionar taxas de detecção falso (por exemplo, 1 e 5%) e um nó de quantificação para procurar as intensidades de iões repórter de etiquetas isobáricas.
  3. Estatisticas
    1. dados de exportação para um programa de folha de cálculo electrónica, a fim de normalizar os valores de iões repórter proteína. Para cada proteína, dividir ambos os rácios de iões repórter mediana ou intensidades de iões repórter em bruto pela proporção mediana do padrão interno ou intensidades de iões repórter matérias do padrão interno, respectivamente. Use o software estatístico adequado, tais como um programa de planilha eletrônica, Perseus, ou R para determinar alterações significativas entre condições de amostra.

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Representative Results

cPILOT utiliza química à base de amina de péptidos quimicamente etiqueta na extremidade N-terminal e resuos de lisina e melhora as capacidades de multiplexação de amostra. A Figura 2 mostra os dados de MS representante que é obtido a partir de uma análise cPILOT 12-Plex de cérebro, coração, fígado e tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. Como mostrado na Tabela 1, duas réplicas biológicas para ratinhos de doença e do tipo selvagem de Alzheimer são incluídos nesta análise 12-Plex. A Figura 2A mostra um par de pico duplamente carregado que é separado por m / z espaçamento de 4 indica um único grupo de dimetilo foi incorporado no péptido. Tanto o pesados ​​picos dimetilado neste par luz e são independentemente isolada e fragmentada com CID. Os dados MS / MS para cada um dos péptidos dimetilada é mostrado nas Figuras 2B e C. Resultados da pesquisa indicam este pair de picos pertence ao T (dimetil) ELNYFAK (isobárica-tag 6) péptido da fosfoglicerato-quinase proteína 1. O fragmento ião mais intenso é y 3+, que é semelhante tanto para a luz e pesados picos dimetilado. Estes picos são isolados para mais HCD-MS 3 e os is repter (m / z 126-131) são observados como mostrado nas Figuras 2D e 2E. Ambos os conjuntos de MS 3 espectros são necessários para obter informações sobre as 12 amostras. Neste exemplo, as relações de iões repórter (AD / WT) (controlo de doenças / tipo-selvagem de Alzheimer) para o cérebro, fígado, coração e tecidos são semelhantes entre as duas réplicas biológicas. Os valores de alterao para cada comparação sugerem que os níveis de fosfoglicerato-quinase 1 de cérebro e coração são mais elevados em ratos AD, ao passo que no fígado a níveis são mais baixos.

figura 1
FiguRe 1: fluxo de trabalho Proteomics usando cPILOT. Como um exemplo, este fluxo de trabalho descreve a análise de 12 amostras individuais. Proteínas a partir de tecidos, células ou fluidos corporais são extraídos e adiciona-se um padrão de proteína, adequado (por exemplo, bovino alfa-caseína). As proteínas são digeridas utilizando tripsina. Os péptidos são rotulados na extremidade N-terminal usando a luz ou dimetilao pesada (pH ~ 2,5) e em resíduos de lisina utilizando TMT 6 -plex (pH ~ 8,5). Péptidos marcados são reunidas numa única mistura e sujeita a SCX RP-LC-MS / MS e MS 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Dados Exemplo cPILOT de péptidos a partir de cérebro, coração, fígado e tecidos de controlo modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. (A) mostra os péptidos leves e pesados dimetilada, representados pelos picos a m / z 643,854 e 647,875. Estes péptidos foram seleccionados, isolada e fragmentada, gerando assim CID-MS / MS espectros (B e C), o que proporcionou a identificação de péptidos. Um adicional de selecção, isolamento, e fragmentação do ião fragmento intenso a maior parte da luz e péptidos pesados dimetilado na fase de MS / MS gerado HCD-MS três espectros (D e E), respectivamente. A sequência do péptido é T (dimetil) ELNYFAK (isobárica-tag 6) e pertence à fosfoglicerato quinase 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagente isobaric0;
126 127 128 129 130 131
luz dimetilao WT um AD b WT DE ANÚNCIOS WT DE ANÚNCIOS
cérebro coração fígado
dimetilao pesado WT DE ANÚNCIOS WT DE ANÚNCIOS WT DE ANÚNCIOS
coração fígado cérebro
O tecido é, quer a partir de um de um tipo selvagem de controlo (WT) ou doença do rato (AD) b de Alzheimer.

