पेप्टाइड स्कैनिंग की मदद से एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी मान्यता प्राप्त लीनियर बी-सेल मिलान की पहचान

Immunology and Infection

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Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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Abstract

प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा एक प्रतिजनी मिलान की पहचान एंटीबॉडी कि टीकों और पेप्टाइड दवाओं के विकास की सुविधा हो सकती निष्क्रिय करने की सुरक्षा व्यवस्था को समझने के लिए अनुमति देता है। पेप्टाइड स्कैनिंग एक सरल और कारगर तरीका है कि सीधी रेखीय मिलान एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) द्वारा मान्यता प्राप्त नक्शे है। इधर, लेखकों एक मिलान दृढ़ संकल्प एक निष्क्रिय एमएबी का उपयोग करते हुए नर्वस नेक्रोसिस वायरस कोट प्रोटीन की प्रतिजनी मान्यता के लिए क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन, सिंथेटिक पेप्टाइड डिजाइन, और डॉट धब्बा संकरण से जुड़े कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं। इस तकनीक में एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर सिंथेटिक पेप्टाइड्स और MABS के डॉट-धब्बा संकरण पर निर्भर करता है। एक वायरल कोट प्रोटीन आरजी M56 एमएबी द्वारा मान्यता प्राप्त की न्यूनतम प्रतिजनी क्षेत्र कदम-दर-कदम से नीचे संकुचित किया जा सकता है कि एक 6-मेर पेप्टाइड मिलान पर पेप्टाइड मानचित्रण छंटनी की। इसके अलावा, alanine स्कैनिंग mutagenesis और अवशेषों उपstitution प्रत्येक अमीनो एसिड मिलान को बनाने के अवशेषों के बंधन महत्व को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। मिलान साइट flanking अवशेषों पेप्टाइड रचना नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए पाए गए। पहचान मिलान पेप्टाइड एक एक्स-रे विवर्तन अध्ययन और कार्यात्मक प्रतियोगिता, या चिकित्सा विज्ञान के लिए के लिए मिलान पेप्टाइड एंटीबॉडी परिसरों के क्रिस्टल फार्म का उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

प्रतिरक्षा प्रणाली में, वी, डी, और जम्मू क्षेत्रों के पुनर्संयोजन एंटीबॉडी विभिन्न एंटीजन के लिए बाध्य रोगजनक संक्रमण से मेजबान की रक्षा के लिए पूरकता का निर्धारण क्षेत्रों (सीडीआर) की जबरदस्त रूपों बनाने के लिए अनुमति देता है। एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के उदासीन रक्षा एंटीबॉडी के सीडीआर और एंटीजन की epitopes के बीच स्थानिक पूरकता पर निर्भर करता है। इसलिए, इस आणविक बातचीत की समझ के रोगनिरोधी वैक्सीन डिजाइन और चिकित्सीय पेप्टाइड दवा के विकास में मदद करेंगे। हालांकि, इस निराकरण बातचीत दोनों एक ही प्रतिजन से कई प्रतिजनी डोमेन और एंटीबॉडी के कई सीडीआर, जिसके फलस्वरूप मिलान निर्धारण प्रक्रिया को और अधिक जटिल बनाने से प्रभावित किया जा सकता है। सौभाग्य से, हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी के विकास, जो मायलोमा कोशिकाओं के साथ अलग-अलग एंटीबॉडी उत्पादक कोशिकाओं फ़्यूज़, सेकंड के लिए कोशिकाओं का एक लगातार विभाजित बैच के लिए अनुमति देता हैजाल एक विशिष्ट एंटीबॉडी, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के रूप में जाना जाता है 1। हाइब्रिडोमा कोशिकाओं को एक विशिष्ट प्रतिजन का एक भी प्रतिजनी डोमेन के लिए बाध्य करने के लिए इन शुद्ध, उच्च आत्मीयता MABS का उत्पादन। प्रतिजन प्रतिरक्षी की स्थापना की, पेप्टाइड स्कैनिंग सहित कई दृष्टिकोण के संबंध के साथ, एक प्रतिजन अपनी इसी एमएबी का उपयोग करने का मिलान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिंथेटिक पेप्टाइड प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के घटनाक्रम पेप्टाइड स्कैनिंग तकनीक को और अधिक सुलभ और अधिक प्रदर्शन करने के लिए सुविधाजनक बना दिया है। संक्षेप में, ओवरलैपिंग सिंथेटिक पेप्टाइड्स का एक सेट के लक्ष्य प्रतिजन अनुक्रम के अनुसार उत्पादन कर रहे हैं और एमएबी संकरण के लिए एक ठोस समर्थित झिल्ली से जुड़े हुए हैं। पेप्टाइड स्कैनिंग न केवल एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षेत्र नक्शा करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है, लेकिन यह भी अवशेषों स्कैनिंग या प्रतिस्थापन के माध्यम से अमीनो एसिड (एए) mutagenesis की सुविधा मिलान पेप्टाइड का प्रत्येक हूँ अवशेषों और एंटीबॉडी की सीडीआर के बीच बाध्यकारी बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए।