Tabela 1: agrupamento cPILOT da AD e WT cérebro, coração e tecidos do fígado.

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Discussion

cPILOT permite a medição simultânea de mais do que 12 amostras originais. A fim de assegurar a etiquetagem bem sucedido em ambos os resíduos do N-terminal e lisina de péptidos, é imperativo ter o pH correcto para cada conjunto de reacções e para executar a primeira reacção dimetilao para rotulagem péptido. dimetilao selectiva na extremidade N-terminal é realizada por ter um pH em ~ 2,5 (± 0,2). Isto é conseguido através da exploração das diferenças de pKa de um dos grupos amino de lisina e o N-terminus. A pH 2,5, a lisina é inactiva (pKa ~ 10,5); no entanto, se o pH é ligeiramente acídico (isto é, pH 5-7) ou de base, ambos os terminais N e resíduos de lisina serão dimetilado. Além disso, se a marcação isobárica é realizada primeiro com um pH baixo, a N-terminais terão o rótulo e lisina resíduos isobáricas será dimetilado. Isto pode resultar em menos fragmentos sendo seleccionado para MS 3, como b-iões teria de ser seleccionado. Os custos relativos da dimetilreacções ation são barato em comparação com os reagentes comerciais isobáricas. Enquanto se pode utilizar toda uma ampola isobárica reagente por 100 ug, que também tiveram sucesso usando metade do frasco de reagente por cada 100 ug com eficiência comparável a rotulagem. Isto ajuda a reduzir significativamente os custos para as experiências individuais e cPILOT permite mais amostras a serem analisadas. Também é importante notar que os outros reagentes de marcação isobáricas pode ser utilizado em vez do reagente isobárica utilizado neste protocolo como já anteriormente demonstrado 14. Para garantir uma elevada eficiência de marcação e de marcação, é importante adicionar reagentes para amostras rapidamente. Isto irá permitir a amostras de ter aproximadamente o mesmo tempo de reacção. Para fins quantitativos, cada amostra deve ser tratada de forma idêntica especialmente antes de agrupamento amostras no dimetilao e passos de rotulagem isobáricas. Finalmente, deve notar-se que trabalhando com muitas amostras simultaneamente nos passos iniciais requires de habilidade do usuário cuidado e atenção para provar manuseio.

O cenário mais ideal é obter is repter para cada proteína na mistura entre as 12 amostras. No entanto, este não é o caso de um grande número de proteínas. O número de péptidos detectados com informações para a quantificação cPILOT e outra multiplexagem reforçada aproximando depende de vários factores incluindo o tipo de amostra, o fraccionamento da amostra e passos de processamento, MS métodos de aquisição de dados, e o tipo de instrumento. Embora ambos dimetilao e etapas de etiquetagem isobáricas têm uma alta eficiência de marcação de péptidos de ~ 95-99%, ainda é ~ 20% dos dados MS 3 que não conterá informação de iões repórter. Isto é devido, em parte, à utilização de tripsina que gera péptidos terminada-arginina, que resultam em nenhuma incorporação de reagente isobárica. Isto pode ser resolvido usando outros enzimas, tais como Lys-C, com uma desvantagem potencial na identificação de proteínas 25. Também para pesadospéptidos dimetilada, o pico seleccionado de fragmentação pode ser o H ou M-1 pico, que têm diferentes intensidades e irá afectar as intensidades de iões repórter observado na fase de MS 3. Assim, pode haver alguns iões repórter baixa intensidade que não são detectados para algumas amostras. Tais situações são frequentemente comumente observados para baixo de intensidade fragmentos MS / MS que são isoladas para MS 3 passos. Uma boa solução para este problema tem sido incorporado em espectrómetros de massa Tribrid, que, em vez de utilizar selecção de um único entalhe para MS 3, utilizam multi-nível ou múltiplas MS / MS fragmenta 26.