2, 3, 4 का उपयोग कर के रैखिक मिलान के कुशल पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल एमएबी तैयारी, निर्माण और क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति, सिंथेटिक ओवरलैपिंग पेप्टाइड डिजाइन, डॉट-धब्बा संकरण, alanine स्कैनिंग, और प्रतिस्थापन म्युटाजेनेसिस भी शामिल है। पेप्टाइड संश्लेषण की उच्च लागत को देखते हुए, क्रमानुसार एक वांछित लक्ष्य प्रोटीन की पुनः संयोजक प्रोटीन को काटे के कदम संशोधित किया गया था, और प्रतिजनी क्षेत्र के आसपास 100 से 200 हूँ अवशेषों के लिए नीचे संकुचित था इससे पहले कि सिंथेटिक पेप्टाइड सरणी डॉट धब्बा विश्लेषण किया गया था।

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Protocol

1. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तैयारी

  1. संस्कृति आरजी M56 माउस मोनोक्लोनल हाइब्रिडोमा के साथ 5% सीओ 2 के पूरक 37 डिग्री सेल्सियस पर 175T बोतल में सीरम मुक्त माध्यम में कोशिकाओं 2। सतह पर तैरनेवाला लीजिए जब मध्यम के रंग ऊष्मायन के पांच दिनों के बाद पीले रंग बदल जाता है।
    नोट: हाइब्रिडोमा कोशिकाओं सीरम मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत भ्रूण गोजातीय सीरम से एंटीबॉडी संक्रमण से बचने के लिए गए थे।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 4500 XG पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र और सेल मलबे गोली त्यागें।
  3. प्रोटीन जी agarose (एक 50% घोल के रूप में आपूर्ति) के 2 एमएल 5 एमएल स्तंभ में जोड़ें और ठंडा पीबीएस के 10 राल संस्करणों (10 एमएल) के साथ संतुलित करना।
  4. लोड 200 एंटीबॉडी सतह पर तैरनेवाला के एमएल (1.2 चरण) स्तंभ पर और पास के माध्यम से त्यागें।
  5. ठंडा पीबीएस के 10 एमएल स्तंभ में जोड़े इसे धोने के लिए। दो बार दोहराएँ।
  6. 50 मिमी ग्लाइसिन, पीएच 2.7 के 10 एमएल स्तंभ में जोड़े प्रोटीन जी जुड़े एंटीबॉडी elute करने के लिए। कर्नलlect 10x निराकरण बफर के 100 μL (1 एम Tris, 1.5 एम NaCl, और 1 मिमी EDTA, 8.0 पीएच) युक्त एक microcentrifuge ट्यूब में 900 μL अंशों।
  7. -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.03% NaN 3 के साथ 50% ग्लिसरॉल में शुद्ध एंटीबॉडी स्टोर।

2. निर्माण और क्रमानुसार छोटा कर दिया संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति

  1. (10x Pfu बफर के 5 μL, प्रत्येक dNTP 0.2 मिमी, 0.2 माइक्रोन आगे प्राइमर 3, 0.2 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर 3, 2 मिमी MgSO 4, pET20b-1A59 3 प्लास्मिड डीएनए की 1 एनजी, और 2.5 यू: एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें इकाई) Pfu डीएनए पोलीमरेज़ की; 50 μL के अंतिम मात्रा को DDH 2 हे जोड़ें।
    1. एक स्वत: थर्मल cycler में चलाने के नमूने निम्न मापदंडों का उपयोग: साइकिल 1 (5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस); चक्र 2-36 (30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 63 डिग्री सेल्सियस, और 60 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); और चक्र 37 (7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस)।
  2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के बाद प्रतिबंध एंजाइम पाचन की सुविधा के लिए एक पीसीआर शुद्धि किट 5 का उपयोग करके उत्पादों निकालें।
  3. Nde मैं और Xho मैं प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पीसीआर प्रवर्धित डीएनए टुकड़े को पचाने और Nde मैं और Xho मैं एंजाइम से चिपके रहते पीईटी-20B (+) वेक्टर में इन डीएनए टुकड़े के प्रत्येक ligate। कोलाई डीएच-5α सक्षम कोशिकाओं 6 में निर्माणों रूपांतरण।
    1. पाचन बफर में पाचन मिश्रण तैयार (20 मिमी Tris-एसीटेट, 10 मिमी मिलीग्राम (सीएच 3 सीओओ) 2, 50 मिमी KCH 3 सीओओ, और 1 मिमी डीटीटी, पीएच 7.9) के साथ 1 पीसीआर प्रवर्धित डीएनए या पीईटी-20B के माइक्रोग्राम Nde मैं और Xho मैं प्रतिबंध के (+) वेक्टर डीएनए, और 2 यू 20 μL के अंतिम मात्रा में एंजाइमों।
    2. धीरे पाचन मिश्रण मिलाएं और जल्दी से नीचे स्पिन। एक सूखी स्नान में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं सुनिश्चित करने के लिए प्रतिबंध की पूरी काटने बैठतेतों।
    3. एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर 5 निम्नलिखित प्लाज्मिड निर्माण की सुविधा के लिए प्रतिबंध एंजाइम पचा डीएनए टुकड़े निकालें।
    4. बंधाव बफर में बंधाव मिश्रण तैयार (66 मिमी Tris, 5 मिमी MgCl 2, 1 मिमी एटीपी, और 5 मिमी डीटीटी, पीएच 7.5) predigested, पीसीआर प्रवर्धित डीएनए के 100 एनजी, predigested पीईटी-20B के 10 एनजी के साथ (+) वेक्टर डीएनए, और 10 μL के अंतिम मात्रा में 5 टी -4 के यू डीएनए ligase।
    5. धीरे बंधाव मिश्रण मिलाएं और जल्दी से नीचे स्पिन। एक पानी के स्नान में 18 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    6. डीएच-5α सक्षम कोशिकाओं के 100 μL में बंधाव नमूने के 10 μL रखो और 30 मिनट के लिए बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब रखने से पहले धीरे मिश्रण। Microcentrifuge ट्यूब गर्मी झटका 7 प्रेरित करने के लिए 90 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी स्नान में डाल दिया। इसके तत्काल बाद 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब हस्तांतरण।
    7. Luria-Bertani (पौंड) शोरबा (1% Bacto tryptone के 900 μL, 0.5% Bacto खमीर extrac जोड़ेटी, और 0.5% सोडियम क्लोराइड, 7.0 पीएच) ट्यूब के लिए। 150 rpm पर 45 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पर 10 मिनट के लिए 4000 x जी centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    8. लेग शोरबा के 50 μL के साथ गोली Resuspend और पूर्व गर्म पौंड 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेटों पर प्रत्येक परिवर्तन फैल गया। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    9. एक 200 μL टिप का उपयोग कर एक भी कॉलोनी उठाओ और 3 एमएल लेग की एक शिथिल छाया हुआ 15 एमएल ट्यूब में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त शोरबा में जगह। 150 आरपीएम 12 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    10. प्रत्येक संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए 8 निकालें और T7 प्रमोटर और T7 टर्मिनेटर प्राइमरों का उपयोग अनुक्रम 9 पुष्टि करने के लिए यह क्रम।
  4. अनुक्रम पुष्टि के बाद, इन पीईटी-20b से डीएनए के 10 एनजी (+) ई कोलाई का बीएल 21 (DE3) तनाव में हमारे द्वारा YGNNV कोट प्रोटीन जीन की लंबाई बदलती के साथ plasmids बदलनागर्मी के झटके विधि 7 हैैं। चरणों का पालन करें 2.3.6-2.3.8 परिवर्तन करने के लिए।
  5. 3 एमएल लेग की एक शिथिल छाया हुआ 15 एमएल ट्यूब में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त शोरबा में प्रत्येक तब्दील ई कोलाई बीएल 21 सेल से एक भी कॉलोनी स्थानांतरण। 150 आरपीएम झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं।
  6. 25 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति शांत जब संस्कृति के आयुध डिपो के 600 के बारे में 0.6 है और पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए 0.4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़ें। 200 आरपीएम झटकों के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए संस्कृति सेते हैं।
  7. एक microcentrifuge ट्यूब में संस्कृति के 1 एमएल स्थानांतरण। 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  8. ऊपर pipetting द्वारा और एक micropipette के साथ नीचे विकृतीकरण बफर के 100 μL (8 एम यूरिया, 20 मिमी सोडियम फास्फेट, और 0.5 एम NaCl, 7.4 पीएच) में सेल गोली Resuspend। जोरदार vortexing द्वारा मिक्स।
    नोट: नमूना पसंस्थानों अब, अर्द्ध पारदर्शी थोड़ा चिपचिपा, और डॉट धब्बा संकरण परख के लिए तैयार हो जाना चाहिए।

3. डिजाइन और अतिव्यापी पेप्टाइड्स के संश्लेषण

  1. डिजाइन और 3 सीरियल 20-मेर पेप्टाइड्स कि प्रत्येक YGNNV कोट प्रोटीन की 195-338 हूँ क्षेत्र से 10 हूँ अवशेषों से अपने उत्तराधिकारी डॉट सोख्ता द्वारा आरजी M56 एमएबी का मिलान क्षेत्र को सटीक बनाने के साथ ओवरलैप synthesize।
  2. डिजाइन और synthesize 3 तीन 8 मेर पेप्टाइड्स (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, और 199 VLCRWSVR 206) अगले सिंथेटिक पेप्टाइड पर 6 हूँ अवशेषों की एक ओवरलैप के साथ डॉट सोख्ता द्वारा 195-206 हूँ के मिलान क्षेत्र नीचे संकीर्ण।
  3. डिजाइन और synthesize 3 से 7 मेर (196 NVSVLCR 202 और 195 VNVSVLC 201), 6-मेर (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, और 197 VSVLCR 202), और 5-मेर पेप्टाइड्स (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, और 198 SVLCR 202) 6, 5 की एक ओवरलैप, और 4 हूँ अवशेष, क्रमशः, के साथ उनके पड़ोसी पेप्टाइड्स को कम करने पर डॉट सोख्ता द्वारा मिलान क्षेत्र।