Existe uma grande quantidade de versatilidade na abordagem cPILOT especialmente no que diz respeito ao número de amostras que pode ser comparado, em uma única análise (ou seja, acima de 20 com reagentes isobáricas comerciais) e os tipos de lenços de papel usados. Nós demonstramos que é fácil obter informações quantitativas precisas do cérebro, coração etecidos do fígado na mesma análise, no contexto de uma doença. Este método, de modo semelhante ao de outros métodos de multiplexação, permite a análise de amostras múltiplas de uma só vez, e é aplicável a amostras provenientes de células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros. Além disso, os péptidos cPILOT marcado é capaz de ser analisada utilizando uma resolução baixa ou alta 24 (60000) instrumento. Em comparação, a obtenção de medição bem sucedida utilizando outros métodos de multiplexagem pode ser limitada a um tipo específico de amostra (isto é, células) 18, pode requerer um instrumento com muito alta resolução 20, ou acesso a marcadores de isótopos estáveis. cPILOT é ótimo para os usuários interessados ​​em compreender a doença, descoberta de biomarcadores, resposta a uma droga ou intervenção terapêutica, ou mudanças longitudinais em muitos momentos. Além disso, para grandes proteómica espingarda análises de amostras clínicas (onde N é grande, centenas a milhares), cPILOT também podem ser adequados, para ajudar a reduzir os custos e tempo experimentais. No futuro, cPILOT vai ser expandido para multiplexar um número maior de amostras usando isotópica existentes e novos e etiquetas isobáricas.

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Disclosures

Os autores não têm interesses conflitantes.

Acknowledgments

Os autores reconhecem a Universidade de Pittsburgh start-up fundos e NIH, concessão NIGMS R01 (GM 117191-01) para RASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Water - MS Grade Fisher Scientific W6-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade Fisher Scientific A955-4 4 L quantity is not necessary
Acetic Acid J.T. Baker 9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%) Sigma Aldrich 320145-500ML
Ammonium formate Acros Organics 208-753-9
Formic Acid Fluka Analytical 94318-250ML-F
BCA protein assay kit Pierce Thermo Fisher Scientific 23227
Urea Biorad 161-0731
Tris Biorad 161-0716
Dithiothreiotol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Iodoacetamide (IAM) Acros Organics 144-48-9
L-Cysteine Sigma Aldrich, Chemistry 168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich, Life Science T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O Sigma Aldrich, Life Science F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C Sigma Aldrich, Chemistry 596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% Sigma Aldrich 156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP Sigma Aldrich, Chemistry 190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit Protea BioSciences SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer Sigma Aldrich, Life Science T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg) Thermo Fisher Scientific 90061
Hydroxylamine hydrochloride Sigma Aldrich, Chemistry 255580-100G
Standard vortex mixer Fisher Scientific 2215365 any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges Waters 186000383 These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model Sigma Aldrich 57265 A 12 port model is also sufficient
Speed-vac Thermo Scientific SPD1010 any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber Thermo Scientific 2825/2826 Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) MP Biomedicals 116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler Sciex - This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer Thermo Scientific - This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) Thermo Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analytical balance Mettler Toledo AL54
Stir plate VWR 12365-382 Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable) Fisher Scientific (Accumet) 13-620-183 Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer Fisher Scientific 06-664-261 Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer Fisher Scientific 06-664-260 Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 05-408-129 Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk Fisher Scientific 04-408-120 Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units EMD Millipore UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units Thermo Scientific 69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å) Bruker PM5/61100/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å) Bruker PM5/61200/000 This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient

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References

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