4. डॉट धब्बा संकरण

  1. 10 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में प्रत्येक संश्लेषित पेप्टाइड भंग।
    नोट: सिंथेटिक पेप्टाइड्स की विभिन्न घुलनशीलता पर काबू पाने के लिए, सभी सिंथेटिक पेप्टाइड्स DMSO में भंग कर दिया जाना चाहिए। DMSO एक अच्छा विलायक पूरी तरह से हाइड्रोफोबिक या हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड्स भंग करने के लिए है।
  2. 2 मिनट के लिए मेथनॉल के साथ polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली लेना।
    नोट: PVDF झिल्ली 100% DMSO के लिए प्रतिरोधी पर निर्भर है; दूसरों को तो नहीं हो सकता।
  3. संशोधित Towbin बफर (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, और 0.1% एसडीएस, पीएच 8.3) के लिए साथ PVDF झिल्ली संतुलित करना2 मिनट।
    नोट: 10-20% (वी / वी) मेथनॉल के हस्तांतरण के परिणामों में सुधार करने के लिए संशोधित Towbin बफर करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
  4. संशोधित Towbin बफर के साथ क्रोमैटोग्राफी कागज का एक टुकड़ा कुल्ला। क्रोमैटोग्राफी कागज पर PVDF झिल्ली रखें। रुको जब तक संशोधित Towbin बफर अगले कदम के लिए जारी रखने से पहले PVDF झिल्ली सतह से गायब हो गया है।
  5. एक 10 μL टिप के साथ झिल्ली के लिए प्रत्येक पेप्टाइड नमूना के 2 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए क्रोमैटोग्राफी कागज पर PVDF झिल्ली हवा शुष्क। झिल्ली पर और धीरे धीरे धीरे प्रत्येक पेप्टाइड नमूना जोड़े बहुत ज्यादा प्रसार से बचने के लिए।
  6. कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 5% नोनफेट दूध के साथ TBST बफर में झिल्ली (0.05% (वी / वी) बीच -20, 20 मिमी Tris, और 150 मिमी NaCl, 7.4 पीएच) ब्लॉक।
  7. झिल्ली को 5% नोनफेट दूध के साथ TBST बफर में 1,000: आरजी M56 एमएबी एक अंतिम 1 के कमजोर पड़ने पर जोड़ें। कोमल झटकों के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सेते हैं।
  8. एंटीबॉडी इसलिए हटायेlution। कोमल झटकों के साथ 5 मिनट के लिए TBST बफर में झिल्ली धो लें। दो बार दोहराएँ।
  9. झिल्ली को 5% नोनफेट दूध के साथ TBST बफर में 5000: एक अंतिम 1 के कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी माउस आईजीजी, एफसी, संयुग्मित alkaline फॉस्फेट) जोड़ें। कोमल झटकों के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सेते हैं।
  10. एंटीबॉडी समाधान त्यागें। कोमल झटकों के साथ 5 मिनट के लिए TBST बफर में झिल्ली धो लें। धोने कदम दो बार दोहराएँ।
  11. अंधेरे में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर BCIP / एनबीटी सब्सट्रेट समाधान के साथ झिल्ली का विकास करना। जब संकेत दिखाई देता है DDH 2 हे के साथ झिल्ली धोने से विकासशील बंद करो।
  12. झिल्ली हवा शुष्क और एक छवि प्रणाली का उपयोग डॉट धब्बा छवि पर कब्जा।
  13. प्रत्येक डॉट धब्बा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 की तीव्रता को मापने।

5. Alanine स्कैनिंग और प्रतिस्थापन

  1. डिजाइन और 3 alanine और मेथी synthesizeonine प्रतिस्थापन पेप्टाइड्स। 8-मेर पेप्टाइड 195 VNVSVLCR 202 के लिए alanine के साथ प्रत्येक हूँ अवशेषों बदलें और synthesize पेप्टाइड्स 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, और 195 VNVSVLCA 202 । SJNNV जीनोटाइप मिलान पेप्टाइड 195 VNVSVMCR 202 बनाने के लिए methionine को हूँ अवशेषों leucine 200 बदलें।
  2. alanine स्कैनिंग और प्रतिस्थापन म्युटाजेनेसिस सोख्ता डॉट प्रदर्शन करने के लिए धारा 4 का पालन करें।

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Representative Results

इस प्रयोग के लक्ष्य एमएबी का उपयोग कर सोख्ता डॉट के माध्यम से एक मिलान की पहचान करने के लिए किया गया था। तेजी से और कुशलता से नीचे प्रतिजनी क्षेत्र एमएबी द्वारा मान्यता प्राप्त संकीर्ण करने के लिए, पूर्ण लंबाई और सी टर्मिनस पर एक 6xHis संलयन टैग के साथ क्रमानुसार छोटा YGNNV पुनः संयोजक प्रोटीन कोट एक ई कोलाई पीईटी अभिव्यक्ति प्रणाली 10 (चित्रा 1 ए) से व्यक्त किया गया। जिसके परिणामस्वरूप पुनः संयोजक प्रोटीन डॉट धब्बा संकरण के लिए आरजी M56 एमएबी और विरोधी 6xHis एंटीबॉडी का उपयोग PVDF झिल्ली पर देखा गया था। डॉट सोख्ता 1-338 हूँ (पूर्ण लंबाई), 51-338 हूँ, और 195-338 हूँ, लेकिन नहीं 1-100 1-200 हूँ या हूँ पुनः संयोजक प्रोटीन (चित्रा 1 बी) के खिलाफ सकारात्मक संकेतों का पता चला। डॉट सरणी विरोधी 6xHis एंटीबॉडी के खिलाफ संकरित और सभी पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि की। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि आरजी M56 एमएबी मान्यता का मिलान एक 144-हूँ पुनः संयोजक प्रोटीन Nea में स्थित हैआर YGNNV सी टर्मिनस के कोट प्रोटीन (195-338 हूँ)।

इसके बाद, 10 हूँ-अवशेषों के लंबे साथ धारावाहिक 20-मेर पेप्टाइड्स overlaps पर अपने पड़ोसी बनाया गया है और मिलान क्षेत्र को सटीक बनाने के पेप्टाइड स्कैनिंग के लिए 144 हूँ पुनः संयोजक प्रोटीन के अनुक्रम से संश्लेषित कर रहे थे। ये सिंथेटिक पेप्टाइड्स एक PVDF झिल्ली पर देखा और आरजी M56 एमएबी का उपयोग कर डॉट धब्बा संकरण के अधीन थे। परिणाम केवल पेप्टाइड 195-214 हूँ और सकारात्मक नियंत्रण, 195-338 हूँ पुनः संयोजक प्रोटीन (2A चित्रा) पर सकारात्मक संकेतों से पता चला है। हूँ अवशेषों 195-206 (पेप्टाइड्स 195-202 हूँ से ओवरलैप करते हैं, के रूप में मिलान पेप्टाइड 195-214 हूँ क्षेत्र नहीं बल्कि पेप्टाइड 205-224 हूँ क्षेत्र, 6 हूँ अवशेषों के साथ तीन धारावाहिक 8-मेर पेप्टाइड्स के भीतर स्थित है 197- 204 हूँ, और 199-206 हूँ) बनाया गया है और संश्लेषित थे। डॉट धब्बा संकरण परिणामों का उपयोग पेप्टाइड 195-202 हूँ और सकारात्मक नियंत्रण पेप्टाइड 195-214 हूँ पर सकारात्मक संकेतों से पता चलाआरजी M56 एमएबी (चित्रा 2 बी)।

Alanine स्कैनिंग और प्रतिस्थापन म्युटाजेनेसिस 195 VNVSVLCR 202 8-मेर मिलान के प्रत्येक हूँ छाछ, की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया। 8-मेर पेप्टाइड के प्रत्येक हूँ अवशेषों को व्यक्तिगत रूप से alanine के साथ बदल दिया गया था। alanine उत्परिवर्तन पेप्टाइड सरणी तो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पेप्टाइड 195-202 हूँ उपयोग कर एक PVDF झिल्ली पर रखा गया था। डॉट धब्बा विश्लेषण से संकेत दिया है कि तीन की जगह म्यूटेशन, V197A, V199A, और C201A, आरजी M56 एमएबी (चित्रा 3 ए) के बंधन आत्मीयता समाप्त कर दिया। हालांकि SJNNV जीनोटाइप मिलान में हूँ अवशेषों 200 methionine है, के रूप में अन्य चार Betanodavirus जीनोटाइप epitopes में एक leucine करने का विरोध किया, SJNNV जीनोटाइप अनुक्रम, 195 VNVSVMCR 202, आरजी M56 एमएबी के खिलाफ सकारात्मक बंधन आत्मीयता से पता चला सकारात्मक नियंत्रण की तरह (चित्रा 3 ए)। इस परिणाम का संकेत है कि epitopes ओF सब Betanodavirus जीनोटाइप आरजी M56 एमएबी द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक हूँ मिलान साइट के लिए भाग लेने के अवशेषों के बंधन आत्मीयता आगे प्रत्येक alanine प्रतिस्थापन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 3 बी) का उपयोग करने का डॉट धब्बा का संकेत तीव्रता को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था। V197A, V199A, और C201A प्रतिस्थापन की तीव्रता 10.2%, 18.6%, और 8.5%, कम हो गई थी क्रमशः, कब, सकारात्मक नियंत्रण (100%) की तुलना में उन लोगों के साथ V195A जबकि, S198A, L200A, R202A, और L200M प्रतिस्थापन सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उच्च या इसी तरह की तीव्रता से पता चला है। ऐसा नहीं है कि N196A प्रतिस्थापन की शक्ति को प्रभावित करने अस्पष्ट है, सकारात्मक नियंत्रण में 37.4% की कमी के साथ ध्यान देने योग्य है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि V197, V199, और C201 आरजी M56 एमएबी की बाइंडिंग के लिए आवश्यक अवशेष हैं।

alanine स्कैनिंग म्युटाजेनेसिस परिणाम बताते हैं कि हूँ अवशेषों V195, N196, और R202 कर सकते हैंalanine, जिसका मतलब यह है कि मिलान क्षेत्र आगे दोनों Termini पर नीचे संकुचित किया जा सकता है के साथ प्रतिस्थापित किया। इसलिए, कदम-दर-कदम 7-मेर, 6-मेर, और 5-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड्स कदम के माध्यम से पेप्टाइड मानचित्रण छंटनी की प्रतिजनी क्षेत्र को कम से कम करने के लिए डिजाइन किया गया था। सकारात्मक संकेत 6-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड 196 NVSVLC 201 पर मौजूद था, लेकिन 7-मेर और 5-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड्स पर नहीं (चित्रा 4)। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि NNV कोट प्रोटीन आरजी M56 एमएबी द्वारा मान्यता प्राप्त की न्यूनतम मिलान 6-मेर पेप्टाइड, 196 NVSVLC 201 है।

आकृति 1
चित्रा 1: क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग मिलान क्षेत्र की कमी। (ए) क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक NNVCPs के मानचित्र। NNVCP 1-338 हूँ पूर्ण लंबाई कोट प्रोटीन होता है। (बी) डॉट bloपुनः संयोजक NNVCPs की टी विश्लेषण। वाम: PVDF झिल्ली पर क्रमानुसार छोटा YGNNV पुनः संयोजक प्रोटीन कोट के मानचित्र। मध्य: डॉट धब्बा विश्लेषण विरोधी 6xHis एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। अधिकार: डॉट धब्बा विश्लेषण आरजी M56 एमएबी उपयोग किया गया था। NNVCP: नर्वस नेक्रोसिस वायरस कोट प्रोटीन; हूँ: अमीनो एसिड; PVDF: polyvinylidene फ्लोराइड; N: एन टर्मिनस; C: सी टर्मिनस; एमएबी: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सिंथेटिक पेप्टाइड्स का उपयोग कर मिलान क्षेत्र के ललित मानचित्रण। (ए) वाम: 20-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड्स के एमिनो एसिड दृश्यों NNVCP 195-338 हूँ करने के लिए गठबंधन किया गया; प्रत्येक पूर्ववर्ती पेप्टाइड निम्नलिखित पेप्टाइड के साथ एक 10 हूँ-अवशेषों के लंबे ओवरलैप था। अधिकार: एस के मानचित्रPVDF झिल्ली पर ynthetic पेप्टाइड्स। संयोजक NNVCP 195-338 हूँ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। डॉट धब्बा विश्लेषण आरजी M56 एमएबी उपयोग किया गया था। (बी) वाम: 8-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड्स, 195-202 हूँ, 197-204 हूँ, और 199-206 हूँ की एमिनो एसिड दृश्यों; प्रत्येक पूर्ववर्ती पेप्टाइड निम्नलिखित पेप्टाइड के साथ एक 6 हूँ-अवशेषों के लंबे ओवरलैप था। सिंथेटिक पेप्टाइड 195-214 हूँ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। अधिकार: डॉट धब्बा विश्लेषण आरजी M56 एमएबी उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: 195 VNVSVLCR 202 मिलान के Alanine स्कैनिंग और प्रतिस्थापन म्युटाजेनेसिस। प्रतिस्थापन mutagenesis और डॉट धब्बा विश्लेषण के (ए) एमिनो एसिड दृश्यों। प्रत्येक हूँ rमिलान क्षेत्र, 195-202 हूँ की esidue, alanine साथ व्यक्तिगत रूप से बदल दिया गया था। L200M प्रतिस्थापन Betanodavirus कोट प्रोटीन मिलान क्षेत्र में SJNNV जीनोटाइप अनुक्रम है। सिंथेटिक पेप्टाइड 195-202 हूँ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्रतिस्थापित हूँ अवशेषों रेखांकित कर रहे हैं। (बी) डॉट धब्बा संकेत बंधन आत्मीयता की मात्रा। सकारात्मक नियंत्रण (195-202 हूँ) का संकेत तीव्रता 100% के रूप में निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: न्यूनतम मिलान दृढ़ संकल्प। 7-मेर (ए), 6-मेर (बी), और 5-मेर (सी) सिंथेटिक पेप्टाइड्स 195-202 हूँ से न्यूनतम मिलान आरजी M56 एमएबी द्वारा मान्यता प्राप्त की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया। सिंथेटिक peptiडी 195-202 हूँ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक एमएबी स्तर पर मान्यता प्राप्त रैखिक मिलान की पहचान करने के लिए एक तेजी से और सरल तकनीक प्रदान करता है। ध्यान में पेप्टाइड संश्लेषण और synthesizing पेप्टाइड्स की उत्पादन क्षमता की लागत ले रहा है, वायरस कोट प्रोटीन की प्रतिजनी क्षेत्र पेप्टाइड स्कैनिंग विश्लेषण से पहले क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त की कमी थी। जैसे, विश्वसनीय और कुशल ई कोलाई पीईटी अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में 50 के लिए 10 के बीच आणविक वजन के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन केडीए आसानी से इस प्रणाली के माध्यम से व्यक्त किया जा सकता है, इन क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस रास्ते में, मिलान आसानी से एक अधिक प्रबंधनीय 100 करने के लिए 200 से हूँ क्षेत्र के लिए नीचे संकुचित किया जा सकता है। पीईटी-20B (+) वेक्टर विशेष रूप से, चुना गया था के रूप में यह एक दृश्य है कि 6xHis-टैग की अभिव्यक्ति, उत्पादन 6xHis टैग संलयन प्रोटीन की इजाजत देने के लिए कोड की अभिव्यक्ति की पुष्टि के लिए एक विरोधी 6xHis एंटीबॉडी का उपयोग immunodetected जा करने के लिए होता है पुनः संयोजक पीroteins। उत्पादन पुनः संयोजक प्रोटीन कोट तो थे एक डॉट धब्बा संकरण परख के माध्यम से आरजी M56 एमएबी का उपयोग विश्लेषण। पुनः संयोजक प्रोटीन मिलान दृढ़ संकल्प का एक वैकल्पिक तरीका, स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी 10 के माध्यम से व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन को शुद्ध एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन को अलग, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण 3 प्रदर्शन है।

आगे और अधिक पतले मिलान स्थान क्रमानुसार छोटा पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग डॉट धब्बा संकरण विश्लेषण के परिणामों के द्वारा निर्धारित मैप करने के लिए, विभिन्न आकारों के साथ अतिव्यापी सिंथेटिक पेप्टाइड्स डिजाइन किए गए थे। सिंथेटिक पेप्टाइड के विभिन्न संभव लंबाई के संश्लेषण के लिए बीच में, पर्याप्त (लगभग 90% से कम) और उनके पेप्टाइड लंबाई के लिए 10 हूँ-अवशेषों के लंबे ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स पेप्टाइड स्कैनिंग में पहले चुना गया था के साथ 20-mer, दोनों अपने उच्च संश्लेषण शुद्धता के लिए सतत ई के लिए खोज के लिएpitope बी सेल एंटीबॉडी 11 से मान्यता प्राप्त है। ध्यान दें कि सटीकता और संश्लेषित पेप्टाइड्स की पवित्रता को खराब रूप में संश्लेषित पेप्टाइड रह गया है। इस रास्ते में, मिलान क्षेत्र में तेजी से लंबाई में लगभग 10 हूँ अवशेषों कम हो गया था। बाद सीरियल 8-मेर ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स सर्वेक्षण किया गया, रैखिक मिलान क्षेत्र 195-202 हूँ पेप्टाइड परिभाषित किया गया था। बाद में, इस 8-मेर मिलान पेप्टाइड का alanine स्कैनिंग, प्रत्येक हूँ अवशेषों के महत्वपूर्ण बंधन संबंध ताकत का पता चलता है, कम से कम मिलान के लिए खोज की इजाजत दी। V197, V199, और C201 हूँ अवशेषों की आवश्यक भूमिकाओं का तात्पर्य रेखीय मिलान क्षेत्र पूरी तरह से बाध्यकारी खोने के बिना शामिल किया गया है कि कम से कम 5 हूँ अवशेषों 197 से 201 इसके अलावा, हूँ अवशेषों V195, N196, और R202 alanine के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, आत्मीयता, यह दर्शाता है कि मिलान क्षेत्र 7, 6, या यहां तक ​​कि 5 हूँ लंबाई में अवशेषों को कम किया जा सकता है। छोटे पेप्टाइड दृश्यों को आसानी से और आर्थिक रूप से (रैखिक की खोज के लिए सह संश्लेषित किया जा सकताntinuous) epitopes। हालांकि, इस सिंथेटिक पेप्टाइड स्कैनिंग तकनीक नहीं एक एंटीबॉडी का एक असंतत मिलान के निर्धारण के लिए उपयुक्त है, जब तक कि यह मिलान छांटना के साथ संयुक्त है और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण 12 है।

इस प्रोटोकॉल में, एक डॉट धब्बा संकरण तकनीक एक एमएबी के रैखिक मिलान खोज करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। डॉट धब्बा संकरण एक सरल लेकिन प्रभावी तरीका है। खोज, जब मिलान क्षेत्र के एक बड़े पैमाने परिदृश्य से नीचे संकुचित है की शुरुआत में, मुख्य चिंता का विषय है, एक लक्ष्य झिल्ली बाध्य प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के संकरण के बाद या तो एक सकारात्मक या नकारात्मक संकेत निरीक्षण करने के लिए है सबसे MABS के रूप में केवल एक प्रतिजनी प्रोटीन की एक विशिष्ट मिलान (आंकड़े 1 और 2) करने के लिए बाध्य। हालांकि, जब डॉट धब्बा संकरण का उपयोग कर एंटीबॉडी के खिलाफ मिलान क्षेत्र के भीतर प्रत्येक हूँ अवशेषों के बंधन उपलब्धता का पता लगाने के लिए इस तरह के alanine प्रतिस्थापन mutagenesis के द्वारा के रूप में,डॉट सोख्ता द्वारा निर्धारित प्रत्येक प्रतिस्थापित हूँ अवशेषों के संकेत तीव्रता समग्र बाध्यकारी महत्व में सकारात्मक असर होना चाहिए। यही कारण है कि संकेत तीव्रता छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 3 बी) या एक densitometer का उपयोग कर आसानी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक एंजाइम से जुड़ी इम्युनो-Sorbent परख (एलिसा) आत्मीयता के बंधन की डिग्री है और जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल की शक्ति 3 यों करने के लिए किया जा सकता है।

पिछले एक अध्ययन में, गैर लिफाफा नर्वस नेक्रोसिस वायरस का एकमात्र कोट प्रोटीन था इम्युनो-मान्यता प्राप्त करने के लिए 4.5 6.5 के बीच एक उच्च निराकरण सूचकांक मूल्य के साथ 10 MABS द्वारा (प्रवेश 10 एनआई) 2। MABS के अति विशिष्ट मान्यता क्षमता आगे NNV संक्रमित मछली 13 का पता लगाने के लिए एक कदम है, तीव्र इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक निदान किट के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया। नर्वस नेक्रोसिस वायरस कोट प्रोटीन की प्रतिजनी मिलान आरजी M18 द्वारा मान्यता दी गई थीएमएबी एक 8 मेर पेप्टाइड, 195 VNVSVLCR 202 3, जिसके माध्यम से एक उपन्यास NNV रिसेप्टर (अप्रकाशित डेटा) की पहचान की थी। वर्तमान अध्ययन में, तंत्रिका नेक्रोसिस वायरस कोट प्रोटीन का मिलान आगे एक 6-मेर पेप्टाइड के लिए नीचे संकुचित किया गया था, 196 NVSVLC 201, अन्य एमएबी, आरजी M56 के द्वारा।

यह अप्रत्याशित है कि दो 7 मेर पेप्टाइड्स (196 NVSVLCR 202 और 195 VNVSVLC 201) युक्त 6-मेर पेप्टाइड 196 NVSVLC 201 आरजी M56 एमएबी (चित्रा 4 ए) द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं कर रहे हैं। एक उचित व्याख्या यह है कि, हालांकि आसपास के अवशेषों V195 और R202 सीधे मिलान और एंटीबॉडी के बीच बाध्यकारी बातचीत के लिए योगदान नहीं कर सकते हैं, flanking अवशेषों एंटीबॉडी मान्यता के लिए सही पेप्टाइड रचना के गठन को प्रभावित है। उनकी flanking टर्मिनस पर V195 या R202 की उपस्थिति अकेले सिंथेटिक पेप्टाइड बिगड़ना सकता हैएंटीबॉडी मान्यता और बाइंडिंग के लिए रचना। मिलान रचना, 195, दोनों Termini, V195 और R202, जो 8-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड में एक दूसरे के खिलाफ संतुलित कर रहे हैं की ताकत से प्रेरित है VNVSVLCR 202 और NVSVLC 201 6-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड में counteracted, 196। हूँ अवशेष, V195, N196, और R202, व्यक्तिगत रूप से पूरी तरह से खोने बाध्यकारी क्षमता के बिना alanine के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और इस प्रकार, alanine स्कैनिंग म्युटाजेनेसिस परिणामों से संकेत मिलता है कि इन तीन हूँ अवशेषों मान्यता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है और न आरजी के बंधन -M56 एमएबी। हालांकि, 6-मेर सिंथेटिक पेप्टाइड से एक और अवशेषों trimming के बाद, 196 NVSVLC 201, 5-मेर पेप्टाइड, 197 VSVLC 201, एन टर्मिनल flanking क्षेत्र में N196 के बिना, क्षमता मान्यता प्राप्त है और बाध्य होने के लिए आरजी द्वारा खो देता है -M56 एमएबी (चित्रा 4C)। यह परिणाम पता चलता है कि N196 छाछ भी हो सकता है पीआदेश मान्यता और आरजी M56 एमएबी के बंधन की सुविधा के लिए सही मिलान रचना को स्थिर करने के लिए मिलान के flanking क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका करना। मिलान क्षेत्र के आसपास के flanking अवशेषों का महत्व भी अन्य प्रतिजन प्रतिरक्षी बाध्यकारी अध्ययनों से पता लगाया गया था। हूँ एंटीबॉडी की बाइंडिंग के लिए α-bungarotoxin मिलान क्षेत्र के आसपास के अवशेषों flanking का महत्व ही कोलीनर्जिक सबसाइट के भीतर विभिन्न हूँ प्रतिस्थापन का उपयोग कर जांच की गई। वे तो या तो आवश्यक प्रभावशाली, या प्रभावशाली नहीं 14 के रूप में मूल्यांकन किया गया। यह भी पाया गया कि कार्सिनोमा जुड़े उपकला mucins के एंटीबॉडी में मान्यता प्राप्त मिलान की विशिष्टता आगे flanking हूँ अवशेषों से प्रभावित किया जा सकता है। इन प्रभावों गठनात्मक बाधाओं कि एक मिलान करने के लिए 15 एक एंटीबॉडी के बंधन बाधित कर सकते हैं उपस्थित हो सकता है।

6-मेर मिलान, 196 NVSVLC 201 </ उप>, अत्यंत हाइड्रोफोबिक सुविधाओं है, दो valines (197 और 199), एक leucine (200), और एक सिस्टीन (201) (कम फार्म) सहित चार हाइड्रोफोबिक अवशेष, के साथ। के रूप में alanine स्कैनिंग mutagenesis द्वारा निर्धारित अवशेषों V197, V199, और C201, आरजी M56 एमएबी मान्यता और बाइंडिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं। मिलान क्षेत्र NNV कोट प्रोटीन 16 के खोल के डोमेन (ओं-डोमेन) के आठ विरोधी समानांतर β-किस्में में से एक में स्थित था। दिलचस्प है, मिलान के बाहर फलाव डोमेन पर प्रकट नहीं होता है, लेकिन अन्य विरोधी समानांतर β-किस्में के तहत एस-डोमेन की जेली रोल संरचना में छुपाता है। मिलान, इसकी उच्च hydrophobicity के साथ, इस अवसाद में एक अधिक स्थिर microenvironment प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, इस मिलान के 195 VNVSVLCR 202 3 पेप्टाइड ग्रूपर मस्तिष्क की कोशिकाओं में विशाल ग्रूपर नर्वस नेक्रोसिस वायरस के प्रसार में बाधा मिला था। इसलिए, इस मिलान पेप्टाइड एक सह होना करने के लिए सुझाव दिया गया थाmpetitor रिसेप्टर बाध्यकारी डोमेन वायरल प्रविष्टि 3 के लिए आवश्यक में शामिल किया गया। यह धारणा थी कि पेप्टाइड प्रविष्टि अवरोधकों हाइड्रोफोबिक और / या amphipathic अवशेषों जिसमें शारीरिक रचना और सेलुलर झिल्ली इंटरफेस के रसायन शास्त्र को बदल सकते हैं और सेलुलर और वायरल झिल्ली 17 के विलय बाधित कर सकते हैं। इसके अलावा, कई सिंथेटिक पेप्टाइड प्रविष्टि अवरोधकों विभिन्न वायरस के संक्रमण के 17, 18 के खिलाफ मजबूत निषेधात्मक गुण का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, हाइड्रोफोबिक अवशेषों और NNV संक्रमण के खिलाफ मजबूत प्रवेश निषेध के साथ पहचान मिलान पेप्टाइड चिकित्सीय पेप्टाइड दवाओं के विकास की सुविधा हो सकती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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References

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